微生物檢驗(yàn)技術(shù)B卷答案

1、微生物檢驗(yàn)技術(shù) B卷參考答案及評分標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)植物檢疫專業(yè)2009級 2011-2012 學(xué)年第一學(xué)期一、填空題(共20分，每空1分)。1. 分離純化與接種技術(shù) 微生物計(jì)數(shù)法2. 紅 無3. 大腸菌群 致病菌 4. 三氯化鐵 綠色5. 銅綠假單胞菌 大腸埃希菌 6. 靛基質(zhì) 尿素酶7. 鏈激酶 血凝塊溶解8血液、血清、腹水 乙型（ -）溶血鏈球菌9. 副溶血弧菌 綠10. 卵黃瓊脂平板 S.S瓊脂平板二、判斷題（共 10 分，每小題 1 分,用“”表示對，“”表示錯(cuò))。1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 三、名詞解釋題（共20分，每小題2分)。1、蘭氏分群：蘭氏（Lance

2、field)用溫?zé)岬南←}酸浸出C抗原，與特異性血清作沉淀反應(yīng)，將鏈球菌分為20個(gè)血清群（A-V，缺I和J）。2、暴烈發(fā)酵：產(chǎn)氣莢膜梭菌牛乳培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)能分解乳糖產(chǎn)酸，使酪蛋白凝固，同時(shí)生成大量氣體，將凝固的酪蛋白沖成海棉狀碎塊。管內(nèi)氣體常將覆蓋在液體上的凡士林層向上推擠，這種現(xiàn)象稱為“暴烈發(fā)酵”。3、增菌培養(yǎng)基：能夠給微生物提供較適當(dāng)?shù)纳L環(huán)境從而使微生物大量繁殖的培養(yǎng)基。4、糞大腸菌群：系一群需氧及兼性厭氧，在44.5培養(yǎng)24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣和分解色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。5、腸桿菌科細(xì)菌；是一大群生物學(xué)性狀近似的革蘭氏陰性桿菌。多數(shù)是腸道的正常菌群，少數(shù)為病原菌。腸桿菌

3、科細(xì)菌種類繁多，如埃希菌屬、沙門菌屬、克雷伯菌屬、變形桿菌屬等。6、類酵母型菌落：外觀似酵母菌落，但可見伸入培養(yǎng)基中的假菌絲，它是由伸長的芽生孢子形成，如白色念珠菌。（由于部分單細(xì)胞真菌出芽繁殖后，芽管延長不與母細(xì)胞脫離，而形成假菌絲，此假菌絲伸入培養(yǎng)基，形成表面似酵母型菌落、培養(yǎng)基內(nèi)有假菌絲的類酵母型菌落。）7、cytopathic effect（CPE）：是指細(xì)胞病變效應(yīng)，病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的結(jié)果，常常導(dǎo)致細(xì)胞損傷，甚至將其殺死，因而在低倍顯微鏡下可以看到不同現(xiàn)象，常見的為細(xì)胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等。8、病毒滴度：樣本中病毒的濃度，通過用系列稀釋的病毒接種細(xì)胞培養(yǎng)、雞胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物,檢

4、測病毒增殖的情況而確定?？捎肞FUmL表示。9、血凝試驗(yàn)：許多動(dòng)物病毒,如正黏病毒科、副黏病毒科、腺病毒科的成員,能夠凝集某些動(dòng)物(如雞、小鼠、豚鼠、人)的紅細(xì)胞。這些病毒含有可與紅細(xì)胞結(jié)合的蛋白質(zhì),引起紅細(xì)胞凝集。利用這種特性,可做血凝試驗(yàn)來檢測這些病毒的存在。10、中和試驗(yàn): 是病毒在活體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗(yàn)。四、簡答題(共30分，每小題5分)。1、 簡述真菌毒素的產(chǎn)生條件及檢驗(yàn)方法。參考答案：真菌毒素的產(chǎn)生條件：首先取決于菌株，其次依賴于外界環(huán)境，如基質(zhì)、溫度和濕度?；|(zhì)對霉菌的生長和產(chǎn)毒有一定的影響。一般而言，真菌產(chǎn)毒菌株主要在食物、糧食、飼草等植物上生

