中西醫(yī)結(jié)合導(dǎo)論第三章研究方法

1、第三章第三章 中西醫(yī)結(jié)合研究中西醫(yī)結(jié)合研究 方法方法主要內(nèi)容與要點(diǎn)導(dǎo)航主要內(nèi)容與要點(diǎn)導(dǎo)航 主要內(nèi)容主要內(nèi)容 第一節(jié)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究方法 第二節(jié)中西醫(yī)結(jié)合臨床研究方法 要點(diǎn)導(dǎo)航要點(diǎn)導(dǎo)航 了解現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)方法了解現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)方法 理解現(xiàn)代試驗(yàn)方法在中理解現(xiàn)代試驗(yàn)方法在中醫(yī)藥研究中運(yùn)用醫(yī)藥研究中運(yùn)用 掌握中西醫(yī)結(jié)合臨床研掌握中西醫(yī)結(jié)合臨床研究方法究方法第一節(jié)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究方法第一節(jié)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究方法 一、分子生物學(xué)研究方法 二、細(xì)胞生物學(xué)與組織形態(tài)研究方法 三、生物化學(xué)研究方法 四、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)研究方法 五、功能學(xué)研究方法 六、中藥化學(xué)研究方法 七、系統(tǒng)生物學(xué)研究方法 八、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與中醫(yī)藥研究第一節(jié)

2、中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究方法第一節(jié)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究方法 一、分子生物學(xué)研究方法 生命是由蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子組成的一個(gè)復(fù)雜體系，具有自我復(fù)制、自我更新、自我調(diào)控以及對內(nèi)外環(huán)境刺激做出選擇性反應(yīng)的能力，新陳代謝是其基本特征。 分子生物學(xué)主要研究細(xì)胞成分的物理、化學(xué)的性質(zhì)和變化與生命現(xiàn)象的關(guān)系。如遺傳信息的傳遞、基因的結(jié)構(gòu)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)調(diào)控和表達(dá)產(chǎn)物的功能，以及細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。一、分子生物學(xué)研究方法 （一）DNA體外擴(kuò)增1 1、 DNA體外擴(kuò)增技術(shù)：DNA體外擴(kuò)增主要為聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR)，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，可在數(shù)小時(shí)內(nèi)對僅有幾個(gè)拷貝的基因放大百萬倍。此法不僅

3、可以用于中藥及動(dòng)物細(xì)胞基因的分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于中藥鑒定及疾病的診斷等。2、在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用： PCR技術(shù)在中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)研究和臨床檢測中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。如檢測與惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)的突變基因及中醫(yī)藥的干預(yù)調(diào)節(jié)效應(yīng)。在中藥鑒定上， PCR技術(shù)鑒定中藥材的道地和品質(zhì) 。一、分子生物學(xué)研究方法 ( (二二) )原位雜交與核酸蛋白印跡原位雜交與核酸蛋白印跡1、 原位雜交與核酸蛋白印跡技術(shù) （1）原位雜交技術(shù) 是將分子雜交與組織化學(xué)相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù) 。分DNA-DNA雜交、 DNA-RNA 雜交 、RNA-RNA雜交三類。（2）印跡技術(shù)：用于基因組DNA的定性定量分析 DNA印跡

4、術(shù)，檢測DNA結(jié)構(gòu)及其差異的技術(shù)。RNA印跡術(shù)，檢測某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)技術(shù)。 蛋白質(zhì)印跡術(shù)，用于特異蛋白質(zhì)的存在、半定量等。斑點(diǎn)及夾縫印跡雜交，用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性和定量研究。原位雜交技術(shù) 是利用核酸分子堿基配對互補(bǔ)原理，用預(yù)先已標(biāo)記了用以顯示靶基因的已知DNA或RNA片段作為探針，通過探針與組織細(xì)胞中靶核酸分子的特異性結(jié)合，并借助免疫組織化學(xué)技術(shù)，在組織細(xì)胞原位顯示某一特定基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA。印跡技術(shù)印跡技術(shù)是指將待檢測核酸分子結(jié)合到一定固相支撐物上的方法，是指將待檢測核酸分子結(jié)合到一定固相支撐物上的方法，這些結(jié)合在固相支撐物上的核酸分子即可與存在于

