說明成果中鑒1

1、指導(dǎo)教師吳功慶2018 年 4 月誠 信我，所呈交的（設(shè)計(jì)）是本人在老師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我查證，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，（設(shè)計(jì)）中不包含其他人已經(jīng)或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或而使用過的材料。我承諾，（設(shè)計(jì)）中的所有內(nèi)容均真實(shí)、。（設(shè)計(jì)）作者（簽名）： 年月日目錄摘要 -1 前言 12. 材料與儀器 22.1 材料與試劑22.2 實(shí)驗(yàn)儀器33. 實(shí)驗(yàn)方法 33.1 苦蕎麥除雜脫脂43.2 試劑的配制43.3 方法學(xué)43.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定53.5 單因素試驗(yàn)53.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)73.7 水解苦蕎麥蛋白質(zhì)73.8 苦蕎麥多肽的抗氧化測定

2、84.結(jié)果 94.1 方法學(xué)結(jié)果94.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線104.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果114.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果174.5 水解苦蕎麥蛋白結(jié)果194.6 苦蕎麥多肽的抗氧化測定結(jié)果165.討論216.結(jié)論19參考文獻(xiàn) 20綜述 22致謝 29正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選苦蕎麥中多肽的提取工藝及其抗氧化研究摘要：目的 本實(shí)驗(yàn)把苦蕎麥作為研究對象，對苦蕎麥多肽的工藝進(jìn)行研究，通過進(jìn)行單因素試驗(yàn)，正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并且結(jié)合紫外-可見分光光度法建立最佳的提取工藝條件，然后把提取出來的苦蕎麥多肽進(jìn)行抗氧化研究，為促進(jìn)苦蕎麥的綜合利用以及市場的開發(fā)提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)；方法 采用堿法提取粉碎處理后的脫脂蕎麥粉，然后進(jìn)行單因素試驗(yàn)，選

3、出各因素的最佳范圍條件，再進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定最佳工藝條件，最后把提取出來的苦蕎麥蛋白經(jīng)過進(jìn)一步處理得到蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物，通過測定清除 DPPH 自由基能力和清除羥基自由基能力，與維生素 C 的羥自由基清除率以及 DPPH 自由基清除率兩個(gè)方面比較得到苦蕎麥多肽抗氧化活性的結(jié)果；結(jié)果 苦蕎麥蛋白質(zhì)的最佳提取條件是溫度為50、液料比為 50:1、提取時(shí)間為 70min，氫氧化鈉溶液濃度 0.14mol/l，最適的酶底比為 4%；結(jié)論 采用堿法提取苦蕎麥中的蛋白質(zhì)操作簡便，安全可靠，得率高，而且水解后的苦蕎麥蛋白具有較好的抗氧化能力。：苦蕎麥；蛋白質(zhì)；多肽；單因素；正交試驗(yàn)；抗氧化Optimizat

4、ion of extraction technology and antioxidantactivity of polypeptides from bitter buckwheat by orthogonal designAbstract: Objective This experiment takes bitter buckwheat as a research object and studies the preparation process of bitter buckwheat polypeptide. Through single factor test, orthogonal d

5、esign experiment and UV visible spectrophotometry, the optimum extraction conditions are established. Then the extracted tartary buckwheat polypeptides are studied to promote the tartary buckwheat to promote the tartarybuckwheat. It provides a solid theoretical basis for the comprehensive utilizatio

6、n andmarket development. Methods The alkali method was used to extract the defatted buckwheat powder after crushing. Then a single factor test was carried out to select the optimum range conditions of all factors. The optimum technological conditionswere determined by orthogonal design. Finally, the

7、 extracted bitter buckwheat proteinwas further processed to get the proteinposition products, and the DPPH freeradical was cleared by the determination. Ability and scavenging hydroxyl radicalability, compared with two aspects of vitamin C hydroxyl radical scavenging rate and DPPH radical scavenging

8、 rate, results of antioxidant activity of tartary buckwheatpolypeptide. Results The best extraction conditions of tartary buckwheat proteinwere temperature 50, liquid to material ratio 50:1, extraction time 70min, and sodium hydroxide concentration 0.14mol/l,the optimum base ratio of the enzyme is 4

