人類染色體標本的制備及G顯帶核型分析

1、 人類染色體標本的制備人類染色體標本的制備及及G G顯帶核型分析顯帶核型分析安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物學教研室安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物學教研室 目的和要求目的和要求 1. 掌握染色體標本的制備方法和G顯帶技術。2. 熟悉人類外周血淋巴細胞的培養(yǎng)方法及G顯帶 染色體的核型分析技術。 實驗原理實驗原理 染色體作為細胞遺傳信息的載體，出現(xiàn)于有絲染色體作為細胞遺傳信息的載體，出現(xiàn)于有絲分裂期。用于人類染色體標本制備的材料可為骨髓細分裂期。用于人類染色體標本制備的材料可為骨髓細胞、外周血淋巴細胞、絨毛細胞、羊水細胞等。其中胞、外周血淋巴細胞、絨毛細胞、羊水細胞等。其中最簡便的就是抽取少量外周靜脈血進行

2、短期培養(yǎng)，經(jīng)最簡便的就是抽取少量外周靜脈血進行短期培養(yǎng)，經(jīng)秋水仙素處理（秋水仙素可阻斷有絲分裂期細胞中微秋水仙素處理（秋水仙素可阻斷有絲分裂期細胞中微管的聚集，使紡錘體不能形成，從而使有絲分裂停滯管的聚集，使紡錘體不能形成，從而使有絲分裂停滯在中期時相，此時染色體具有最典型的形態(tài)），再經(jīng)在中期時相，此時染色體具有最典型的形態(tài)），再經(jīng)低滲、固定等處理，獲得更多的中期分裂相以用于核低滲、固定等處理，獲得更多的中期分裂相以用于核型分析。型分析。n染色體的帶紋是染色體標本經(jīng)過特殊處理后，每條染色體的帶紋是染色體標本經(jīng)過特殊處理后，每條染色體上沿縱軸顯示出的一定數(shù)量、著色程度不同、染色體上沿縱軸顯示出的

3、一定數(shù)量、著色程度不同、寬窄不等的橫紋。染色體帶是染色體固有的、穩(wěn)定寬窄不等的橫紋。染色體帶是染色體固有的、穩(wěn)定的特征。染色體的特征。染色體G G顯帶是多種顯帶技術中的一種，是顯帶是多種顯帶技術中的一種，是將染色體標本經(jīng)胰蛋白酶處理后再用吉姆薩將染色體標本經(jīng)胰蛋白酶處理后再用吉姆薩（GiemsaGiemsa）染液染色。）染液染色。G G顯帶技術因其方法簡便，重顯帶技術因其方法簡便，重復性好，帶紋清晰且可長期保存而應用最為廣泛。復性好，帶紋清晰且可長期保存而應用最為廣泛。n核型是指一個體細胞有絲分裂中期的所有染色體，核型是指一個體細胞有絲分裂中期的所有染色體，并按其大小、形態(tài)特征順序排列所構成的

4、圖像。每并按其大小、形態(tài)特征順序排列所構成的圖像。每一個體細胞含有兩組同樣的染色體，用一個體細胞含有兩組同樣的染色體，用2n2n表示。表示。n染色體核型分析是細胞遺傳學的重要研究手段，在染色體核型分析是細胞遺傳學的重要研究手段，在臨床多種疾病如染色體病、白血病、腫瘤等的診斷臨床多種疾病如染色體病、白血病、腫瘤等的診斷及研究中具有重要意義。及研究中具有重要意義。組組 染色體號染色體號 主要特征主要特征A組組B組組 C組組D組組E組組F組組G組組 123亞中著絲粒染色體亞中著絲粒染色體中央著絲粒染色體中央著絲粒染色體4 5亞中著絲粒染色體、無隨體亞中著絲粒染色體、無隨體6 12、X亞中著絲粒染色體

5、亞中著絲粒染色體大大小小13 15近端著絲粒染色體、有隨體近端著絲粒染色體、有隨體161718亞中著絲粒染色體亞中著絲粒染色體中央著絲粒染色體中央著絲粒染色體19 20中央著絲粒染色體中央著絲粒染色體21 22、Y近端著絲粒染色體、有隨體近端著絲粒染色體、有隨體Y染色體略大、長臂平行伸展、無隨體染色體略大、長臂平行伸展、無隨體顯帶染色體：顯帶染色體：pq321123464321 52131212123 54121324正常男性：正常男性：46，XY正常女性：正常女性：46，XX正常人體細胞染色體帶型模式圖正常人體細胞染色體帶型模式圖 實驗用品實驗用品 n1 1器具：采血器具、超凈工作臺、培養(yǎng)瓶