5、長產(chǎn)毒，在乳、蛋等動(dòng)物源基質(zhì)上產(chǎn)毒能力較低。霉菌的生長繁殖與溫度有密切關(guān)系，大多數(shù)最適溫度為2530，低于l0或高于40生長減弱，產(chǎn)毒素能力也會(huì)受到影響。基質(zhì)的水分、空氣的濕度與真菌的生長繁殖和產(chǎn)毒素能力密切相關(guān)，基質(zhì)含水量在17%18%時(shí)為真菌產(chǎn)毒素的最適條件。(3分)檢測真菌毒素有許多方法：如檢測黃曲霉毒素有生物學(xué)方法和ELISA法等。生物學(xué)方法主要用于檢測真菌毒素的毒性，如用雞胚、小白鼠做毒性試驗(yàn)，觀察動(dòng)物中毒死亡或出現(xiàn)腫瘤。ELISA法操作簡便，并具有安全快速高效、費(fèi)用低，適用于大批量標(biāo)本的篩選。(2分)2、 簡述食品微生物檢驗(yàn)的一般流程。參考答案：（1）樣品的采集與送檢 (1分)采集

6、的樣品必須具有代表性和均勻性，能全面反映被檢樣品的衛(wèi)生狀況。需要填寫采樣單。樣品的送檢要求：要快速運(yùn)送：不要超過3小時(shí)；易變質(zhì)的樣品要冷藏，若路途遙遠(yuǎn)，無需冷凍樣品可保持在15低溫下運(yùn)送；需保持冷凍狀態(tài)的樣品，可保存在泡沫塑料隔熱箱，維持0；送檢過程，要注意防污染、防散漏、防變質(zhì)；要填寫送檢申請單，以供檢驗(yàn)人員參考。（2）檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備 (1分)準(zhǔn)備好所需的各種儀器。按技術(shù)要求將各種玻璃儀器進(jìn)行清洗、烘干、包扎、滅菌，冷卻后送無菌室備用。準(zhǔn)備好所用的各種試劑，制備好普通營養(yǎng)瓊脂或其他選擇性培養(yǎng)基。做好無菌室或超凈工作臺的滅菌工作，提前1h滅菌3060min.工作衣、鞋、帽、等滅菌后備用。工作人員

7、進(jìn)入無菌室后，實(shí)驗(yàn)沒有完成之前不得隨便出入無菌室。（3）樣品的預(yù)處理 (1分)不同樣品要采用不同的處理方法，均需要在無菌條件下進(jìn)行操作。（4）常規(guī)微生物 (1分)測定細(xì)菌的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)。（5）致病微生物的檢測 (1分)致病菌既能夠引起人們發(fā)病的細(xì)菌。對不同的食品和不同的場合，應(yīng)該選擇一定的參考菌群進(jìn)行檢驗(yàn)。（6）提交檢驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告3、 細(xì)胞培養(yǎng)有哪些類型和方法，并比較它們的優(yōu)缺點(diǎn)？參考答案：(1) 原代細(xì)胞培養(yǎng) (1分)動(dòng)物組織經(jīng)胰蛋白酶消化，使細(xì)胞分散而得，單個(gè)細(xì)胞，再生長于培養(yǎng)器皿中。各種組織都能制備，最常用者為腎和睪丸等，胚胎和幼畜的細(xì)胞較易生長。優(yōu)點(diǎn)：病毒對天然宿主的細(xì)胞最易感