9、%.Conclution The extraction of protein from Buckwheat by alkaline method is simple,safe and reliable, and the yield is high. The hydrolysable buckwheat protein has goodantioxidant capacity.Keywords： Tartary buckwheat, protein, polypeptide, single factor, orthogonal test,antioxidant activity.1 前言苦蕎麥（

10、Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.），又稱三角麥、烏麥、花蕎，由于苦蕎的種實(shí)含有蘆丁，所以也稱丁苦蕎?？嗍w麥屬于雙子葉的蓼科植物，在作物學(xué)上將其劃歸在禾谷類作物，蕎麥有分為甜蕎麥和苦蕎麥，原本生產(chǎn)于我國的喜馬拉雅山區(qū)。其中，苦蕎麥既是營養(yǎng)豐富的農(nóng)作物，也是很好的藥用作物，在中國東北、華北、西北等地都有分布?？嗍w麥性味苦、平、寒，有益氣力、續(xù)精神、利耳目、降氣寬腸健胃的作用?？嗍w麥中蛋白質(zhì)的含量特別豐富（約占13.45 %），是黃酮類化合物（約占 3.25 %）的 4 倍，而且苦蕎麥蛋白質(zhì)氨基酸組成均衡，富含賴氨酸、苯丙氨酸等多種必需的氨基酸，是一種生物效價(jià)很高的蛋

11、白質(zhì)1。通過實(shí)驗(yàn)研究出最適合的提取條件之后可以提取出最大效益的苦蕎麥蛋白提供使用。利用蕎麥加工的副開發(fā)提取生產(chǎn)出蕎麥多肽食品，不僅可以改善人們的營養(yǎng)健康水平，同時(shí)也為蕎麥的企業(yè)加工提供了一條新的有效途徑，更有效合理地進(jìn)行利用。隨著的發(fā)展人們的生活水平不斷地提高，大家都有能力去消費(fèi)，去體驗(yàn)更好地生活，但最重要的，大家還是很關(guān)心自己的健康，于是選擇食品的時(shí)候都會(huì)選擇有益的健康食品。而苦蕎麥具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，既可以食用，又可以作為一種藥材防病、治病，研究表明苦蕎麥對美容養(yǎng)胃、降糖、降脂、降血壓，抑制膽的形成、均有明顯效果2，經(jīng)常食用還可以增強(qiáng)的免疫力，預(yù)防心疾病，如今市場上以苦蕎麥為原料加工制成的

12、食品非常多，比如苦蕎茶、蕎麥面條、苦蕎酒、苦蕎豆醬等等，而且在國外，苦蕎蘆丁也是作為一種食品以及飲料添加劑，特別是蕎麥面在是主要用來招待客人的主食，苦蕎茶在國內(nèi)的各大飯店也一直受到熱捧。相比大豆，蕎麥的國際市場價(jià)格是它的 23 倍，蕎麥制品的價(jià)格也高于同類，因此苦蕎麥具有良好的開發(fā)前景，但苦蕎麥在開發(fā)利用過程當(dāng)中如何使其豐富的內(nèi)含物成分被人們所利用仍然是一題。在苦蕎麥的成分里面，蛋白質(zhì)的含量較高，而且品質(zhì)也很好，特別是必須的 8 種氨基酸接近雞蛋蛋白質(zhì)的組成比例，這對于兒童的生長都特別有利，連同其他谷物一起食用更能發(fā)揮互補(bǔ)作用，提高食物營養(yǎng)。在苦蕎中提取出來的蛋白質(zhì)可以通過酶解3、降解4等方法

13、得出多肽制成品或，而近年來苦蕎麥的開發(fā)利用主要還是苦蕎麥粉和生物黃酮的應(yīng)用當(dāng)中，苦蕎食品已經(jīng)在市場上占據(jù)了一定人群，只是的類型都相對比較粗放，很少會(huì)有精深加工的，導(dǎo)致苦蕎麥的營養(yǎng)功效不能好好地被吸收，而對于另外的一些常見食品比如大豆5、大麥6、扁杏仁7、巴豆8均做了許多提取工藝的優(yōu)化以及抗氧化研究，得到了很好的反響。另外苦蕎麥的口感有點(diǎn)苦澀，這對于進(jìn)入市場也是一種阻礙，如果改善了它的口感或者使用其他技術(shù)讓其更好地服用，那么在市場上面一定會(huì)有更好的影響力。我國很久以前就已經(jīng)通過分離純化等方法將許多在內(nèi)和動(dòng)物體內(nèi)的活性多肽類物質(zhì)開發(fā)成為,或者進(jìn)行一些生物活性肽9和蛋白質(zhì)水解物抗氧化的研究10并且加

