第八章病原學診斷與防治

1、會計學1第八章病原學診斷與防治第八章病原學診斷與防治第1頁/共39頁第一節(jié)第一節(jié) 細細 菌菌 學學 診診 斷斷細菌學診斷（細菌學診斷（bacteriological diagnosis）：）：檢測病原菌及其抗原、產物或核酸檢測病原菌及其抗原、產物或核酸血清學診斷（血清學診斷（serological diagnosis）:檢測患者血清中特異抗體檢測患者血清中特異抗體第2頁/共39頁 嚴格嚴格無菌操作無菌操作，避免標本被污染，避免標本被污染 根據不同疾病以及疾病的不同時期采集不同標本根據不同疾病以及疾病的不同時期采集不同標本 盡可能在疾病早期及盡可能在疾病早期及使用抗菌藥物之前使用抗菌藥物之前采集

2、標本采集標本 采集的標本必須盡快送檢，多數菌可采集的標本必須盡快送檢，多數菌可冷藏送運冷藏送運 標本作好標記，詳細填寫化驗單標本作好標記，詳細填寫化驗單1、標本（、標本（specimens）標本采集與送檢過程中應遵循的原則：標本采集與送檢過程中應遵循的原則：一、病原菌檢測一、病原菌檢測第3頁/共39頁顯微鏡放大法：顯微鏡放大法： 普通光學顯微鏡普通光學顯微鏡 (LM) ：分辨率，分辨率，0.25m 電子顯微鏡：電子顯微鏡：分辨率，分辨率，1nm掃描電子顯微鏡（掃描電子顯微鏡（SEM）：）：透射電子顯微鏡（透射電子顯微鏡（TEM）: 2、細菌形態(tài)與結構檢查：、細菌形態(tài)與結構檢查：對于形態(tài)與染色上

3、具有特征的病原菌對于形態(tài)與染色上具有特征的病原菌形態(tài)、排列和染色性形態(tài)、排列和染色性第4頁/共39頁掃描電子顯微鏡（掃描電子顯微鏡（SEM）：）：細胞或病毒表面特征細胞或病毒表面特征 1000 10，000 透射電子顯微鏡（透射電子顯微鏡（TEM）: 病毒或細胞的內部超微結構病毒或細胞的內部超微結構10,000 100,000普通光學顯微鏡普通光學顯微鏡 (LM) :草履蟲草履蟲第5頁/共39頁染色法：染色劑與細菌細胞質的結合染色法：染色劑與細菌細胞質的結合常用：堿性染色劑（有色的陽離子）常用：堿性染色劑（有色的陽離子） 酸性染色劑（負染）酸性染色劑（負染）單染色法單染色法鑒別染色法：鑒別染色

4、法： 革蘭染色法；革蘭染色法；原理、步驟、意義原理、步驟、意義 抗酸染色法抗酸染色法鞭毛染色等特殊染色法鞭毛染色等特殊染色法第6頁/共39頁3、分離和鑒定：、分離和鑒定：根據不同疾病采取不同標本如血、尿、糞便、根據不同疾病采取不同標本如血、尿、糞便、 咽拭子以及腦脊液等進行細菌的分離和鑒定，是咽拭子以及腦脊液等進行細菌的分離和鑒定，是確診細菌性確診細菌性 感染最可靠的方法感染最可靠的方法鑒定的主要內容：鑒定的主要內容：1）培養(yǎng)特征培養(yǎng)特征：根據細菌所需營養(yǎng)、生長條件、菌落特征：根據細菌所需營養(yǎng)、生長條件、菌落特征初步診斷初步診斷2）形態(tài)特征形態(tài)特征：細菌的形態(tài)、大小、排列、染色及特殊結構：細菌

5、的形態(tài)、大小、排列、染色及特殊結構3）生化反應生化反應：細菌生化反應的特點可作為鑒別細菌的依據：細菌生化反應的特點可作為鑒別細菌的依據4）血清學鑒定：血清學鑒定：已知抗體已知抗體 未知細菌抗原，以確定細菌的種、型未知細菌抗原，以確定細菌的種、型5）動物實驗：動物實驗：測定細菌的毒力，及分離病原菌測定細菌的毒力，及分離病原菌6）藥物敏感試驗；藥物敏感試驗；第7頁/共39頁溶血性鏈球菌血平板上的溶血溶血性鏈球菌血平板上的溶血第8頁/共39頁IMViC試驗試驗吲哚試驗吲哚試驗 + 甲基紅試驗甲基紅試驗 + VP試驗試驗 +枸櫞酸鹽利用試驗枸櫞酸鹽利用試驗 +大腸桿菌大腸桿菌 產氣桿菌產氣桿菌第9頁/