8、；適宜于病毒的分離。缺點(diǎn)是有時(shí)攜帶潛伏病毒。(2) 二倍體細(xì)胞株培養(yǎng) (2分)原代細(xì)胞長成單層后用胰蛋白酶或EDTA鈉將細(xì)胞從玻面消化下來，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞。然后加入新營養(yǎng)液，再分裝于玻瓶中長成單層。如此可以連續(xù)傳代，細(xì)胞的染色體數(shù)與原組織中一樣，仍為二倍體，因此稱為二倍體細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞碎片較少，潛伏病毒容易發(fā)現(xiàn)，對病毒的易感性與原代細(xì)胞差別不大。二倍體細(xì)胞可以大量培養(yǎng)，將多余細(xì)胞在液氮罐中貯存，隨時(shí)取用，甚為方便。(3) 傳代細(xì)胞系培養(yǎng) (2分)與上述兩類細(xì)胞不同，這類細(xì)胞可在體外無限制分裂下去，有些從腫瘤組織而來，有些從細(xì)胞株轉(zhuǎn)化而來。它們的染色體數(shù)目常不正常，稱為異倍體。優(yōu)點(diǎn)：容易

9、培養(yǎng)，生長迅速，傳代方便，隨時(shí)可以獲得。缺點(diǎn)：對病毒分離不夠敏感，也不能用此直接制備疫苗，因?yàn)榻臃N到動(dòng)物體內(nèi)有引起腫瘤的潛在危險(xiǎn)。在實(shí)驗(yàn)室傳代日久,有的可能污染。4、 簡述病毒感染單位的測定方法。參考答案：常用于病毒感染單位測定的技術(shù)有空斑試驗(yàn)、終點(diǎn)稀釋法、熒光-斑點(diǎn)試驗(yàn)、轉(zhuǎn)化試驗(yàn)等,最常用的是前兩種。（1分）空斑試驗(yàn)是一種檢查和準(zhǔn)確測定病毒滴度的方法。將稀釋的病毒懸液加入單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。病毒吸附后，再覆蓋一層融化的半固體營養(yǎng)瓊脂，使病毒在單層細(xì)胞培養(yǎng)中有限擴(kuò)散。結(jié)果是每一個(gè)有感染性的病毒在單層細(xì)胞中可產(chǎn)生一個(gè)局限性的感染灶。用活性染料 (如中性紅) 染色，則活細(xì)胞著色，受病毒感染而破壞的細(xì)

10、胞不著色，形成肉眼可見的空斑(plaque)。每個(gè)蝕斑是由一個(gè)感染性病毒顆粒形成的，稱作空斑形成單位 (plaque forming unit, PFU)。根據(jù)樣本的稀釋度和空斑數(shù),計(jì)算每毫升空斑形成單位(PFU),即可確定病毒的滴度。病毒懸液中的感染性病毒量的滴度可用PFUml表示。（2分）終點(diǎn)稀釋法用于測定幾乎所有種類的病毒滴度,包括某些不能形成空斑的病毒,并可用以確定病毒對動(dòng)物的毒力或毒價(jià)。將病毒做系列稀釋,選擇46個(gè)稀釋度,接種一定數(shù)量的細(xì)胞、雞胚或動(dòng)物,每個(gè)稀釋度做36個(gè)重復(fù)。使用細(xì)胞培養(yǎng),可通過CPE來判定組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID50)。在雞胚或動(dòng)物,是以死亡或發(fā)病來測定。以感

11、染發(fā)病作為指標(biāo)時(shí),可計(jì)箅半數(shù)感染量(ID50);以體溫反應(yīng)作為指標(biāo)時(shí),可計(jì)箅半數(shù)反應(yīng)量(RD50) 。用雞胚測定時(shí),可計(jì)算雞胚半數(shù)致死量(ELD50)或雞胚半數(shù)感染量(EID50) （2分）5、 簡述溶血試驗(yàn)的原理，寫出其試驗(yàn)方法、溶血類型及現(xiàn)象。參考答案：1、原理 （2分）某些細(xì)菌在代謝過程中能產(chǎn)生溶血素，可使人或動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生溶解，不同的細(xì)菌有不同的溶血反應(yīng)，借此可鑒別細(xì)菌。2、試驗(yàn)方法 （2分）（1）平板法將培養(yǎng)物接種于血平板培養(yǎng)基上，361 培養(yǎng)24 48h，觀察結(jié)果。溶血試驗(yàn)的溶血類型及現(xiàn)象（甲型）溶血: 菌落周圍出現(xiàn)較窄的半透明的草綠色溶血環(huán)。 （乙型）溶血: 菌落周圍出現(xiàn)較寬的