14、以應(yīng)用。隨著多肽的相關(guān)技術(shù)、工藝和設(shè)備等因素的迅速發(fā)展，使得多肽的研發(fā)、生產(chǎn)成本大幅下降，多肽的開發(fā)也越來越多，比如抗腫瘤多肽、抗多肽、多肽、細(xì)胞因子模擬肽、抗菌活性肽、診斷用多肽以及用于心疾病的多肽，苦蕎麥蛋白就被研究發(fā)現(xiàn)有可以降低肝臟膽固醇、促進(jìn)排泄、抑制腫瘤、延緩衰老、預(yù)防心疾病的功效，在外國被視為高級(jí)營養(yǎng)品11。雖然開發(fā)的較多，已經(jīng)逐漸形成了一定的規(guī)模,但如果繼續(xù)深入對多肽進(jìn)行研究和認(rèn)識(shí),今后我國的多肽類一定會(huì)有更新、更好的發(fā)展?？偠灾?，苦蕎麥?zhǔn)巧a(chǎn)食品、品的優(yōu)良原料，如果加深對其的價(jià)值認(rèn)識(shí)，合理的進(jìn)行開發(fā)利用，彌補(bǔ)它的不足，努力進(jìn)行苦蕎麥的研究，這對于今后苦蕎麥的產(chǎn)業(yè)發(fā)展將有很大的

15、影響。2. 材料與儀器2.1 材料與試劑表 2-1主要試劑材料試劑名稱廠家苦蕎麥產(chǎn)自云南境內(nèi)烏蒙山蒸餾水廣州屈臣氏食品飲料氫氧化鈉廣州化學(xué)試劑廠石油醚市百世化工95%乙醇市永大化學(xué)試劑氯化鈉市百世化工氯化鉀市百世化工磷酸二氫鉀市百世化工磷酸氫二鈉市百世化工酒石酸鉀鈉市百世化工硫酸銅廣州化學(xué)試劑廠堿性蛋白酶北京奧博星生物技術(shù)公司三氯乙酸市福晨化學(xué)試劑廠水楊酸市百世化工抗壞血酸市百世化工硫酸亞鐵市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心過氧化氫市百世化工酪蛋白磷酸肽鄭州蒼宇化工鹽酸廣州市東紅化工廠DPPH梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展2.2 實(shí)驗(yàn)儀器表 2-2主要儀器儀器名稱廠家TDL-80-2B 低速臺(tái)式離心機(jī)上海安亭

16、科學(xué)儀器廠SHZ-D 循環(huán)水式真空泵鞏義市英峪予華儀器廠HWS26 型電熱恒溫水浴鍋上海一恒科學(xué)儀器JA-2003 型電子天平廣州儀通興儀表DFT-50 手提式高速萬能粉碎機(jī)溫嶺市林大機(jī)械721 型可見分光光度計(jì)上海儀電分析儀器3.實(shí)驗(yàn)方法3.1 苦蕎麥除雜脫脂首先目測去除雜物過后稱取一定量的干燥苦蕎麥，然后置于粉碎機(jī)中粉碎，全粉過 80 目篩。在室溫下按苦蕎麥粉：石油醚=1:5 的比例將蕎麥粉置于石油醚中浸泡 10h 進(jìn)行脫脂，并每隔 20min 攪拌一下。將脫脂后的溶液減壓抽濾，用無水乙醇洗滌，干燥粉末。3.2 試劑的配制3.2.1 配置牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液精密稱取標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（BSA