6、共39頁標本采集標本送檢初次涂片染色初次涂片染色第10頁/共39頁純培養(yǎng)后再次涂片染色純培養(yǎng)后再次涂片染色細菌的分離培養(yǎng)細菌的分離培養(yǎng)挑選可疑菌落進行生化，免疫學，挑選可疑菌落進行生化，免疫學，分子生物學檢測分子生物學檢測第11頁/共39頁4、病原菌抗原的檢測、病原菌抗原的檢測常用于細菌學診斷的免疫學技術常用于細菌學診斷的免疫學技術1）沉淀反應）沉淀反應2）協同凝集試驗）協同凝集試驗3）免疫熒光法）免疫熒光法4）對流免疫電泳）對流免疫電泳5）酶免疫測定）酶免疫測定6）免疫印跡技術）免疫印跡技術5、其他檢測法、其他檢測法：PCR技術檢測細菌核酸技術檢測細菌核酸第12頁/共39頁二、血清學診斷二、

7、血清學診斷原理：原理：用已知抗原檢測患者血清或其他體液中未知抗體及其量的用已知抗原檢測患者血清或其他體液中未知抗體及其量的變化變化應用：應用：抗原性較強的致病菌和病程較長的傳染病診斷抗原性較強的致病菌和病程較長的傳染病診斷通常采取雙份血清，如果恢復期或通常采取雙份血清，如果恢復期或1周后血清抗體效價周后血清抗體效價比早期升高比早期升高4倍以上時，則可確認為現癥感染倍以上時，則可確認為現癥感染常用方法：常用方法：直接凝集試驗（診斷傷寒、副傷寒的肥達試驗）直接凝集試驗（診斷傷寒、副傷寒的肥達試驗）中和試驗（診斷鏈球菌性風濕病的抗中和試驗（診斷鏈球菌性風濕病的抗O試驗）試驗）乳膠凝集試驗、補體結合試

8、驗乳膠凝集試驗、補體結合試驗ELISA：技術簡便、特異、快速、靈敏，應用廣泛：技術簡便、特異、快速、靈敏，應用廣泛第13頁/共39頁一、標本的采取與送檢一、標本的采取與送檢注意：注意： 1、對本身帶有雜菌或易受污染的標本，要進行病、對本身帶有雜菌或易受污染的標本，要進行病毒分離培養(yǎng)時，應使用抗生素（青霉素，鏈霉素等毒分離培養(yǎng)時，應使用抗生素（青霉素，鏈霉素等） 2、標本應、標本應低溫保存低溫保存并盡快送檢并盡快送檢 3、血清學診斷標本的采取應在發(fā)病初期和病后、血清學診斷標本的采取應在發(fā)病初期和病后23周各取周各取1份血清，以便對比雙份血清抗體效價的動份血清，以便對比雙份血清抗體效價的動態(tài)變化態(tài)

9、變化第14頁/共39頁第15頁/共39頁（一）病毒的分離（一）病毒的分離1、動物接種、動物接種2、雞胚培養(yǎng)：、雞胚培養(yǎng)：目前主要用于分離流感病毒目前主要用于分離流感病毒流感病毒初次分離接種于羊膜腔流感病毒初次分離接種于羊膜腔流感病毒的再培養(yǎng)接種于尿囊腔流感病毒的再培養(yǎng)接種于尿囊腔3、細胞培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)第16頁/共39頁細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng) 病毒分離鑒定中最常用的方法病毒分離鑒定中最常用的方法按細胞的生長方式分類：按細胞的生長方式分類：單層培養(yǎng)單層培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)按細胞的來源、染色體特征和傳代次數分類：按細胞的來源、染色體特征和傳代次數分類：原代細胞：原代細胞：來源于動物、雞胚或引產人胚

10、組織細胞來源于動物、雞胚或引產人胚組織細胞二倍體細胞：二倍體細胞：細胞在體外分裂細胞在體外分裂50100代后仍保持代后仍保持2倍倍染色體數目的單層細胞染色體數目的單層細胞常用于人類病毒的分離或病毒疫苗的生產常用于人類病毒的分離或病毒疫苗的生產傳代細胞系：傳代細胞系：多由癌細胞或多由癌細胞或2倍體細胞突變而來，能在倍體細胞突變而來，能在體外持續(xù)傳代體外持續(xù)傳代第17頁/共39頁病毒在培養(yǎng)細胞中增殖的指標病毒在培養(yǎng)細胞中增殖的指標1. 細胞的變化細胞的變化 細胞病變效應細胞病變效應 （CPE）：）：有些病毒在細胞內增殖時引起有些病毒在細胞內增殖時引起 的特有的細胞病變：細胞變圓、聚集、壞死、溶解或