5、液相中這些結(jié)合在固相支撐物上的核酸分子即可與存在于液相中的探針分子進(jìn)行雜交。的探針分子進(jìn)行雜交。一、分子生物學(xué)研究方法 ( (二二) )原位雜交與核酸蛋白印跡原位雜交與核酸蛋白印跡 2、在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用 原位雜交技術(shù)涉及中藥細(xì)胞及機(jī)體組織細(xì)胞特定核酸在染色體中的精確定位，觀察特定基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平、確定組織中有無特異性的細(xì)菌與病毒等病原體的感染及中醫(yī)藥在核酸水平的干預(yù)效應(yīng)。 技術(shù)印跡應(yīng)用于中藥品種的改良，判斷某一中藥對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。一、分子生物學(xué)研究方法 （三）基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)1、基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（1）基因組學(xué)研究內(nèi)容及技術(shù) 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)：以全基因組測序?yàn)槟繕?biāo)。 功能

6、基因組學(xué)：以功能鑒定為目標(biāo)（2）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù) 蛋白質(zhì)分離技術(shù) 蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)一、分子生物學(xué)研究方法 （三）基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)2、在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用：比較同病異證和異病同證 建立了“證候-基因表達(dá)譜”。 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用分兩類：一是中醫(yī)藥對某一已知蛋白表達(dá)調(diào)控作用；二是通過用藥前后組織或細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組展開來評價(jià)中藥的療效。一、分子生物學(xué)研究方法 （四）生物芯片1、生物芯片技術(shù)：分為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、肽芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片、物種鑒定芯片、和基因組分型芯片、藥物芯片等。（1）基因芯片技術(shù) 是同步、高效、快速和低成本，可分為分析芯片、檢測芯片和診斷芯片等。（2）蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 是一

7、種高通量的蛋白質(zhì)給你分析技術(shù)。2、在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用 在中醫(yī)藥有效療法及藥物的篩選方面。生物芯片：生物芯片：是縮小了的生物化學(xué)是縮小了的生物化學(xué)分析器。分析器。二、細(xì)胞生物學(xué)與組織形態(tài)學(xué)研究方法（一）細(xì)胞與組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)研究1、細(xì)胞與組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)染色及觀察（1）染色方法：組織細(xì)胞；血細(xì)胞（2）細(xì)胞與組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的形態(tài)觀察 顯微鏡分為：光學(xué)顯微鏡（普通光學(xué)、熒光、相差、微分子干涉、暗視野、倒置、激光掃描共焦顯微鏡）；電子顯微鏡（投射、掃描電子顯微鏡）；掃描探針顯微鏡（掃描隧道、原子力學(xué)顯微鏡）。2、在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用 形態(tài)學(xué)觀察是中西醫(yī)研究疾病發(fā)病機(jī)制、轉(zhuǎn)歸、療效評價(jià)及中藥品質(zhì)鑒定等最常

8、用的手段。二、細(xì)胞生物學(xué)與組織形態(tài)學(xué)研究方法（二）細(xì)胞和亞細(xì)胞組分分析細(xì)胞和亞細(xì)胞組分的分析主要利用細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)。細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)是在保持組織、細(xì)胞原有生活結(jié)構(gòu)狀態(tài)機(jī)化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，利用物理學(xué)、化學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等原理與技術(shù)手段，對組織與細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分及其變化規(guī)律進(jìn)行定性、定位、定量研究的技術(shù)。 在中醫(yī)藥研究中應(yīng)用于檢測人、動(dòng)物等有機(jī)體的不同發(fā)育階段、不同組織部位及其異常生理、病理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)或功能成分的表達(dá)及變化特點(diǎn)。二、細(xì)胞生物學(xué)與組織形態(tài)學(xué)研究方法（三）細(xì)胞工程技術(shù) 細(xì)胞工程是細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)的交叉學(xué)科，利用細(xì)胞生物學(xué)的原理和方法，結(jié)合工程學(xué)的技術(shù)手段，按照預(yù)先設(shè)計(jì)，