17、）100mg，用蒸餾水溶解后，于 10ml 容量瓶中進(jìn)行定容，配制成 10mg/ml 的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，保存?zhèn)溆谩?.2.2 配置雙縮脲試劑稱取 0.15g 五水硫酸銅（CuSO45H2O）和 0.60g 的酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6） 置于燒杯中，添加 50ml 的蒸餾水進(jìn)行溶解處理，然后加入 30ml 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%的氫氧化鈉溶液，并在加入的過程中注意不停攪拌。最后用蒸餾水將上述溶液于100mL 容量瓶中定容，保存?zhèn)溆?，若有黑色的沉淀則要重新配置。3.2.3 配置酪蛋白磷酸肽標(biāo)準(zhǔn)溶液精密稱取酪蛋白磷酸肽（CPP）標(biāo)準(zhǔn)物 1.00g（純度為 99%），用適量蒸餾水溶解，并定容于

18、 100ml 容量瓶中，配制成 10 mg/ml 的酪蛋白磷酸肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，保存?zhèn)溆谩?.3 方法學(xué)3.3.1 精密度試驗(yàn)稱取 0.25g 的已脫脂的苦蕎麥粉末，按料液比 40：1 加入 0.1mol/l 的氫氧化鈉溶液 10mL，蓋上瓶塞置于 50的恒溫水浴鍋中，恒溫浸提 40min。取出轉(zhuǎn)移至離心管，于低速離心機(jī) 3000rpm/min 離心 20min。用膠頭滴管吸取 1ml 上清液于試管中，加入 4ml 配置好的雙縮脲試劑，搖勻，放置 30min 后，于紫外分光光度計(jì)在 540nm 波長下平定吸光度 6 次，數(shù)據(jù)并計(jì)算 RSD。3.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)分別稱取 6 份均為 0.25g 的已

19、脫脂的苦蕎麥粉末，加入到已編號(hào)的錐形瓶中， 再分別按料液比 40：1 加入 0.1mol/L 的氫氧化鈉溶液 10ml，蓋上瓶塞然后放進(jìn)50 的恒溫水浴鍋中， 浸提 40min 。取出轉(zhuǎn)移至離心管， 于低速離心機(jī)3000rpm/min 離心 20min。用膠頭滴管吸取 1ml 上清液于試管中，加入 4ml配置好的雙縮脲試劑，搖勻，放置 30min 后，于紫外分光光度計(jì)在 540nm 波長下測定吸光度，數(shù)據(jù)并計(jì)算 RSD。3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)稱取 0.25g 的已脫脂的苦蕎麥粉末，按料液比 40：1 加入 0.1mol/l 的氫氧化鈉溶液 10ml，蓋上瓶塞置于 50的恒溫水浴鍋中，恒溫浸提

20、40min。取出轉(zhuǎn)移至離心管，于低速離心機(jī) 3000rpm/min 離心 20min。用膠頭滴管吸取 1ml 上清液于試管中，加入 4ml 配置好的雙縮脲試劑，搖勻，分別在放置 10、20、30、40、50 和 60min 后，通過紫外分光光度計(jì)在 540nm 波長下測定吸光度，據(jù)并計(jì)算 RSD。數(shù)3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定3.4.1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線分別精密吸取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml 于 6 支編號(hào)的 5ml 的帶塞試管中，分別加蒸餾水補(bǔ)足到 1ml，然后加入 4ml 配置的雙縮脲試劑搖勻，室溫下放置 30min 后，以第一組為對照組，用紫外分光光

21、度計(jì)在波長為 540nm 處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制牛血清白蛋白濃度-吸光度工作曲線。3.4.2 酪蛋白磷酸肽標(biāo)準(zhǔn)曲線分別精密吸取絡(luò)蛋白磷酸肽標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml 于 6 支編號(hào)的 5ml 的帶塞試管中，分別加蒸餾水補(bǔ)足到 1ml，然后加入 4ml 配置的雙縮脲試劑搖勻，室溫下放置 30min 后，以第一組為對照組，用紫外分光光度計(jì)在波長為 540nm 處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，酪蛋白磷酸肽的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制酪蛋白磷酸肽濃度-吸光度工作曲線。3.5 單因素試驗(yàn)3.5.1 溫度對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取的影

