生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)：微量凱氏定氮法

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)微量凱氏定氮法實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 一、目的和要求一、目的和要求 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 三、方法步驟三、方法步驟 四、思考題四、思考題一、目的和要求一、目的和要求1. 學(xué)習(xí)微量凱氏定氮法的原理2. 掌握微量凱氏定氮法的操作技術(shù)，包括 標(biāo)準(zhǔn)梳酸銨含氮量的測定、未知樣品的 消化蒸餾、滴定及其含氮量的計(jì)算等 天然有機(jī)物（如蛋白質(zhì)、核酸及氨其酸等）的含氮量用凱氏天然有機(jī)物（如蛋白質(zhì)、核酸及氨其酸等）的含氮量用凱氏定氮法來測定。當(dāng)天然含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱時(shí)，分解出氮、定氮法來測定。當(dāng)天然含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱時(shí)，分解出氮、二氧化碳及水。氮轉(zhuǎn)變出的氨與硫酸化合生成硫酸銨。分解反二氧化碳及水。氮轉(zhuǎn)變出

2、的氨與硫酸化合生成硫酸銨。分解反應(yīng)進(jìn)行得很慢，可加入硫酸銅及硫酸鉀或硫酸鈉促進(jìn)之，其中應(yīng)進(jìn)行得很慢，可加入硫酸銅及硫酸鉀或硫酸鈉促進(jìn)之，其中硫酸銅為催化劑，硫酸鉀或硫酸鈉可提高消化液的沸點(diǎn)。氧化硫酸銅為催化劑，硫酸鉀或硫酸鈉可提高消化液的沸點(diǎn)。氧化劑過氧化氫也能加速反應(yīng)。劑過氧化氫也能加速反應(yīng)。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 1.RCHNH1.RCHNH2 2COOH + 3HCOOH + 3H2 2SOSO4 42CO2CO2 2+ 2SO+ 2SO2 2+ 4H+ 4H2 2O + NHO + NH3 3 2.2NH 2.2NH3 3 + H + H2 2SOSO4 4 (NH (NH4 4)

3、)2 2SOSO4 4 消化完成后，在凱氏定氮儀中加入強(qiáng)堿（消化完成后，在凱氏定氮儀中加入強(qiáng)堿（NaOHNaOH）堿化消化）堿化消化液，使硫酸銨分解，放出氨。用水蒸汽蒸餾法，將氨蒸入過量液，使硫酸銨分解，放出氨。用水蒸汽蒸餾法，將氨蒸入過量無機(jī)酸無機(jī)酸(H(H3 3BOBO3 3) )溶液中，然后用標(biāo)準(zhǔn)酸（鹽酸）溶液進(jìn)行滴定，溶液中，然后用標(biāo)準(zhǔn)酸（鹽酸）溶液進(jìn)行滴定，準(zhǔn)確測定氨量，從而折算出含氮量。準(zhǔn)確測定氨量，從而折算出含氮量。3 3、(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4 + 2NaOH Na + 2NaOH Na2 2SOSO4 4 + 2NH + 2NH3 3 +2H +2H2

4、2O O 4 4、3NH3NH3 3 + H + H3 3BOBO3 3 (NH (NH4 4) )3 3BOBO3 3 + 3H + 3H2 2O O5 5、(NH(NH4 4) )3 3BOBO3 3 + 3HCl 3NH + 3HCl 3NH4 4Cl + HCl + H3 3BOBO3 3本法適用的范圍為本法適用的范圍為0.2-1.0mg0.2-1.0mg氮。相對(duì)誤差應(yīng)小于氮。相對(duì)誤差應(yīng)小于2%2%二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理三、方法步驟三、方法步驟 測定某一固體樣品中的含氮量，是按100克該物質(zhì)的的干重所含的氮克數(shù)來表示（%）。因此在定氮前應(yīng)先將固體樣品中的水分除掉。操作時(shí)先將樣品磨細(xì)，

5、在稱量瓶中稱入一定量的樣品，再置于105的烘箱內(nèi)烘烤1小時(shí)。用坩堝鉗將稱量瓶放入干燥器內(nèi)，待降至室溫后稱重。按上述操作，每烘干1小時(shí)后重復(fù)稱量一次，直至兩次稱量數(shù)值不變，即達(dá)到恒重為止。 （一）、樣品處理（一）、樣品處理 準(zhǔn)備4個(gè)50mL的凱氏燒瓶，并標(biāo)號(hào)，向第1、2號(hào)燒瓶內(nèi)各加入200mg固體粉末。注意，加入固體樣品應(yīng)加至燒瓶底部，切勿沾于瓶品及瓶頸上。向3、4號(hào)燒瓶加入2mL水，作為空白對(duì)照，測量試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)，以對(duì)樣品進(jìn)行校正。 在每個(gè)燒瓶中加入約300mg硫酸鉀-硫酸銅混合物，再用移液管加入消化液5mL，加入1顆玻璃珠以防止暴沸。將以上4個(gè)燒瓶放到消化架上進(jìn)行消化。 （二

