第八章病原學(xué)診斷與防治

1、會(huì)計(jì)學(xué)1第八章病原學(xué)診斷與防治第八章病原學(xué)診斷與防治第1頁/共39頁第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)細(xì) 菌菌 學(xué)學(xué) 診診 斷斷細(xì)菌學(xué)診斷（細(xì)菌學(xué)診斷（bacteriological diagnosis）：）：檢測病原菌及其抗原、產(chǎn)物或核酸檢測病原菌及其抗原、產(chǎn)物或核酸血清學(xué)診斷（血清學(xué)診斷（serological diagnosis）:檢測患者血清中特異抗體檢測患者血清中特異抗體第2頁/共39頁 嚴(yán)格嚴(yán)格無菌操作無菌操作，避免標(biāo)本被污染，避免標(biāo)本被污染 根據(jù)不同疾病以及疾病的不同時(shí)期采集不同標(biāo)本根據(jù)不同疾病以及疾病的不同時(shí)期采集不同標(biāo)本 盡可能在疾病早期及盡可能在疾病早期及使用抗菌藥物之前使用抗菌藥物之前采集

2、標(biāo)本采集標(biāo)本 采集的標(biāo)本必須盡快送檢，多數(shù)菌可采集的標(biāo)本必須盡快送檢，多數(shù)菌可冷藏送運(yùn)冷藏送運(yùn) 標(biāo)本作好標(biāo)記，詳細(xì)填寫化驗(yàn)單標(biāo)本作好標(biāo)記，詳細(xì)填寫化驗(yàn)單1、標(biāo)本（、標(biāo)本（specimens）標(biāo)本采集與送檢過程中應(yīng)遵循的原則：標(biāo)本采集與送檢過程中應(yīng)遵循的原則：一、病原菌檢測一、病原菌檢測第3頁/共39頁顯微鏡放大法：顯微鏡放大法： 普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡 (LM) ：分辨率，分辨率，0.25m 電子顯微鏡：電子顯微鏡：分辨率，分辨率，1nm掃描電子顯微鏡（掃描電子顯微鏡（SEM）：）：透射電子顯微鏡（透射電子顯微鏡（TEM）: 2、細(xì)菌形態(tài)與結(jié)構(gòu)檢查：、細(xì)菌形態(tài)與結(jié)構(gòu)檢查：對(duì)于形態(tài)與染色上

3、具有特征的病原菌對(duì)于形態(tài)與染色上具有特征的病原菌形態(tài)、排列和染色性形態(tài)、排列和染色性第4頁/共39頁掃描電子顯微鏡（掃描電子顯微鏡（SEM）：）：細(xì)胞或病毒表面特征細(xì)胞或病毒表面特征 1000 10，000 透射電子顯微鏡（透射電子顯微鏡（TEM）: 病毒或細(xì)胞的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)病毒或細(xì)胞的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)10,000 100,000普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡 (LM) :草履蟲草履蟲第5頁/共39頁染色法：染色劑與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的結(jié)合染色法：染色劑與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的結(jié)合常用：堿性染色劑（有色的陽離子）常用：堿性染色劑（有色的陽離子） 酸性染色劑（負(fù)染）酸性染色劑（負(fù)染）單染色法單染色法鑒別染色法：鑒別染色

4、法： 革蘭染色法；革蘭染色法；原理、步驟、意義原理、步驟、意義 抗酸染色法抗酸染色法鞭毛染色等特殊染色法鞭毛染色等特殊染色法第6頁/共39頁3、分離和鑒定：、分離和鑒定：根據(jù)不同疾病采取不同標(biāo)本如血、尿、糞便、根據(jù)不同疾病采取不同標(biāo)本如血、尿、糞便、 咽拭子以及腦脊液等進(jìn)行細(xì)菌的分離和鑒定，是咽拭子以及腦脊液等進(jìn)行細(xì)菌的分離和鑒定，是確診細(xì)菌性確診細(xì)菌性 感染最可靠的方法感染最可靠的方法鑒定的主要內(nèi)容：鑒定的主要內(nèi)容：1）培養(yǎng)特征培養(yǎng)特征：根據(jù)細(xì)菌所需營養(yǎng)、生長條件、菌落特征：根據(jù)細(xì)菌所需營養(yǎng)、生長條件、菌落特征初步診斷初步診斷2）形態(tài)特征形態(tài)特征：細(xì)菌的形態(tài)、大小、排列、染色及特殊結(jié)構(gòu)：細(xì)菌