22、響分別稱取 6 份 0.50g 的已脫脂的苦蕎麥粉末于已編號(hào)的 50ml 錐形瓶中，再按液料比 20:1 分別加入 10ml 的 0.10mol/l 的氫氧化鈉溶液，蓋上瓶塞。依次置于 30、40、50、60、70、80的恒溫水浴鍋中恒溫浸提 20min 后，取出轉(zhuǎn)移至離心管，于低速離心機(jī) 3000rpm/min 離心 20min。用膠頭滴管吸取 1ml 上清液于試管中，加入 4ml 配置好的雙縮脲試劑，搖勻，放置 30min 后，于紫外分光光度計(jì)在 540nm 波長下平定吸光度 3 次，取平均值。最后根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別求出苦蕎麥蛋白的提取率。3.5.2 提取時(shí)間對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取的

23、影響分別稱取 5 份 0.25g 的已脫脂的苦蕎麥粉末于已編號(hào)的 50ml 錐形瓶中，再按液料比 40:1 分別加入 10ml 的 0.10mol/l 的氫氧化鈉溶液，蓋上瓶塞。置于 60的恒溫水浴鍋中分別恒溫浸提 20min、40min、60min、80min、100min 后，取出轉(zhuǎn)移至離心管，于低速離心機(jī) 3000rpm/min 離心 20min。用膠頭滴管吸取 1ml上清液于試管中，加入 4ml 配置好的雙縮脲試劑，搖勻，放置 30min 后，于紫外分光光度計(jì)在 540nm 波長下平定吸光度 3 次，取平均值。最后根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別求出苦蕎麥蛋白的提取率。3.5.3 氫氧化鈉

24、濃度對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取的影響分別稱取 6 份 0.50g 的已脫脂的苦蕎麥粉末于已編號(hào)的 50ml 錐形瓶中，再按液料比 20:1 分別加入 10ml 的 0.04mol/l、0.06mol/l、0.08mol/l、0.10mol/l、0.12mol/l、0.14mol/l 的氫氧化鈉溶液，蓋上瓶塞。置于 50的恒溫水浴鍋中恒溫浸提 20min 后，取出轉(zhuǎn)移至離心管，于低速離心機(jī) 3000rpm/min 離心 20min。用膠頭滴管吸取 1ml 上清液于試管中，加入 4ml 配置好的雙縮脲試劑，搖勻，放置 30min 后，于紫外分光光度計(jì)在 540nm 波長下平定吸光度 3 次，取平均值。最后

25、根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別求出苦蕎麥蛋白的提取率。3.5.4 液料比對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取的影響分別稱取 1.00g、0.50g、0.33g、0.25g、0.20g、0.167g 的已脫脂的苦蕎麥粉末于已編號(hào)的 50ml 錐形瓶中，再按液料比 10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1 加入 10ml 的 0.10mol/l 的氫氧化鈉溶液，蓋上瓶塞。置于 40的恒溫水浴鍋中恒溫浸提 20min 后，取出轉(zhuǎn)移至離心管，于低速離心機(jī) 3000rpm/min 離心 20min。用膠頭滴管吸取 1ml 上清液于試管中，加入 4ml 配置好的雙縮脲試劑，搖勻，放置 30min 后，于紫外

26、分光光度計(jì)在 540nm 波長下平定吸光度 3 次，取平均值。最后根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別求出苦蕎麥蛋白的提取率。3.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.6.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取溫度、提取時(shí)間、氫氧化鈉濃度、液料比為實(shí)驗(yàn)四個(gè)因素，進(jìn)行 L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定最佳提取工藝條件。在本試驗(yàn)中以苦蕎麥總蛋白得率為指標(biāo)，對苦蕎麥總蛋白質(zhì)提取工藝條件進(jìn)行分析，每一水平重復(fù)三次。經(jīng)過數(shù)據(jù)處理。分析正交試驗(yàn)結(jié)果，確定提取苦蕎麥蛋白質(zhì)的最佳工藝條件。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)法設(shè)計(jì)的條件按液料比分別稱取一定量的已脫脂的苦蕎麥粉末于 50ml 錐形瓶中，再根據(jù)不同的浸提溫度、提取時(shí)間、氫氧化鈉濃度條件進(jìn)行苦蕎

