放免與單克隆抗體

1、放射免疫分析法Radioimmunoassay，RIA美國女免疫學(xué)家羅莎琳雅洛（Rosalyn S. Yalow），因創(chuàng)立了放射免疫法而榮獲1977年諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎。 放射免疫分析法是利用同位素標(biāo)記的與未標(biāo)記的抗原，同抗體發(fā)生競爭性抑制反應(yīng)的方法，研究機(jī)體對抗原物質(zhì)反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)化規(guī)律。 雅洛1921年出生于紐約，1945年獲得核物理學(xué)博士學(xué)位，1975年當(dāng)選美國科學(xué)院院士。因?yàn)榘l(fā)明了放射性免疫分析法，雅洛獲得1976年的拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)獎，成為歷史上第一位獲得該獎的女性科學(xué)家。次年，她因?yàn)榕c她的合作者貝爾森博士合作開發(fā)了“針對多肽類激素的放射性免疫分析法”，而成為諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)

2、獎史上第二位女性獲獎?wù)摺?放射免疫分析法（又稱放射免疫測定或放射免疫測定法，簡稱放免或放免法） 原理 放射性同位素標(biāo)記的抗原（簡稱“標(biāo)記抗原”Ag*）和非標(biāo)記抗原（標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測抗原Ag）同時與數(shù)量有限的特異性抗體Ab之間發(fā)生競爭性結(jié)合（抗原抗體反應(yīng)）。 Ag*與Ag的免疫活性完全相同，對特異性Ab具有同樣的親和力。 當(dāng)Ag*和Ab為數(shù)量恒定時，Ag和Ag*的總量大于Ab上的有效結(jié)合點(diǎn)時，Ag*-Ab復(fù)合物的形成將隨著Ag量的增加而減少，而非結(jié)合的或游離的Ag*則隨著Ag數(shù)量的增加而增加（也就是所謂的競爭結(jié)合反應(yīng)），,*Ag-Ab與Ag的含量呈一定的函數(shù)關(guān)系。因此測定Ag*-Ab或Ag*即可推

3、出Ag的數(shù)量。 采用一種有效的分離方法，將*Ag-Ab和Ag-Ab復(fù)合物 (以 B表示)與*Ag、Ag(以F表示)分離,并測定B和F的放射性,可有以下規(guī)律:如樣品中Ag增多，則B的放射性降低，F(xiàn)的放射性增高，即Ag與B成反比。計(jì)算B/F或B/T值 (T=B+F),即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品中Ag的含量。 抗體：應(yīng)用免疫技術(shù)可以獲得特異性的抗體?？贵w的敏感度范 圍由其特異性和親和力決定，測定時所用的抗體稀釋度越低，則加入的量越多，測定的敏感度越低，可測范圍越寬。如加入抗體量少，則測定的敏感度提高，可測范圍變窄。一般在選定標(biāo)記抗原用量后，即可根據(jù)測定要求來選擇合適的抗血清用量。 放射性同位素： 有3

4、H、125I、131I 等，3H可以置換有機(jī)化合物中的氫，且不影響原有化學(xué)性質(zhì)。 * 3H半衰期長，能量低，便于防護(hù)，常用的標(biāo)記化合物有3H環(huán)磷酸鳥苷、3H環(huán)磷酸腺苷、3H睪丸酮等。 * 125I 和131I原子的化學(xué)性質(zhì)比較活潑,標(biāo)記方法簡便,不論多肽、蛋白質(zhì)或小分子半抗原均可進(jìn)行碘標(biāo)記。 * 有些半抗原不能直接用碘標(biāo)記, 常常接上一個酪氨酸再以碘標(biāo)記,以減少標(biāo)記抗原免疫化學(xué)活性的損失。常用的偶聯(lián)試劑：碳化二亞胺類、烷基氯甲酸酯類、二異氰酸鹽類及亞氨酸酯等。RIA法的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：靈敏、特異、簡便易行、用樣量少等，?？蓽y至皮摩爾。本法雖然也用放射性物質(zhì)，但一般都是在測試樣品時再加入標(biāo)記的同位素示