5、的形態(tài)、大小、排列、染色及特殊結(jié)構(gòu)3）生化反應(yīng)生化反應(yīng)：細(xì)菌生化反應(yīng)的特點(diǎn)可作為鑒別細(xì)菌的依據(jù)：細(xì)菌生化反應(yīng)的特點(diǎn)可作為鑒別細(xì)菌的依據(jù)4）血清學(xué)鑒定：血清學(xué)鑒定：已知抗體已知抗體 未知細(xì)菌抗原，以確定細(xì)菌的種、型未知細(xì)菌抗原，以確定細(xì)菌的種、型5）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：測定細(xì)菌的毒力，及分離病原菌測定細(xì)菌的毒力，及分離病原菌6）藥物敏感試驗(yàn)；藥物敏感試驗(yàn)；第7頁/共39頁溶血性鏈球菌血平板上的溶血溶血性鏈球菌血平板上的溶血第8頁/共39頁IMViC試驗(yàn)試驗(yàn)吲哚試驗(yàn)吲哚試驗(yàn) + 甲基紅試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn) + VP試驗(yàn)試驗(yàn) +枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn) +大腸桿菌大腸桿菌 產(chǎn)氣桿菌產(chǎn)氣桿菌第9頁/

6、共39頁標(biāo)本采集標(biāo)本送檢初次涂片染色初次涂片染色第10頁/共39頁純培養(yǎng)后再次涂片染色純培養(yǎng)后再次涂片染色細(xì)菌的分離培養(yǎng)細(xì)菌的分離培養(yǎng)挑選可疑菌落進(jìn)行生化，免疫學(xué)，挑選可疑菌落進(jìn)行生化，免疫學(xué)，分子生物學(xué)檢測分子生物學(xué)檢測第11頁/共39頁4、病原菌抗原的檢測、病原菌抗原的檢測常用于細(xì)菌學(xué)診斷的免疫學(xué)技術(shù)常用于細(xì)菌學(xué)診斷的免疫學(xué)技術(shù)1）沉淀反應(yīng)）沉淀反應(yīng)2）協(xié)同凝集試驗(yàn)）協(xié)同凝集試驗(yàn)3）免疫熒光法）免疫熒光法4）對(duì)流免疫電泳）對(duì)流免疫電泳5）酶免疫測定）酶免疫測定6）免疫印跡技術(shù)）免疫印跡技術(shù)5、其他檢測法、其他檢測法：PCR技術(shù)檢測細(xì)菌核酸技術(shù)檢測細(xì)菌核酸第12頁/共39頁二、血清學(xué)診斷二、

7、血清學(xué)診斷原理：原理：用已知抗原檢測患者血清或其他體液中未知抗體及其量的用已知抗原檢測患者血清或其他體液中未知抗體及其量的變化變化應(yīng)用：應(yīng)用：抗原性較強(qiáng)的致病菌和病程較長的傳染病診斷抗原性較強(qiáng)的致病菌和病程較長的傳染病診斷通常采取雙份血清，如果恢復(fù)期或通常采取雙份血清，如果恢復(fù)期或1周后血清抗體效價(jià)周后血清抗體效價(jià)比早期升高比早期升高4倍以上時(shí)，則可確認(rèn)為現(xiàn)癥感染倍以上時(shí)，則可確認(rèn)為現(xiàn)癥感染常用方法：常用方法：直接凝集試驗(yàn)（診斷傷寒、副傷寒的肥達(dá)試驗(yàn)）直接凝集試驗(yàn)（診斷傷寒、副傷寒的肥達(dá)試驗(yàn)）中和試驗(yàn)（診斷鏈球菌性風(fēng)濕病的抗中和試驗(yàn)（診斷鏈球菌性風(fēng)濕病的抗O試驗(yàn)）試驗(yàn)）乳膠凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試