6、）、消化（二）、消化 待消化液變成褐色后，再繼續(xù)消化，直到消化液由淡黃色變成清晰的淡藍(lán)綠色，消化即完成（固體樣品約需3小時(shí)）。（二）、消化（二）、消化（三）、蒸餾（三）、蒸餾 儀器應(yīng)先經(jīng)一般洗滌，再經(jīng)水蒸汽洗滌。一般儀器應(yīng)先經(jīng)一般洗滌，再經(jīng)水蒸汽洗滌。一般洗滌是先用水洗凈棒狀玻塞周圍，每次實(shí)驗(yàn)后要洗洗滌是先用水洗凈棒狀玻塞周圍，每次實(shí)驗(yàn)后要洗去氫氧化鈉溶液，以防樣品加入時(shí)立即放氨。使用去氫氧化鈉溶液，以防樣品加入時(shí)立即放氨。使用前全部蒸餾裝置必須用水蒸汽充分洗滌。用水蒸汽前全部蒸餾裝置必須用水蒸汽充分洗滌。用水蒸汽洗滌蒸餾器的目的在于洗去冷凝管中可能殘留的氨。洗滌蒸餾器的目的在于洗去冷凝管中可

7、能殘留的氨。對(duì)于處于使用狀態(tài)的儀器（尤其是正在測定中的儀對(duì)于處于使用狀態(tài)的儀器（尤其是正在測定中的儀器），加樣前使蒸汽通過器），加樣前使蒸汽通過1 12min2min即可，對(duì)于較長即可，對(duì)于較長時(shí)間未使用的儀器，必須用水蒸汽洗滌到吸收蒸汽時(shí)間未使用的儀器，必須用水蒸汽洗滌到吸收蒸汽的硼酸的硼酸- -指示劑混合液顏色合格為止。指示劑混合液顏色合格為止。（三）、蒸餾（三）、蒸餾1.1.儀器的洗滌儀器的洗滌 加樣前先撤火1并務(wù)必打開夾子，否則，樣品會(huì)被倒抽到反應(yīng)器外。取下棒狀玻塞，用吸管吸取5mL消化液，細(xì)心地插到反應(yīng)器小玻杯的棒狀玻塞的下方。這步必須切實(shí)做到，以免加堿后氨立即揮發(fā)逸走，讓反應(yīng)液流入

8、反應(yīng)室中，塞上棒狀玻塞，取1只盛有硼酸-指示劑混合液的錐形瓶，放在冷凝器之下口，冷凝器下口必須在硼酸液面之下。此錐形瓶在加堿液（40%氫氧化鈉溶液）前或者也可以加樣品之前就放在冷凝管下口，并使下口浸入，目的是保證全部吸收氫氧鈉溶液與樣品接觸時(shí)放出的氨。2.2.樣品以及空白蒸餾樣品以及空白蒸餾 用量筒向小玻杯加入用量筒向小玻杯加入10mL 40%10mL 40%氫氨化鈉，氫氨化鈉，加完后，輕輕地旋轉(zhuǎn)著向上提起棒狀玻塞加完后，輕輕地旋轉(zhuǎn)著向上提起棒狀玻塞, ,使使堿液慢慢流入反應(yīng)室，在堿液尚未守全流入堿液慢慢流入反應(yīng)室，在堿液尚未守全流入時(shí)，將玻塞蓋緊，向小玻杯中加入約時(shí)，將玻塞蓋緊，向小玻杯中加

9、入約5mL5mL蒸餾蒸餾水。再輕提玻塞，使一半蒸餾水流入反應(yīng)室，水。再輕提玻塞，使一半蒸餾水流入反應(yīng)室，另一半留在玻杯中水封。另一半留在玻杯中水封。2.2.樣品以及空白蒸餾樣品以及空白蒸餾全部蒸餾完畢后，用全部蒸餾完畢后，用0.01024mol/L0.01024mol/L標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集的氨量，直至硼酸的氨量，直至硼酸- -指示劑混合液指示劑混合液由綠色變回茶褐色，即為滴定終點(diǎn)。由綠色變回茶褐色，即為滴定終點(diǎn)。蛋白氮蛋白氮= =總氮總氮- -非蛋白氮非蛋白氮蛋白質(zhì)含量（克蛋白質(zhì)含量（克/%/%）= =蛋白氮蛋白氮6.256.253.3.滴定滴定4 4、計(jì)算、計(jì)算1.1.指出下列試劑的作用：指出下列試劑的作用：（1 1）消化含氮樣品時(shí)使用的消化液、硫酸鉀及硫）消化含氮樣品時(shí)使用的消化液、硫酸鉀及硫酸銅粉末。酸銅粉末。（2 2）蒸餾滴定中的）蒸餾滴定中的40%40%