5、蹤物，此示蹤物的放射性強(qiáng)度極低，一般不會引起輻射損傷。缺點(diǎn)：有時會出現(xiàn)交叉反應(yīng)、假陽性反應(yīng)，組織樣品處理不夠迅速，不能滅活降解酶和鹽及pH有時會影響結(jié)果等。 應(yīng)用領(lǐng)域應(yīng)用領(lǐng)域 放射免疫分析法包括兩個方面的技術(shù)： 第一是生物學(xué)方面的。它利用特殊抗體的反應(yīng)，甄別所給定的有機(jī)物質(zhì)； 第二是物理學(xué)方面的。它將有放射性的原子引入有機(jī)物質(zhì)中，給這些有機(jī)物質(zhì)打上記號。 放射免疫分析法， 是一種靈敏度高、較簡便的測量法，幾乎可測定生物體內(nèi)任何物質(zhì)，包括生物體本身分泌的各種激素，病人口服或注射的各種藥物，一些病毒抗原等，已廣泛用于臨床常規(guī)檢驗(yàn)。內(nèi)分泌學(xué)中測定胰島素、催乳素、黃體化激素、促卵泡成熟激素、前列腺素等

6、，以研究激素的生理和藥理作用，目前較多用于研究激素與受體結(jié)合的機(jī)理。傳染病學(xué)方面廣泛用于乙型肝炎抗原的亞型分類測定。臨床免疫學(xué)上測定免疫球蛋白 G、免疫球蛋白E及抗脫氧核糖核酸抗體;進(jìn)一步的應(yīng)用包括甲狀腺球蛋白抗體、類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體及抗食物抗原抗體的測定。腫瘤學(xué)方面用于測定癌胚抗原、血纖維蛋白溶酶原、葉酸、維生素B12以及血纖維蛋白原和血纖維蛋白降解產(chǎn)物。根據(jù)已建立的人絨毛膜促性腺激素、癌胚抗原和甲胎蛋白的RIA結(jié)果,為有效地初篩和在手術(shù)后追蹤釋放這些蛋白質(zhì)的腫瘤提供了參考依據(jù)。在藥理學(xué)方面可測定嗎啡、氯丙嗪、苯妥英鈉、慶大霉素、地高辛、茶堿等，是檢測藥物中毒和藥物代謝的一個比較迅速和簡便的方

7、法。展望在本法的基礎(chǔ)上，近年來又發(fā)展了其他免疫分析法，用其他有特殊性質(zhì)的物質(zhì)代替放射性同位素來標(biāo)記抗原，同樣利用標(biāo)記與未標(biāo)記抗原與抗體的競爭性結(jié)合，然后用適宜方法測定。其中研究較多的是熒光免疫分析，采用熒光化合物標(biāo)記抗原，結(jié)合分離后通過熒光值的測定進(jìn)行定量分析。單克隆抗體monoclonalantibody（McAb) 1975年英國科學(xué)家Kohler和Milstein將產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞同腫瘤細(xì)胞融合,成功的建立了單克隆抗體技術(shù)，1984年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。 一，原理 每個B細(xì)胞僅識別一種抗原表位，腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可無限傳代。二，方法Kohler和Milstein設(shè)計(jì)了如下方法： 雜交瘤技術(shù)雜交瘤技術(shù)1，動物免疫 用特定的外來抗原對動物進(jìn)行一次或多次免疫,以刺激其能分泌對于該抗原的B淋巴細(xì)胞大量增殖,從而得到大量產(chǎn)生專一反應(yīng)的B淋巴細(xì)胞。2，細(xì)胞融合 B淋巴細(xì)胞在體外存活時間很短，骨髓瘤細(xì)胞不分泌任何免疫球蛋白,卻能在體外長期存活。將這兩種細(xì)胞的特性結(jié)合，得到既能分泌抗體又能在體外長期存活的細(xì)胞。雜交過程中會產(chǎn)生混合物,需要篩選出其中唯一有用的雜交瘤細(xì)胞3，雜交瘤細(xì)胞的篩選 用HAT培養(yǎng)基mAb的優(yōu)點(diǎn)：的優(yōu)點(diǎn)： 結(jié)構(gòu)單一結(jié)構(gòu)單一 純度高純度高 特異性強(qiáng)特異性強(qiáng) 制備成本低制備成本低應(yīng)用應(yīng)用*健康診斷試紙 1早孕檢測