真核轉(zhuǎn)染穩(wěn)定篩選標(biāo)記及原理

1、LOGO真核細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選標(biāo)記真核細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選標(biāo)記及原理及原理 小組：周四班二組小組：周四班二組 組員：薛瑩超（報(bào)告者）組員：薛瑩超（報(bào)告者） 滕達(dá)滕達(dá) 曾欣宜曾欣宜 席杰席杰 賴惠英賴惠英 鄧宇星鄧宇星 外源基因表達(dá)的三個(gè)概念外源基因表達(dá)的三個(gè)概念 通過生化或者物理方法將目的基因?qū)胝婧思?xì)胞中 。分類分類 轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo) 通過病毒介導(dǎo)，用基因組中攜帶有克隆目的片斷的病毒來感染靶細(xì)胞。 轉(zhuǎn)化 通過生化或者物理方法將目的基因?qū)朐思?xì)胞中 。常用的真核表達(dá)系統(tǒng)常用的真核表達(dá)系統(tǒng)v酵母表達(dá)系統(tǒng)v絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)v昆蟲表達(dá)系統(tǒng)v哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 染染 方方 法法 理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染

2、效率高、細(xì)胞毒性小等特點(diǎn)。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率最高、細(xì)胞毒性很低，但準(zhǔn)備程序復(fù)雜，對(duì)細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性很難普及。非病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)中，以陽離子非脂性物質(zhì)為主的混合物配方轉(zhuǎn)染效率最高。該類轉(zhuǎn)染具有廣譜、細(xì)胞毒性小、性能穩(wěn)定等特點(diǎn)，且不受培養(yǎng)液中的血清和抗生素的干擾，比脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法更方便。轉(zhuǎn)染后的表達(dá)1.瞬時(shí)表達(dá) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，一部分轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄輸出mRNA進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。幾天內(nèi)大部分的質(zhì)粒都會(huì)被降解或傳代而稀釋。一周以后幾乎檢測(cè)不到。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒不整合到染色體上，出現(xiàn)短暫的（24-96h）高水平表達(dá)，依賴于質(zhì)粒純度、濃 度和轉(zhuǎn)染效率。2.穩(wěn)定表達(dá) 轉(zhuǎn)染的

3、質(zhì)粒DNA整合到染色體上可以持續(xù)存在，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以長(zhǎng)期表達(dá)。 整合的概率比較小，要獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株需要篩選標(biāo)記共同轉(zhuǎn)染，通過選擇壓力維持表達(dá)穩(wěn)定。需要長(zhǎng)時(shí)間的抗性選擇培養(yǎng)。酵母表達(dá)系統(tǒng)常用的選擇性標(biāo)記酵母表達(dá)系統(tǒng)常用的選擇性標(biāo)記v營(yíng)養(yǎng)缺陷性酵母 trp1-，ura3-，his3-，leu2-， lys2-。v顯性選擇標(biāo)記，用于野生型酵母菌的轉(zhuǎn)染。G418篩選。哺乳動(dòng)物細(xì)胞遺傳性標(biāo)記胸苷激酶基因（tk）選擇系統(tǒng)二氫葉酸還原酶基因（dhfr）選擇系統(tǒng)黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶基因（HGPRT）選擇系統(tǒng)新霉素抗性基因（neo）選擇系統(tǒng)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）選擇系統(tǒng)潮霉素抗性選擇系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞

4、內(nèi)DNA的合成途徑的合成途徑細(xì)胞的細(xì)胞的DNA合成有主要途徑和旁路途徑兩種方式合成有主要途徑和旁路途徑兩種方式1.主要途徑就是利用谷氨酰胺或單磷酸脲甘酸在二主要途徑就是利用谷氨酰胺或單磷酸脲甘酸在二氫葉酸還原酶的催化下合成氫葉酸還原酶的催化下合成DNA2.旁路途徑則是利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤旁路途徑則是利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶或胸腺嘧啶激酶（TK）的催化下補(bǔ)救合成）的催化下補(bǔ)救合成DNA。胸苷激酶基因選擇基因選擇系統(tǒng)系統(tǒng)v 遺傳標(biāo)記：遺傳標(biāo)記：TKv 編碼產(chǎn)物：編碼產(chǎn)物：胸苷激酶胸苷激酶v 篩選藥物：篩選藥物：HA