12、透明溶血環(huán)。（-丙型）溶血: 菌落周圍無溶血環(huán)。（2）試管法將待檢菌培養(yǎng)液與等量的2%羊血球混合，在361 培養(yǎng)16 18h，觀察結(jié)果。如溶血，培養(yǎng)液可出現(xiàn)透明狀。3、結(jié)果觀察與記錄 （1分）有溶血現(xiàn)象，為陽性，記+；無溶血現(xiàn)象，為陰性，記 -6、 金黃色葡萄球菌有哪些培養(yǎng)特性和生化特性？參考答案：（1）普通培養(yǎng)基上生長良好，在麥康凱瓊脂平板不生長。 （1分）（2）血平板上生長更佳，致病菌株溶血。 （1分）（3）產(chǎn)生金黃色色素。 （1分）（4）高度耐鹽：可在1015%NaCl肉湯中生長。 （1分）（5）分解葡、乳、麥、蔗糖， 產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，觸酶陽性，致病菌株能分解甘露醇。 （1分）五、問答題(共

13、20分，每小題10分)。1、 詳細(xì)敘述TSI（Triple Sugar Iron）試驗(yàn)的方法、原理和現(xiàn)象，并分析大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌在TSI瓊脂培養(yǎng)基上應(yīng)該產(chǎn)生何種現(xiàn)象？參考答案：1、三糖鐵（TSI）試驗(yàn)原理 （2分）三糖鐵（TSI）瓊脂培養(yǎng)基含有乳糖、葡萄糖、蔗糖為可發(fā)酵糖類，其產(chǎn)酸時(shí)通過酚紅指示劑測出，酸性呈黃色，堿性呈紅色；硫代硫酸鈉可被某些細(xì)菌還原為硫化氫，與硫酸亞鐵中的鐵鹽生成黑色硫化鐵。2、三糖鐵試驗(yàn)的現(xiàn)象 （2分）如果細(xì)菌可利用乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，培養(yǎng)基全部變黃；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之

14、細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面最后為紅色，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，仍保持黃色；如果細(xì)菌又能分解含硫化合物，產(chǎn)生硫化氫，培養(yǎng)基底部變黑。 3、試驗(yàn)方法 （2分）稱取本品64.5g,加熱溶解于1000ml蒸餾水中,加熱煮沸1分鐘,分裝于16mm150mm試管,121高壓滅菌15分鐘制成斜面長4-5cm,底部長2-3cm。以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置361培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。4、志賀氏菌都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多不發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)生H2S，培養(yǎng)基斜面為紅色，下部為黃色。大腸桿菌，能分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，大多數(shù)能分解乳糖，不產(chǎn)生

15、H2S，培養(yǎng)基全部變黃，底部被抬高。沙門氏菌，能分解葡萄糖，不發(fā)酵乳糖，大多數(shù)產(chǎn)生H2S，多數(shù)產(chǎn)氣，培養(yǎng)基底部變黑。 （4分） 2、 描述新生隱球菌的微生物學(xué)特性，檢驗(yàn)過程采用哪些方法？參考答案：微生物學(xué)特性：在組織中呈圓形或卵圓形，直徑一般在46m，外周有寬厚莢膜，莢膜較菌大13倍，折光性強(qiáng)，一般染色法不易著色而難以發(fā)現(xiàn)而得名。常采用墨汁負(fù)染色法，在黑色景下可鏡檢到透亮菌體和寬厚莢膜。（3分）檢驗(yàn)方法：(1) 標(biāo)本直接鏡檢（1分）用病人腦脊液作墨汁負(fù)染色檢查是診斷隱球菌腦膜炎最簡便、快速方法。常規(guī)細(xì)胞染色可發(fā)現(xiàn)隱球菌，但易誤診和漏診。如用PAS染色后新生隱球菌呈紅色。(2) 抗原檢測 （1分