11、脫落的特有的細胞病變：細胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落多核巨細胞（融合細胞）形成多核巨細胞（融合細胞）形成：有些病毒如麻疹病毒、有些病毒如麻疹病毒、 巨細胞病毒等作用于細胞膜，使鄰近的細胞融合，形成多巨細胞病毒等作用于細胞膜，使鄰近的細胞融合，形成多 核巨細胞。核巨細胞。胞質或核內包涵體（胞質或核內包涵體（inclusion body）的形成）的形成狂犬病病毒、巨細胞病毒狂犬病病毒、巨細胞病毒第18頁/共39頁1、CPE 正常細胞正常細胞病變細胞病變細胞第19頁/共39頁巨細胞病毒感染細胞形成的包涵體巨細胞病毒感染細胞形成的包涵體 貓頭鷹眼狀貓頭鷹眼狀第20頁/共39頁2. 紅細胞吸附（紅細胞

12、吸附（hemadsorption, HAd）流感病毒等感染細胞后，由于細胞膜上出流感病毒等感染細胞后，由于細胞膜上出現了血凝素（現了血凝素（HA），具有吸附脊椎動物），具有吸附脊椎動物（豚鼠、雞、猴等）紅細胞的能力，這一（豚鼠、雞、猴等）紅細胞的能力，這一現象稱為現象稱為紅細胞吸附紅細胞吸附。常用來鑒定具有常用來鑒定具有HA的黏病毒的黏病毒 或副黏病毒或副黏病毒的增殖的增殖第21頁/共39頁3.干擾現象（干擾現象（interference）：）：某些病毒感染細胞時不出現某些病毒感染細胞時不出現CPE或其他易于或其他易于 測出的變化（如測出的變化（如HAd），但能干擾其后感染的），但能干擾其后感

13、染的 另一病毒的增殖，從而阻抑后者所特有的另一病毒的增殖，從而阻抑后者所特有的CPE4.細胞代謝的改變：細胞代謝的改變： 病毒感染細胞的結果可使培養(yǎng)液的病毒感染細胞的結果可使培養(yǎng)液的pH改變改變。培養(yǎng)環(huán)境的生化改變也可作為判斷病毒增殖培養(yǎng)環(huán)境的生化改變也可作為判斷病毒增殖 的指標的指標第22頁/共39頁（二）病毒的數量與感染性的測定：（二）病毒的數量與感染性的測定：1、蝕斑測定法、蝕斑測定法2、ID50 或或 TCID5050%組織細胞感染量：組織細胞感染量：病毒感染細胞后，引起病毒感染細胞后，引起 50% 發(fā)生死亡或病變的病發(fā)生死亡或病變的病毒量毒量。病毒感染單層細胞后，產生的局限性病灶，稱

14、蝕斑。病毒感染單層細胞后，產生的局限性病灶，稱蝕斑。每個蝕斑是由一個感染性病毒體復制，使細胞病變形成的，稱蝕斑形成單每個蝕斑是由一個感染性病毒體復制，使細胞病變形成的，稱蝕斑形成單位（位（PFU）。）。通過計算通過計算PFU數量來得出感染性病毒體的數量數量來得出感染性病毒體的數量第23頁/共39頁（三）新分離病毒的鑒定：（三）新分離病毒的鑒定：1. 病毒核酸類型的測定病毒核酸類型的測定2. 理化性狀的檢測理化性狀的檢測3. 形態(tài)學觀察形態(tài)學觀察4. 血清學鑒定血清學鑒定5. 基因測序和生物對比基因測序和生物對比第24頁/共39頁第25頁/共39頁中和試驗中和試驗：病毒在活體內或細胞培養(yǎng)中被特異