6、、恒溫：采血器具、超凈工作臺、培養(yǎng)瓶、恒溫 培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、10 ml10 ml刻度離心管、低刻度離心管、低 速離心機、量筒、載玻片、托盤天平、光學速離心機、量筒、載玻片、托盤天平、光學 顯微鏡、染缸、電吹風、酒精燈、剪刀、膠水。顯微鏡、染缸、電吹風、酒精燈、剪刀、膠水。n2 2材料：人外周靜脈血。：人外周靜脈血。n3 3試劑：RPMI-1640RPMI-1640培養(yǎng)液、小牛血清、肝素、植培養(yǎng)液、小牛血清、肝素、植 物血凝素（物血凝素（PHAPHA）、秋水仙素）、秋水仙素(20g/ml)(20g/ml)、 0.075 mol/L0.075 mol/L氯化鉀低滲液、氯化鉀

7、低滲液、0.85%0.85%生理鹽水、生理鹽水、 固定液（甲醇固定液（甲醇: :冰醋酸冰醋酸=3:1=3:1，現(xiàn)配現(xiàn)用）、，現(xiàn)配現(xiàn)用）、 GiemsaGiemsa原液、原液、0.25%0.25%胰蛋白酶溶液、磷酸鹽緩沖胰蛋白酶溶液、磷酸鹽緩沖 液。液。 實驗步驟實驗步驟 n( (一一) )人類外周血染色體標本的制備人類外周血染色體標本的制備n1 1采集人外周靜脈血采集人外周靜脈血1ml1ml，迅速與適量肝素混勻抗凝。，迅速與適量肝素混勻抗凝。n2. 2. 超凈工作臺內將抗凝血加入超凈工作臺內將抗凝血加入RPMI-1640RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)液中，每中，每 瓶加瓶加0.30.30.5 m

8、l0.5 ml全血。輕輕混勻。全血。輕輕混勻。n3. 373. 37恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)72 h72 h左右（培養(yǎng)左右（培養(yǎng)24 h24 h后水平后水平 輕搖培養(yǎng)瓶一次，以懸浮混勻血細胞）。輕搖培養(yǎng)瓶一次，以懸浮混勻血細胞）。n4. 4. 培養(yǎng)至培養(yǎng)至686872 h72 h（即終止培養(yǎng)前（即終止培養(yǎng)前2 24 h4 h），每瓶加秋），每瓶加秋 水仙素水仙素(20 g/ml)(20 g/ml)至終濃度至終濃度0.10.10.2 g/ml0.2 g/ml，輕搖，輕搖 培養(yǎng)瓶混勻，繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)瓶混勻，繼續(xù)培養(yǎng)2 24 h4 h。n5. 5. 終止培養(yǎng)，將培養(yǎng)物吹打混勻后轉移到終止培

9、養(yǎng)，將培養(yǎng)物吹打混勻后轉移到10 ml10 ml玻璃離玻璃離 心管，配平，心管，配平，1800 rpm 1800 rpm 離心離心6 min6 min。n6. 6. 低滲低滲 棄上清。加入棄上清。加入3737預溫的預溫的0.075 mol/L0.075 mol/L氯化鉀氯化鉀 8 ml8 ml，吸管輕輕吹打混勻，吸管輕輕吹打混勻，3737低滲處理低滲處理20 min20 min。n7. 7. 預固定預固定 加入加入1ml 1ml 新鮮配制的固定液（甲醇新鮮配制的固定液（甲醇: :冰醋酸冰醋酸 =3:1=3:1），輕輕混勻，），輕輕混勻，1800 rpm 1800 rpm 離心離心6 min6

10、min。n8. 8. 固定：棄上清，加入上述新鮮固定液固定：棄上清，加入上述新鮮固定液8 ml8 ml，輕輕混，輕輕混 勻，室溫下靜置固定勻，室溫下靜置固定20 min20 min。n9. 9. 棄上清，重復固定棄上清，重復固定1 1次。次。n10.10.棄上清，根據(jù)沉淀量多少加入適量滴數(shù)新鮮固定棄上清，根據(jù)沉淀量多少加入適量滴數(shù)新鮮固定 液，輕輕混勻，制成磨砂狀懸液。液，輕輕混勻，制成磨砂狀懸液。n11.11.制片：取上述懸液制片：取上述懸液1 12 2滴，滴至沾有冰水或干燥的滴，滴至沾有冰水或干燥的 潔凈載玻片上，吹散，過火，空氣干燥。潔凈載玻片上，吹散，過火，空氣干燥。n12.3712.