16、）用乳膠凝集試驗(yàn)、ELISA、和單克隆抗體法等免疫學(xué)方法檢測隱球菌莢膜多糖特異性抗原，已成為臨床上的常規(guī)診斷方法。(3) 核酸檢測 （1分）可用痰液、支氣管吸出物等標(biāo)本核酸檢測方法有DNA探針法、PCR探針法等，用于檢測的探針、引物主要選自保守區(qū)的重復(fù)序列?？蓹z出新生隱球菌，并可區(qū)別類型，是新生變種還是格特變種。非致病性隱球菌不被檢出。(4) 分離培養(yǎng) （1分）將標(biāo)本接種在沙氏培養(yǎng)基上，病原性隱球菌在25和37生長，而非病原性隱球菌在37時(shí)不生長。培養(yǎng)25d后觀察菌落形態(tài)特點(diǎn)，并取菌落作印度墨汁負(fù)染色鏡檢。() 鑒定 （3分）1）酚氧化酶試驗(yàn)：接種L-多巴枸櫞酸鐵和咖啡酸培養(yǎng)基中，經(jīng)25d培養(yǎng)

17、，呈棕黑色菌落。2）脲酶試驗(yàn)：能產(chǎn)生脲酶分解尿素瓊脂培養(yǎng)基中的尿素形成NH4+和CO2，使pH升高，培養(yǎng)基可由黃色變粉紅色，而白假絲酵 母菌為陰性。3）糖同化及發(fā)酵試驗(yàn)：能同化葡萄糖、半乳糖、蔗糖和肌醇，但不能發(fā)酵多糖類，不能同化硝酸鹽。非致病性隱球菌不能同化肌醇。3、 如何進(jìn)行病毒的鑒定，詳述病毒鑒定的步驟與方法。參考答案：1、 初步鑒定 （4分）(1)根據(jù)臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)特征與標(biāo)本來源，初步判定屬于哪一類病毒。(2)根據(jù)生物學(xué)特性：細(xì)胞病變效應(yīng)；血吸附和血凝作用；干擾現(xiàn)象；(3)病毒的理化特性測定：代謝抑制法鑒定病毒核酸類型;脂溶性試驗(yàn);耐酸性試驗(yàn);包括病毒核酸型鑒定、耐酸性試驗(yàn)、脂溶劑

18、敏感性試驗(yàn)、耐熱性試驗(yàn)、胰蛋白酶敏感試驗(yàn)等。通常以細(xì)胞或雞胚培養(yǎng)為觀察體系,應(yīng)設(shè)立已知病毒為對照。鑒定病毒核酸型：代謝抑制法，添加氟脫氧尿核苷(FUDR)或類似物于病毒培養(yǎng)物中,病毒復(fù)制被抑制者,即為DNA病毒,否則為RNA病毒,也可用DNA酶或RNA酶分別作用,以判定核酸的性質(zhì)。綠豆芽酶可降解單股核酸,用它可進(jìn)一步鑒定核酸是單股或雙股?？芍苯佑眉兓牟《竞怂嵬ㄟ^電鏡觀察,對其進(jìn)行鑒定。但技術(shù)要求較高。近年來,PCR核酸測序技術(shù)的應(yīng)用使得病毒核酸型鑒定的可行性大為增加。2、 接種動(dòng)物的觀察：根據(jù)動(dòng)物的感染范圍,可初步推斷屬于何種病毒。接種動(dòng)物的觀察是非常重要的,通過觀察試驗(yàn)動(dòng)物的反應(yīng)有時(shí)也可初步鑒定何種病毒。每天都需要觀察,有時(shí)1d需要觀察數(shù)次。（2分）3、 最終鑒定：病毒的最終鑒定需要免疫學(xué)方法、電子顯微鏡與免疫電子顯微鏡技術(shù)等特異性方法加以鑒