9、有計(jì)劃地改變或創(chuàng)造細(xì)胞遺傳性的技術(shù)。 在中醫(yī)藥研究中應(yīng)用于動(dòng)物、植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)、細(xì)胞融合、細(xì)胞核移植、染色特工程、胚胎工程、轉(zhuǎn)基因生物與生物反應(yīng)器等及其中醫(yī)藥的調(diào)控作用等。 三、生物化學(xué)研究方法 是運(yùn)用化學(xué)的理論和技術(shù)研究生命物質(zhì)的邊緣學(xué)科。早期生物整體研究早期生物整體研究運(yùn)用光譜分析、同位素標(biāo)運(yùn)用光譜分析、同位素標(biāo)記、記、X射線衍射及物理化學(xué)技術(shù)射線衍射及物理化學(xué)技術(shù)等對各種組織和等對各種組織和細(xì)胞成分進(jìn)行精確分析。細(xì)胞成分進(jìn)行精確分析。三、生物化學(xué)研究方法（一）生物大分子的吸收光譜分析 分光光度技術(shù)是利用紫外光、可見光、紅外光以及激光等測定物質(zhì)的吸收光譜，并對物質(zhì)進(jìn)行定性、定量以及結(jié)構(gòu)

10、分析的技術(shù)。使用儀器是分光光度儀。 主要用于氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)含量的測定、生物大分子的鑒定、酶活力測定以及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究、疾病的診斷及其中醫(yī)藥對細(xì)胞或體液中氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等大分子含量的影響。三、生物化學(xué)研究方法（二）生物大分子的電泳與層析分離：對組織細(xì)胞與體液中氨基酸、蛋白質(zhì)核酸等進(jìn)行分離 紙上電泳、醋酸纖維素凝膠電泳、 瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳 1、電泳技術(shù)：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、 聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳等 凝膠層析技術(shù)、 2、層析技術(shù)：離子交換層析技術(shù) 高效液相層析技術(shù) 親和層析技術(shù)三、生物化學(xué)研究方法（二）生物大分子的電泳與層析技術(shù)三、生物化學(xué)研究方法（二

11、）生物大分子的電泳與層析分離 電泳與層析分離技術(shù)是對組織細(xì)胞與體液中的氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、脂類、核苷、核苷酸及核酸等分離的主要研究方法，用于分析物質(zhì)純度和分子量的測定等。 在中醫(yī)藥研究中，電泳技術(shù)用于中藥材鑒別及中醫(yī)藥對氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、脂類、核苷、核苷酸及核酸等生物大分子調(diào)控效應(yīng)的研究。三、生物化學(xué)研究方法（三）透析技術(shù)研究方法 是利用半透膜的選擇性在溶液里分離大分子和小分子的一種分離技術(shù)。常用于除去大分子（如蛋白質(zhì)、核酸）中的小分子雜質(zhì)。 中醫(yī)藥研究中，其主要可應(yīng)用于中藥藥理學(xué)及針刺機(jī)制研究等方面。利用微透析技術(shù)可以連續(xù)觀察目的部位局部的藥效學(xué)變化，對藥效進(jìn)行評價(jià)。四、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)研究

12、方法（一）抗原抗體的檢測 凝集反應(yīng)：檢測標(biāo)本中不溶性顆粒抗原方法 沉淀反應(yīng)：檢測標(biāo)本中可溶性顆?？乖?免疫標(biāo)記反應(yīng) 免疫熒光法 酶聯(lián)免疫分析法 放射免疫分析法 免疫印跡法 化學(xué)發(fā)光免疫分析 免疫PCR 用熒光用熒光素、同素、同位素或位素或酶標(biāo)記，酶標(biāo)記，優(yōu)于抗優(yōu)于抗原抗體原抗體檢測檢測抗原抗體的檢測的應(yīng)用 因?yàn)榭乖贵w的檢測即可評價(jià)免疫系統(tǒng)功能，也是評價(jià)其他各系統(tǒng)相關(guān)功能的狀態(tài)及其變化的情況，因此，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論、作用機(jī)理、療效評價(jià)等。 在抗原抗體反應(yīng)中，可用已知抗體（抗原）檢測未知抗原抗體，并可根據(jù)需要選擇定性或定量的測定方法。四、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)研究方法（二）免疫分子的研究 免