27、麥蛋白的提取實(shí)驗(yàn)，然后取出轉(zhuǎn)移至離心管，于低速離心機(jī) 3000rpm/min離心 20min。用膠頭滴管吸取 1ml 上清液于試管中，加入 4ml 配置好的雙縮脲試劑，搖勻，放置 30min 后，于紫外分光光度計(jì)在 540nm 波長下平定吸光度 3 次，取平均值。最后根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別求出的苦蕎麥提取率。一共進(jìn)行 9 組不同條件組合的實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析，對比得出最優(yōu)的提取工藝條件。3.6.2 驗(yàn)證性試驗(yàn)根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所得出最優(yōu)的提取工藝條件，進(jìn)行堿法提取。稱取 3 份等量的脫脂苦蕎麥粉末于已編號(hào)的 50ml 錐形瓶中，然后按照液料比添加一定濃度的氫氧化鈉溶液在合適

28、的溫度下提取相應(yīng)時(shí)間，取出轉(zhuǎn)移至離心管，于低速離心機(jī) 3000rpm/min 離心 20min。用膠頭滴管吸取 1ml 上清液于試管中，加入 4ml配置好的雙縮脲試劑，搖勻，放置 30min 后，于紫外分光光度計(jì)在 540nm 波長下平定吸光度 3 次，取平均值。最后根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算最優(yōu)提取工藝條件下苦蕎麥蛋白的提取率。3.7 水解苦蕎麥蛋白質(zhì)根據(jù)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果，按照最佳提取工藝條件對苦蕎麥進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取，得到樣品溶液，測蛋白質(zhì)濃度。把得到的蛋白質(zhì)溶液 pH 值調(diào)節(jié)在 9-11 左右，然后平均分成 6 份，再分別加入提前預(yù)熱過的酶底比為 1%、2%、3%、4%、5%、6%

29、的堿性蛋白酶，在 50水浴鍋下水解 2h，然后置 100水浴鍋510min 使蛋白酶失活，冷卻至室溫。取出轉(zhuǎn)移至離心管， 于低速離心機(jī)3000rpm/min 離心 20min。用膠頭滴管吸取 1mL 上清液于試管中，加入 4ml配置好的雙縮脲試劑，搖勻，放置 30min 后，于紫外分光光度計(jì)在 540nm 波長下平定吸光度 3 次，取平均值。確定最合適的酶底比。3.8 苦蕎麥多肽的抗氧化測定3.8.1 苦蕎麥多肽與 Vc 清除 DPPH 自由基能力的測定根據(jù)所得的酶水解后的多肽液的含量和維生素 C 溶液濃度，配制成濃度為0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml、0.8 mg/

30、ml、1.0mg/ml 的苦蕎麥多肽樣品溶液和維生素 C 溶液，備用；吸取 2 ml 樣品溶液，加入 2 ml 無水乙醇配制的 DPPH 溶液，放置暗處靜置 30 min，取出，用紫外分光光度計(jì)在 517 nm 波長處測定吸光度值 A517nm，平定 3 次，取平均值。吸取相同量的維生素 C 進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)操作，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)。DPPH 自由基清除率 S 的計(jì)算公式見（公式 3-1)。S（%）=1-（Ax-Ax0）/A0100%（公式 3-1)式中：A0 為無水乙醇+DPPH 吸光度；Ax 為樣品+DPPH 吸光度；Ax0 為樣品+無水乙醇吸光度。3.8.2 苦蕎麥多肽與 Vc 清除羥基自

31、由基能力的測定根據(jù)所得的酶水解后的多肽液的含量和維生素 C 溶液濃度，配制成濃度為0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0mg/ml 的苦蕎麥多肽樣品溶液和維生素 C 溶液，備用；吸取 1ml 樣品溶液于試管中，加入 1 ml 的 10mmol/l 硫酸亞鐵 FeSO4 溶液，1 ml 的 10 mmol/l 水楊酸溶液和 2 ml 蒸餾水，最后加入5ml 的 10mmol/l 過氧化氫 H2O2 啟動(dòng)反應(yīng)，37恒溫加熱 30min；搖勻后用紫外分光光度計(jì)在 510 nm 波長處測定吸光度值 Ai，平定 3 次取平均值；取 1ml蒸餾水代替 10m