8、驗(yàn)乳膠凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)ELISA：技術(shù)簡便、特異、快速、靈敏，應(yīng)用廣泛：技術(shù)簡便、特異、快速、靈敏，應(yīng)用廣泛第13頁/共39頁一、標(biāo)本的采取與送檢一、標(biāo)本的采取與送檢注意：注意： 1、對(duì)本身帶有雜菌或易受污染的標(biāo)本，要進(jìn)行病、對(duì)本身帶有雜菌或易受污染的標(biāo)本，要進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)使用抗生素（青霉素，鏈霉素等毒分離培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)使用抗生素（青霉素，鏈霉素等） 2、標(biāo)本應(yīng)、標(biāo)本應(yīng)低溫保存低溫保存并盡快送檢并盡快送檢 3、血清學(xué)診斷標(biāo)本的采取應(yīng)在發(fā)病初期和病后、血清學(xué)診斷標(biāo)本的采取應(yīng)在發(fā)病初期和病后23周各取周各取1份血清，以便對(duì)比雙份血清抗體效價(jià)的動(dòng)份血清，以便對(duì)比雙份血清抗體效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化態(tài)

9、變化第14頁/共39頁第15頁/共39頁（一）病毒的分離（一）病毒的分離1、動(dòng)物接種、動(dòng)物接種2、雞胚培養(yǎng)：、雞胚培養(yǎng)：目前主要用于分離流感病毒目前主要用于分離流感病毒流感病毒初次分離接種于羊膜腔流感病毒初次分離接種于羊膜腔流感病毒的再培養(yǎng)接種于尿囊腔流感病毒的再培養(yǎng)接種于尿囊腔3、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)第16頁/共39頁細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 病毒分離鑒定中最常用的方法病毒分離鑒定中最常用的方法按細(xì)胞的生長方式分類：按細(xì)胞的生長方式分類：單層培養(yǎng)單層培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)按細(xì)胞的來源、染色體特征和傳代次數(shù)分類：按細(xì)胞的來源、染色體特征和傳代次數(shù)分類：原代細(xì)胞：原代細(xì)胞：來源于動(dòng)物、雞胚或引產(chǎn)人胚

10、組織細(xì)胞來源于動(dòng)物、雞胚或引產(chǎn)人胚組織細(xì)胞二倍體細(xì)胞：二倍體細(xì)胞：細(xì)胞在體外分裂細(xì)胞在體外分裂50100代后仍保持代后仍保持2倍倍染色體數(shù)目的單層細(xì)胞染色體數(shù)目的單層細(xì)胞常用于人類病毒的分離或病毒疫苗的生產(chǎn)常用于人類病毒的分離或病毒疫苗的生產(chǎn)傳代細(xì)胞系：傳代細(xì)胞系：多由癌細(xì)胞或多由癌細(xì)胞或2倍體細(xì)胞突變而來，能在倍體細(xì)胞突變而來，能在體外持續(xù)傳代體外持續(xù)傳代第17頁/共39頁病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的指標(biāo)病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的指標(biāo)1. 細(xì)胞的變化細(xì)胞的變化 細(xì)胞病變效應(yīng)細(xì)胞病變效應(yīng) （CPE）：）：有些病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖時(shí)引起有些病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖時(shí)引起 的特有的細(xì)胞病變：細(xì)胞變圓、聚集、壞死、溶解或

11、脫落的特有的細(xì)胞病變：細(xì)胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落多核巨細(xì)胞（融合細(xì)胞）形成多核巨細(xì)胞（融合細(xì)胞）形成：有些病毒如麻疹病毒、有些病毒如麻疹病毒、 巨細(xì)胞病毒等作用于細(xì)胞膜，使鄰近的細(xì)胞融合，形成多巨細(xì)胞病毒等作用于細(xì)胞膜，使鄰近的細(xì)胞融合，形成多 核巨細(xì)胞。核巨細(xì)胞。胞質(zhì)或核內(nèi)包涵體（胞質(zhì)或核內(nèi)包涵體（inclusion body）的形成）的形成狂犬病病毒、巨細(xì)胞病毒狂犬病病毒、巨細(xì)胞病毒第18頁/共39頁1、CPE 正常細(xì)胞正常細(xì)胞病變細(xì)胞病變細(xì)胞第19頁/共39頁巨細(xì)胞病毒感染細(xì)胞形成的包涵體巨細(xì)胞病毒感染細(xì)胞形成的包涵體 貓頭鷹眼狀貓頭鷹眼狀第20頁/共39頁2. 紅細(xì)胞吸附（紅細(xì)胞