13、疫分子包括： 免疫球蛋白、補(bǔ)體、細(xì)胞因子、MHC分子、CD分子、黏附分子、模式識(shí)別受體(Toll樣受體)等。 由于免疫分子是免疫細(xì)胞免疫反應(yīng)、免疫信息的主要執(zhí)行者，而免疫調(diào)節(jié)是中醫(yī)藥防治疾病的重要機(jī)制之一，因而，對免疫分子的檢測是中醫(yī)藥研究中的中醫(yī)指標(biāo)。 免疫球蛋白存在于血液、組織液和外分泌液中，可與抗原的特異性結(jié)合，發(fā)揮中和毒素、阻斷病原入侵、清楚病原微生物或?qū)е旅庖卟±頁p傷；同時(shí)可協(xié)助補(bǔ)體、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等清楚免疫復(fù)合物、殺傷腫瘤細(xì)胞等，是機(jī)體發(fā)揮體液免疫功能的主要成分之一。四、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)研究方法（三）免疫細(xì)胞的研究 參與免疫應(yīng)答或免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞統(tǒng)稱為免疫細(xì)胞。是免疫應(yīng)答的主要

14、執(zhí)行者。 包括：淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核-吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等。 通過中醫(yī)藥、針灸對機(jī)體免疫功能的干預(yù)效應(yīng)及其機(jī)制均已成為中醫(yī)藥藥理學(xué)、毒理學(xué)及其臨床效應(yīng)評價(jià)的核心內(nèi)容。五、功能學(xué)研究方法 （一）循環(huán)系統(tǒng)功能學(xué)研究方法 1、循環(huán)系統(tǒng)功能學(xué)檢測 （1)心肌電生理：心肌細(xì)胞電生理檢測 動(dòng)物心電圖描計(jì) （2）心臟泵學(xué)功能：超聲心電圖，評價(jià)指標(biāo)： （3）血流動(dòng)力學(xué)研究 （4）微循環(huán)系統(tǒng)功能學(xué)：醫(yī)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng) 2、應(yīng)用 上述方法功能學(xué)指標(biāo)是正常、疾病狀態(tài)（疾病模型）及中醫(yī)藥干預(yù)循環(huán)系統(tǒng)功能評價(jià)不可或缺的指標(biāo)。五、功能學(xué)研究方法 （二）血液系統(tǒng)功能學(xué)研究方法 主要包括血液的流動(dòng)性和凝固性，

15、血液有形成分等檢測。在止血藥研究和血瘀、血虛模型相關(guān)基礎(chǔ)及藥效學(xué)研究中，觀察這些指標(biāo)均已成為干預(yù)后血液系統(tǒng)功能評價(jià)必不可少的指標(biāo)。五、功能學(xué)研究方法 （三）呼吸系統(tǒng)功能研究方法 評價(jià)指標(biāo)：1、肺通氣功能評價(jià)：評價(jià)正常、疾病（特別是慢阻肺）模型及相關(guān)干預(yù)后肺功能好壞必不可少的指標(biāo)2、血?dú)夥治觯阂灿糜诼璺渭膊〔煌C候模型、哮喘、肺纖維化等疾病的研究中。對與肺功能和電解質(zhì)等指標(biāo)聯(lián)合測定。 五、功能學(xué)研究方法 （四）泌尿系統(tǒng)功能研究方法 檢測腎功能： （五）消化系統(tǒng)功能研究方法 檢測胃腸動(dòng)力學(xué)和消化道平滑肌生理五、功能學(xué)研究方法 （六）神經(jīng)與運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)功能學(xué)檢測 1、檢測內(nèi)容： （1）痛覺研究（熱、電