11、37溫箱放置溫箱放置3 34 4天或天或7070烘烤烘烤2 h2 h進行老化處進行老化處 理，以備顯帶分析用。理，以備顯帶分析用。【實驗方法和步驟】1、預處理預處理：實驗前3-4小時，取健康小鼠，每只腹腔注射001 秋水仙素03-04ml。注意不要傷及內臟。2、取股骨取股骨：用一只手的拇指和食指按住小鼠的頭部，另一只手 拉住它的尾巴，用力向后拉斷其頸椎。處死后立即用剪刀剪 開后腿上的皮毛，取出小鼠的股骨，剔除上面的肌肉，洗凈。( (二二) )人類染色體的人類染色體的G G顯帶顯帶n1.1.胰蛋白酶準備：在盛有胰蛋白酶準備：在盛有45 ml 0.85%45 ml 0.85%生理鹽水的染缸生理鹽水

12、的染缸 中加中加3 ml 0.25%3 ml 0.25%胰蛋白酶溶液，調節(jié)胰蛋白酶溶液，調節(jié)pHpH值至值至6.86.8 7.27.2，置，置3737恒溫水浴鍋中預溫。恒溫水浴鍋中預溫。n2.2.胰蛋白酶消化處理：將經(jīng)老化處理的標本片放入胰蛋胰蛋白酶消化處理：將經(jīng)老化處理的標本片放入胰蛋 白酶溶液中處理白酶溶液中處理2 23 min3 min，不斷輕搖載玻片以保證，不斷輕搖載玻片以保證 作用均勻充分。作用均勻充分。n3.3.漂洗：迅速用漂洗：迅速用0.85%0.85%生理鹽水漂洗，以終止胰蛋白酶生理鹽水漂洗，以終止胰蛋白酶 的作用。的作用。n4.4.染色：用吉姆薩工作液染色染色：用吉姆薩工作液

13、染色101015 min15 min。n5.5.沖洗干燥：用緩流自來水沖洗載玻片，空氣干燥或電沖洗干燥：用緩流自來水沖洗載玻片，空氣干燥或電 吹風吹干。吹風吹干。n6.6.鏡檢：光學顯微鏡下觀察分析核型。鏡檢：光學顯微鏡下觀察分析核型。( (三三) G) G顯帶的核型分析顯帶的核型分析n1.1.選取染色體分散良好、長度適中染色體選取染色體分散良好、長度適中染色體G G顯帶核型顯帶核型 照片，首先進行計數(shù)，然后將每條染色體剪下。照片，首先進行計數(shù)，然后將每條染色體剪下。n2.2.配對：同源染色體形態(tài)相同，帶型一樣；非同源染配對：同源染色體形態(tài)相同，帶型一樣；非同源染色體的大小，形態(tài)等帶型各異，根

14、據(jù)這個原理，按照色體的大小，形態(tài)等帶型各異，根據(jù)這個原理，按照染色體的大小、形態(tài)、著絲粒的位置，隨體的有無和染色體的大小、形態(tài)、著絲粒的位置，隨體的有無和G G顯帶帶型等特征將顯帶帶型等特征將4646條染色體配成條染色體配成2323對。對。n3.3.染色體排列：將配成染色體排列：將配成2323對的染色體按大小次序排列，對的染色體按大小次序排列，一對性染色體排在最后，并把排列好的一對性染色體排在最后，并把排列好的2323對染色體分對染色體分組貼附于實驗報告紙上。這樣，經(jīng)過剪貼配對好的正組貼附于實驗報告紙上。這樣，經(jīng)過剪貼配對好的正常人體染色體圖即為正常人體核型圖，可寫成常人體染色體圖即為正常人體

15、核型圖，可寫成 46,XX46,XX或或46,XY46,XY。正常男性染色體正常男性染色體G-顯帶核型顯帶核型人類染色體人類染色體G-G-顯帶特征口訣：顯帶特征口訣：一禿二蛇三蝶飄一禿二蛇三蝶飄 四鞭炮五黑腰四鞭炮五黑腰六號是個小白臉六號是個小白臉 七上八下九苗條七上八下九苗條十號長臂近帶好十號長臂近帶好 十一低來十二高十一低來十二高十三四十五十三四十五 下、中、上下、中、上十六十六q q2 2縊痕大縊痕大 十七長臂帶腳鐐十七長臂帶腳鐐十八人小肚皮大十八人小肚皮大 十九一點腰十九一點腰二十頭重又腳輕二十頭重又腳輕 二十一象個葫蘆瓢二十一象個葫蘆瓢二十二頭帶小黑帽二十二頭帶小黑帽 X X一擔挑，

16、一擔挑，Y Y是黑腳是黑腳 注意事項注意事項 n1. 1. 染色體標本制備中的關鍵因素包括秋水仙素的用量染色體標本制備中的關鍵因素包括秋水仙素的用量和作用時間、低滲和固定的處理。其中低滲時間很重要，和作用時間、低滲和固定的處理。其中低滲時間很重要，處理時間過長則細胞膜過早破裂導致染色體丟失，處理處理時間過長則細胞膜過早破裂導致染色體丟失，處理時間不足則致染色體分散不好，不利于計數(shù)分析。時間不足則致染色體分散不好，不利于計數(shù)分析。n2. G2. G顯帶過程中的關鍵因素包括胰蛋白酶的作用時間、顯帶過程中的關鍵因素包括胰蛋白酶的作用時間、溫度、溫度、pHpH等。其中胰蛋白酶溶液應等。其中胰蛋白酶溶液應3737充分預熱，溶液充分預熱，溶液pHpH應維持在應維持在6.86.