32、mol/l 的硫酸亞鐵溶液所測得的吸光度 Aj，取 1ml 蒸餾水代替樣品溶液所測得的吸光度為 A0。吸取相同量的維生素 C 進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)操作，記錄相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)。OH 清除率 S 的計(jì)算公式見（公式 3-2)。S（%）= 1 -(Ai - Aj )/A0 100 %（公式 3-2）式中：Ai 為加入樣品溶液后的吸光值；A0 為不加樣品溶液的吸光值；Aj 為不加水楊酸溶液時(shí)樣品液的吸光值（即樣品溶液在體系中的吸光值）。4 結(jié)果4.1 方法學(xué)結(jié)果4.1.1 精密度試驗(yàn)結(jié)果精密度試驗(yàn)結(jié)果見表 4-1，吸光度的 RSD 值為 0.25%，精密度試驗(yàn)結(jié)果的RSD 相對較小，表明該實(shí)驗(yàn)儀器的精密度

33、良好。表4-1 儀器精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD（%）次數(shù)吸光度平均值10.25120.25230.2510.2510.2540.25150.25060.2514.1.2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表 4-2，吸光度的 RSD 值為 1.05%，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果的RSD 相對較小，表明該實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性較好.表 4-2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果次數(shù)吸光度蛋白提取率（%）平均值RSD（%）10.25322.4320.25122.2530.25222.330.25181.0540.24821.9850.25122.2560.25622.704.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表 4-3，吸光度的 RSD 值

34、為 1.98%，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果的RSD 相對較小，表明該實(shí)驗(yàn)的樣品在室溫放置 60min 內(nèi)穩(wěn)定。表 4-3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)間（min）RSD（%）吸光度平均值100.256200.253300.2510.24931.98400.248500.245600.2434.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線4.2.1 牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)曲線0.50.450.40.350.30.250.20.150.10.050y = 0.0445x + 0.0035R2 = 0.99950246濃度（mg/ml）81012圖 4-1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖牛血清白蛋白（BSA）的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 4-1 所示，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，

35、得到回歸方程 y=0.0445x+0.0035，R2=0.9995，表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系。4.2.2 酪蛋白磷酸肽（CPP）標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度（=540nm）0.40.35y = 0.0352x - 0.0131 R2 = 0.99910.30.250.20.150.10.0500246濃度（mg/ml）81012圖 4-2 酪蛋白磷酸肽標(biāo)準(zhǔn)曲線圖酪蛋白磷酸肽（CPP）標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 4-2 所示，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程 y=0.0352x-0.0131，R2=0.9991，表明該曲線有良好的線性關(guān)系。4.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果4.3.1 溫度對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取的影響吸光度（=

36、540nm）圖 4-3 溫度對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取的影響反應(yīng)條件：時(shí)間 20min；液料比 20:1；氫氧化鈉濃度 0.1mol/l,溫度對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取的影響見圖 4-3。如圖 4-3 所示，提取的溫度在 30至 80，隨著溫度的增加，所得蛋白質(zhì)的提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，且在 60時(shí)達(dá)到最大提取率。其中 30至60蛋白質(zhì)的提取率逐漸升高，60至于溫度過高80蛋白質(zhì)提取率開始降低，可能是由導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)發(fā)生變質(zhì)，綜合考慮選擇溫度 50 、 較合適的溫60、70作為度條件進(jìn)行接下來的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。4.3.2 提取時(shí)間對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取的影響圖 4-4 提取時(shí)間對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取的影響件：溫度

37、 60；氫氧化鈉濃度反 應(yīng) 條液料比 40:1；0.1mol/l, 提取蛋白質(zhì)提取時(shí)間對苦蕎麥的 影 響 見 圖4-4。如圖 4-4間在20min 至隨著時(shí)間的所示，提取的時(shí)100min 之間，增加，所得蛋白質(zhì)的提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，且在 60min 時(shí)達(dá)到最大提取率。其中 20min 至 60min 蛋白質(zhì)的提取率逐漸升高，60min 至 100min 蛋白質(zhì)提取率開始降低，綜合考慮選擇時(shí)間在50min，60min 和 70min 作為較合適的提取時(shí)間進(jìn)行接下來的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。4.3.3 氫氧化鈉濃度對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取的影響圖 4-5 氫氧化鈉濃度對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取的影響反應(yīng)條件：時(shí)