12、吸附（hemadsorption, HAd）流感病毒等感染細(xì)胞后，由于細(xì)胞膜上出流感病毒等感染細(xì)胞后，由于細(xì)胞膜上出現(xiàn)了血凝素（現(xiàn)了血凝素（HA），具有吸附脊椎動(dòng)物），具有吸附脊椎動(dòng)物（豚鼠、雞、猴等）紅細(xì)胞的能力，這一（豚鼠、雞、猴等）紅細(xì)胞的能力，這一現(xiàn)象稱為現(xiàn)象稱為紅細(xì)胞吸附紅細(xì)胞吸附。常用來鑒定具有常用來鑒定具有HA的黏病毒的黏病毒 或副黏病毒或副黏病毒的增殖的增殖第21頁/共39頁3.干擾現(xiàn)象（干擾現(xiàn)象（interference）：）：某些病毒感染細(xì)胞時(shí)不出現(xiàn)某些病毒感染細(xì)胞時(shí)不出現(xiàn)CPE或其他易于或其他易于 測出的變化（如測出的變化（如HAd），但能干擾其后感染的），但能干擾其后感

13、染的 另一病毒的增殖，從而阻抑后者所特有的另一病毒的增殖，從而阻抑后者所特有的CPE4.細(xì)胞代謝的改變：細(xì)胞代謝的改變： 病毒感染細(xì)胞的結(jié)果可使培養(yǎng)液的病毒感染細(xì)胞的結(jié)果可使培養(yǎng)液的pH改變改變。培養(yǎng)環(huán)境的生化改變也可作為判斷病毒增殖培養(yǎng)環(huán)境的生化改變也可作為判斷病毒增殖 的指標(biāo)的指標(biāo)第22頁/共39頁（二）病毒的數(shù)量與感染性的測定：（二）病毒的數(shù)量與感染性的測定：1、蝕斑測定法、蝕斑測定法2、ID50 或或 TCID5050%組織細(xì)胞感染量：組織細(xì)胞感染量：病毒感染細(xì)胞后，引起病毒感染細(xì)胞后，引起 50% 發(fā)生死亡或病變的病發(fā)生死亡或病變的病毒量毒量。病毒感染單層細(xì)胞后，產(chǎn)生的局限性病灶，稱

14、蝕斑。病毒感染單層細(xì)胞后，產(chǎn)生的局限性病灶，稱蝕斑。每個(gè)蝕斑是由一個(gè)感染性病毒體復(fù)制，使細(xì)胞病變形成的，稱蝕斑形成單每個(gè)蝕斑是由一個(gè)感染性病毒體復(fù)制，使細(xì)胞病變形成的，稱蝕斑形成單位（位（PFU）。）。通過計(jì)算通過計(jì)算PFU數(shù)量來得出感染性病毒體的數(shù)量數(shù)量來得出感染性病毒體的數(shù)量第23頁/共39頁（三）新分離病毒的鑒定：（三）新分離病毒的鑒定：1. 病毒核酸類型的測定病毒核酸類型的測定2. 理化性狀的檢測理化性狀的檢測3. 形態(tài)學(xué)觀察形態(tài)學(xué)觀察4. 血清學(xué)鑒定血清學(xué)鑒定5. 基因測序和生物對(duì)比基因測序和生物對(duì)比第24頁/共39頁第25頁/共39頁中和試驗(yàn)中和試驗(yàn)：病毒在活體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中被特異

15、性抗體中和而失去感染性的一種試驗(yàn)病毒在活體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗(yàn) 患者血清中抗體的消長情況患者血清中抗體的消長情況中和抗體：作用于病毒表面抗原的抗體中和抗體：作用于病毒表面抗原的抗體中和試驗(yàn)是用于人群免疫情況的調(diào)查，臨床診斷中不常用中和試驗(yàn)是用于人群免疫情況的調(diào)查，臨床診斷中不常用第26頁/共39頁補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)：補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)：用已知病毒可溶性補(bǔ)體抗原來檢測病人用已知病毒可溶性補(bǔ)體抗原來檢測病人血清中相應(yīng)的補(bǔ)體抗體。血清中相應(yīng)的補(bǔ)體抗體。補(bǔ)體抗原：補(bǔ)體抗原：病毒的內(nèi)部抗原病毒的內(nèi)部抗原補(bǔ)體抗體補(bǔ)體抗體的出現(xiàn)可作為的出現(xiàn)可作為近期感染近期感染的指標(biāo)的指標(biāo)第27頁/共3