16、、機(jī)械、化學(xué)刺激法） （2）鎮(zhèn)靜催眠作用研究 （3）抗癲癇研究 （4）學(xué)習(xí)記憶功能 （5）腦電生理研究：腦電圖、腦立體定位術(shù)、大腦皮質(zhì)誘發(fā)電位 （6）骨骼肌功能：生物電和機(jī)械收縮特性 （7）神經(jīng)反射：反射弧的結(jié)構(gòu)和功能完整性補(bǔ)益開竅類中藥補(bǔ)益開竅類中藥針灸骨傷療法針灸骨傷療法六、中藥化學(xué)研究方法 （一）中藥化學(xué)成分的分離純化：多種聯(lián)用色譜法 （二）中藥化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)確證 （三）計(jì)算機(jī)輔助中藥新藥設(shè)計(jì) （四）中藥化合物的活性評價(jià)：分子、細(xì)胞和動(dòng)物水平 （五）方劑藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析：血藥和非血藥濃度 （六）中藥定量構(gòu)效關(guān)系研究：結(jié)構(gòu)參數(shù)與生物活性數(shù)據(jù) （七）中藥化學(xué)成分的生物轉(zhuǎn)化研究 （八）中藥復(fù)

17、方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究七、系統(tǒng)生物學(xué)研究方法 系統(tǒng)生物學(xué)是研究生物系統(tǒng)中所有成分（基因、mRNA、蛋白質(zhì)）的構(gòu)成，以及在特定條件下這些組分間的相互關(guān)系的科學(xué)。 主要內(nèi)容：系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及相互作用、系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)特征、系統(tǒng)控制及規(guī)律和系統(tǒng)設(shè)計(jì)。（一）轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究（一）轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究研究生物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組研究生物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組發(fā)生和變化規(guī)律。發(fā)生和變化規(guī)律。（二）代謝組學(xué)研究（二）代謝組學(xué)研究研究生物體系受外部刺激后研究生物體系受外部刺激后所產(chǎn)生的所有代謝產(chǎn)物所產(chǎn)生的所有代謝產(chǎn)物種類、數(shù)量和變化的規(guī)律。種類、數(shù)量和變化的規(guī)律。（三）生物信息學(xué)（三）生物信息學(xué)由生物學(xué)、計(jì)算科學(xué)由生物學(xué)、計(jì)算科學(xué)以及應(yīng)用數(shù)學(xué)等以及應(yīng)用數(shù)

18、學(xué)等學(xué)科交叉形成。學(xué)科交叉形成。八、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與中醫(yī)藥研究 （一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選用 與人類功能、代謝及疾病特點(diǎn)相近似的動(dòng)物； 選用解剖生理特點(diǎn)符合實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡膭?dòng)物； 選用遺傳背景明確、具有已知菌叢或無菌動(dòng)物； 選用具有某種特殊反應(yīng)的動(dòng)物各系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇：八、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與中醫(yī)藥研究 （二）中醫(yī)藥研究常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型 （三）中醫(yī)藥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ退幮гu價(jià) 一是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的評價(jià) 二是藥效指標(biāo)選擇第二節(jié)中西醫(yī)結(jié)合臨床研究方法第二節(jié)中西醫(yī)結(jié)合臨床研究方法 一、中西醫(yī)結(jié)合臨床研究基本原則（一）中西醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢簡述：（二）基本原則：優(yōu)勢互補(bǔ)一是各自強(qiáng)化優(yōu)勢揚(yáng)長避短，優(yōu)勢互補(bǔ)提高治愈率；二是對慢性病常見病治療方案、手段合理結(jié)合，提高有效率。第二節(jié)中西醫(yī)結(jié)合臨床研究方法第二節(jié)中西醫(yī)結(jié)合臨床研究方法 二、中西醫(yī)結(jié)合臨床研究基本方法 （一）中西醫(yī)雙重診斷 （二）微觀辨證 （三）階段治療 （四）