5、T選擇法選擇法 H：次黃嘌呤；補(bǔ)救合成核苷酸的原料：次黃嘌呤；補(bǔ)救合成核苷酸的原料 A：氨基喋呤；抑制四氫葉酸合成：氨基喋呤；抑制四氫葉酸合成 T：胸苷；補(bǔ)救合成：胸苷；補(bǔ)救合成dTTP的原料的原料v 作用機(jī)理：作用機(jī)理：TK是核苷酸補(bǔ)救合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵是核苷酸補(bǔ)救合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶酶二氫葉酸還原酶（DHFR）基因選擇系統(tǒng)v 遺傳標(biāo)記：遺傳標(biāo)記：DHFR：真核細(xì)胞生物合成核苷酸的關(guān)：真核細(xì)胞生物合成核苷酸的關(guān)鍵酶，功能是催化二氫葉酸還原成四氫葉酸鍵酶，功能是催化二氫葉酸還原成四氫葉酸v 編碼產(chǎn)物：編碼產(chǎn)物：二氫葉酸還原酶（二氫葉酸還原酶（DHFR）v 篩選藥物：篩選藥物：葉酸類似物葉酸類似

6、物氨基喋呤或氨甲喋呤氨基喋呤或氨甲喋呤v 作用機(jī)理：作用機(jī)理：dhfr缺陷型細(xì)胞缺陷型細(xì)胞因不能合成核酸而因不能合成核酸而死亡，而導(dǎo)入了外源基因的細(xì)胞成功存活，并且死亡，而導(dǎo)入了外源基因的細(xì)胞成功存活，并且在氨甲喋呤的選擇壓力下大量表達(dá)蛋白。在氨甲喋呤的選擇壓力下大量表達(dá)蛋白。黃嘌呤黃嘌呤-鳥嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）基因基因選擇系統(tǒng)選擇系統(tǒng)v 遺傳標(biāo)記：遺傳標(biāo)記：XGPRTv 編碼產(chǎn)物：編碼產(chǎn)物：黃嘌呤黃嘌呤-鳥嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶v 篩選藥物：篩選藥物：霉酚酸霉酚酸v 作用機(jī)理：作用機(jī)理：XGPRT合成合成GMP。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞無哺乳動(dòng)物細(xì)胞無

7、XGPRT酶，不能利用黃嘌呤形成黃嘌酶，不能利用黃嘌呤形成黃嘌呤磷酸（呤磷酸（XMP），但有鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（），但有鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），），可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤磷酸（可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤磷酸（IMP）。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可）。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可通過通過IMP生成生成GMP。當(dāng)用。當(dāng)用IMP脫氫酶抑制劑霉酚酸，抑制了脫氫酶抑制劑霉酚酸，抑制了GMP的合成，使細(xì)胞失去合成的合成，使細(xì)胞失去合成DNA能力而死亡。能力而死亡。 將含將含XGPRT基因的重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞后，能表達(dá)基因的重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞后，能表達(dá)XGPRT酶，可在含有黃嘌呤的培養(yǎng)基中通過酶，可在含有黃嘌呤的培養(yǎng)基中

8、通過XMP中間體補(bǔ)中間體補(bǔ)救合成救合成GMP，使，使DNA合成正常進(jìn)行合成正常進(jìn)行。加入霉酚酸后，陽性克加入霉酚酸后，陽性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而陰性細(xì)胞則受霉酚酸的抑隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而陰性細(xì)胞則受霉酚酸的抑制而死亡，以此來篩選陽性細(xì)胞。制而死亡，以此來篩選陽性細(xì)胞。新霉素抗性基因選擇系統(tǒng)v 遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記：APHv 編碼產(chǎn)物編碼產(chǎn)物：氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶：氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶v 篩選藥物篩選藥物：新霉素，：新霉素，即即G418一種氨基糖苷類抗生素，一種氨基糖苷類抗生素，影響影響80S核糖體功能核蛋白質(zhì)的合成核糖體功能核蛋白質(zhì)的合成v 作用機(jī)理作用機(jī)理：新霉素抗性基因編碼新霉素抗性基因編碼3磷酸轉(zhuǎn)移酶降解磷酸轉(zhuǎn)移酶降解G418。適用于所有的真核細(xì)胞適用于所有的真核細(xì)胞氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因選擇系統(tǒng)v 遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記：CAT，大腸桿菌大腸桿菌Tn9轉(zhuǎn)座子編碼的催化氯霉素轉(zhuǎn)座子編碼的催化氯霉素 乙?；磻?yīng)的蛋白質(zhì)乙酰化反應(yīng)的蛋白質(zhì)v 編碼產(chǎn)物編碼產(chǎn)物：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶v 篩選藥物篩選藥物：氯霉素：氯霉素v 作用機(jī)理作用機(jī)理：真核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞缺乏CAT，將，將CAT作為報(bào)告基因作為報(bào)告基因與目與目的基因一起導(dǎo)入到真核細(xì)胞，可在加入氯霉素的培養(yǎng)基中的基因一起導(dǎo)入到真核細(xì)胞，可在加入氯霉素的培養(yǎng)