16、9頁血凝抑制試驗(yàn)（血凝抑制試驗(yàn)（HI, test）:具有具有HA的病毒能凝集雞、豚鼠、人等的紅細(xì)胞的病毒能凝集雞、豚鼠、人等的紅細(xì)胞，程血凝現(xiàn)象。這種現(xiàn)象能被相應(yīng)抗體抑制，稱，程血凝現(xiàn)象。這種現(xiàn)象能被相應(yīng)抗體抑制，稱HI試試驗(yàn)驗(yàn)第28頁/共39頁主要是從含有病毒標(biāo)本及感染機(jī)體的血清中主要是從含有病毒標(biāo)本及感染機(jī)體的血清中檢測病毒顆粒、檢測病毒顆粒、蛋白抗原、蛋白抗原、 IgM抗體和核酸抗體和核酸第29頁/共39頁第三節(jié)第三節(jié) 真菌學(xué)診斷真菌學(xué)診斷第30頁/共39頁 細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素：多粘菌素細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素：多粘菌素按生物來源分類按生物來源分類 真菌產(chǎn)生的抗生素：青霉素真菌產(chǎn)生的抗生素：青霉素

17、 放線菌產(chǎn)生的抗生素：鏈霉放線菌產(chǎn)生的抗生素：鏈霉素素 - -內(nèi)酰胺類內(nèi)酰胺類 大環(huán)內(nèi)酯類大環(huán)內(nèi)酯類 氨基糖苷類氨基糖苷類按化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分類按化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分類 四環(huán)類四環(huán)類 氯霉素類氯霉素類 人工合成類人工合成類 其他抗生素類其他抗生素類 （一）抗菌藥物的種類（一）抗菌藥物的種類第31頁/共39頁（二）抗菌藥物的主要作用機(jī)制（二）抗菌藥物的主要作用機(jī)制影響細(xì)胞壁的合成影響細(xì)胞壁的合成（青霉素青霉素）影響細(xì)胞膜的功能（影響細(xì)胞膜的功能（多黏菌素多黏菌素）影響蛋白質(zhì)的合成影響蛋白質(zhì)的合成（鏈霉素（鏈霉素30S亞基亞基, 氯霉素氯霉素 50S亞基）亞基）影響核影響核酸代謝酸代謝（喹諾酮（喹諾酮）

18、第32頁/共39頁影響細(xì)胞壁的合成影響細(xì)胞壁的合成 1、 細(xì)菌細(xì)胞膜上有細(xì)菌細(xì)胞膜上有6種青霉素結(jié)合蛋白（種青霉素結(jié)合蛋白（PBP），在肽聚），在肽聚 糖的合成中起重要糖的合成中起重要作用作用 2、 青霉素（與青霉素（與 D 丙氨酸丙氨酸 結(jié)構(gòu)相似）能競爭性地結(jié)合其中結(jié)構(gòu)相似）能競爭性地結(jié)合其中 的轉(zhuǎn)肽酶，阻滯此的轉(zhuǎn)肽酶，阻滯此酶的功能酶的功能青霉素類的抗生素抑制肽聚糖的合成青霉素類的抗生素抑制肽聚糖的合成，對(duì)生長旺盛的細(xì)菌效果明顯，對(duì)生長旺盛的細(xì)菌效果明顯第33頁/共39頁四、病毒感染的治療四、病毒感染的治療五、真菌的治療五、真菌的治療第34頁/共39頁顯微鏡放大法：顯微鏡放大法： 普通光學(xué)

19、顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡 (LM) ：分辨率，分辨率，0.25m 電子顯微鏡：電子顯微鏡：分辨率，分辨率，1nm掃描電子顯微鏡（掃描電子顯微鏡（SEM）：）：透射電子顯微鏡（透射電子顯微鏡（TEM）: 2、細(xì)菌形態(tài)與結(jié)構(gòu)檢查：、細(xì)菌形態(tài)與結(jié)構(gòu)檢查：對(duì)于形態(tài)與染色上具有特征的病原菌對(duì)于形態(tài)與染色上具有特征的病原菌形態(tài)、排列和染色性形態(tài)、排列和染色性第35頁/共39頁（一）病毒的分離（一）病毒的分離1、動(dòng)物接種、動(dòng)物接種2、雞胚培養(yǎng)：、雞胚培養(yǎng)：目前主要用于分離流感病毒目前主要用于分離流感病毒流感病毒初次分離接種于羊膜腔流感病毒初次分離接種于羊膜腔流感病毒的再培養(yǎng)接種于尿囊腔流感病毒的再培養(yǎng)接種于尿囊腔3、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)第36頁/共39頁細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 病毒分離鑒定中最常用的方法病毒分離鑒定中最