15、性抗體中和而失去感染性的一種試驗病毒在活體內或細胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗 患者血清中抗體的消長情況患者血清中抗體的消長情況中和抗體：作用于病毒表面抗原的抗體中和抗體：作用于病毒表面抗原的抗體中和試驗是用于人群免疫情況的調查，臨床診斷中不常用中和試驗是用于人群免疫情況的調查，臨床診斷中不常用第26頁/共39頁補體結合試驗：補體結合試驗：用已知病毒可溶性補體抗原來檢測病人用已知病毒可溶性補體抗原來檢測病人血清中相應的補體抗體。血清中相應的補體抗體。補體抗原：補體抗原：病毒的內部抗原病毒的內部抗原補體抗體補體抗體的出現可作為的出現可作為近期感染近期感染的指標的指標第27頁/共3

16、9頁血凝抑制試驗（血凝抑制試驗（HI, test）:具有具有HA的病毒能凝集雞、豚鼠、人等的紅細胞的病毒能凝集雞、豚鼠、人等的紅細胞，程血凝現象。這種現象能被相應抗體抑制，稱，程血凝現象。這種現象能被相應抗體抑制，稱HI試試驗驗第28頁/共39頁主要是從含有病毒標本及感染機體的血清中主要是從含有病毒標本及感染機體的血清中檢測病毒顆粒、檢測病毒顆粒、蛋白抗原、蛋白抗原、 IgM抗體和核酸抗體和核酸第29頁/共39頁第三節(jié)第三節(jié) 真菌學診斷真菌學診斷第30頁/共39頁 細菌產生的抗生素：多粘菌素細菌產生的抗生素：多粘菌素按生物來源分類按生物來源分類 真菌產生的抗生素：青霉素真菌產生的抗生素：青霉素

17、 放線菌產生的抗生素：鏈霉放線菌產生的抗生素：鏈霉素素 - -內酰胺類內酰胺類 大環(huán)內酯類大環(huán)內酯類 氨基糖苷類氨基糖苷類按化學結構和性質分類按化學結構和性質分類 四環(huán)類四環(huán)類 氯霉素類氯霉素類 人工合成類人工合成類 其他抗生素類其他抗生素類 （一）抗菌藥物的種類（一）抗菌藥物的種類第31頁/共39頁（二）抗菌藥物的主要作用機制（二）抗菌藥物的主要作用機制影響細胞壁的合成影響細胞壁的合成（青霉素青霉素）影響細胞膜的功能（影響細胞膜的功能（多黏菌素多黏菌素）影響蛋白質的合成影響蛋白質的合成（鏈霉素（鏈霉素30S亞基亞基, 氯霉素氯霉素 50S亞基）亞基）影響核影響核酸代謝酸代謝（喹諾酮（喹諾酮）

18、第32頁/共39頁影響細胞壁的合成影響細胞壁的合成 1、 細菌細胞膜上有細菌細胞膜上有6種青霉素結合蛋白（種青霉素結合蛋白（PBP），在肽聚），在肽聚 糖的合成中起重要糖的合成中起重要作用作用 2、 青霉素（與青霉素（與 D 丙氨酸丙氨酸 結構相似）能競爭性地結合其中結構相似）能競爭性地結合其中 的轉肽酶，阻滯此的轉肽酶，阻滯此酶的功能酶的功能青霉素類的抗生素抑制肽聚糖的合成青霉素類的抗生素抑制肽聚糖的合成，對生長旺盛的細菌效果明顯，對生長旺盛的細菌效果明顯第33頁/共39頁四、病毒感染的治療四、病毒感染的治療五、真菌的治療五、真菌的治療第34頁/共39頁顯微鏡放大法：顯微鏡放大法： 普通光學

19、顯微鏡普通光學顯微鏡 (LM) ：分辨率，分辨率，0.25m 電子顯微鏡：電子顯微鏡：分辨率，分辨率，1nm掃描電子顯微鏡（掃描電子顯微鏡（SEM）：）：透射電子顯微鏡（透射電子顯微鏡（TEM）: 2、細菌形態(tài)與結構檢查：、細菌形態(tài)與結構檢查：對于形態(tài)與染色上具有特征的病原菌對于形態(tài)與染色上具有特征的病原菌形態(tài)、排列和染色性形態(tài)、排列和染色性第35頁/共39頁（一）病毒的分離（一）病毒的分離1、動物接種、動物接種2、雞胚培養(yǎng)：、雞胚培養(yǎng)：目前主要用于分離流感病毒目前主要用于分離流感病毒流感病毒初次分離接種于羊膜腔流感病毒初次分離接種于羊膜腔流感病毒的再培養(yǎng)接種于尿囊腔流感病毒的再培養(yǎng)接種于尿囊腔3、細胞培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)第36頁/共39頁細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng) 病毒分離鑒定中最常用的方法病毒分離鑒定中最