38、間 20min；液料比 20:1；溫度 50,氫氧化鈉濃度對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取的影響見圖 4-5。如圖 4-5 所示，實(shí)驗(yàn)的氫氧化鈉濃度在 0.04mol/l 至 0.14mol/l，隨著濃度的增加，所得蛋白質(zhì)的提取率呈增加趨勢，趨勢在 0.10mol/l 至 0.12mol/l 之間最明顯，當(dāng)濃度繼續(xù)增加到 0.14mol/l 的時(shí)候，蛋白質(zhì)提取率的增加幅度明顯降低 ， 表明此時(shí)已經(jīng)逐漸提取到飽和狀態(tài)，綜合考慮選擇濃度為 0.10mol/l、0.12mol/l和 0.14mol/l 作為較合適的濃度條件進(jìn)行接下來的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。4.3.4 液料比對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取的影響圖 4-6 液料比對苦蕎

39、麥蛋白質(zhì)提取的影響反應(yīng)條件：溫度 40；時(shí)間 20min；氫氧化鈉濃度 0.1mol/l,液料比對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取的影響見圖 4-6。如圖 4-6 所示，實(shí)驗(yàn)的液料比控制在 10:1 至 50:1 之間，隨著液料比的增加，所得蛋白質(zhì)的提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，且在 40:1 時(shí)達(dá)到最大提取率。其中液料比在 10:1 至 40:1 之間蛋白質(zhì)的提取率逐漸升高，液料比從 40:1 至 50:1時(shí)蛋白質(zhì)提取率反而開始降低，其中原因可能為苦蕎麥中的蛋白質(zhì)的溶出率在料液比等于 40:1 時(shí)已達(dá)到最高，即使增加溶劑，蛋白質(zhì)的溶出量較少反而降低苦蕎麥蛋白在溶液中的總體濃度，綜合考慮選擇液料比 30:1、

40、40:1 和 50:1 作為較合適的液料比進(jìn)行接下來的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。4.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果4.4.1 正交試驗(yàn)結(jié)果表 4-4正交試驗(yàn)因素水平表因素 水平150500.1030:1260600.1240:1370700.1450:1表 4-5 正交試驗(yàn)結(jié)果分析表時(shí)間(min)濃度（mol/l）提取率/%序號(hào)溫度（）液料比170600.1430：118.7930260700.1230：113.6670370500.1250：119.4950460500.1440：115.5040570700.1040：119.7320A 溫度（）B 時(shí)間（min）C 濃度（mol/l） D 料液比（g/ml）6

41、50600.1240：113.0800760600.1050：115.2250850700.1450：121.405030：1950500.1018.6580K10.53140.53660.53620.5112K20.44400.47100.46240.4832K30.58020.54800.55700.5612k10.17710.17890.17870.1704k20.14800.15700.15410.1611k30.19340.18270.18570.1871R0.04540.02570.03160.0260ACDB因素主次最優(yōu)方案A1B3C3D3表 4-6方差分析表方差來源平方和df均

42、方FSig.溫度0.00320.0022.4770.164提取時(shí)間0.00120.0010.5900.584堿液濃度0.00220.0010.9170.449液料比0.00120.0010.5270.617本實(shí)驗(yàn)是以苦蕎麥蛋白質(zhì)的提取率作為指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果如表 4-5、4-6 所示，通過極差分析和方差分析可知，本實(shí)驗(yàn)所取的四個(gè)單因素中對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取率的影響順序?yàn)椋簻囟葰溲趸c濃度液料比提取時(shí)間。但通過 Sig.值判斷，試驗(yàn)結(jié)果都無顯著性差異。表明該實(shí)驗(yàn)的靈敏度較低，誤差較大，從而使四個(gè)單因素不具有顯著性。為了減少實(shí)驗(yàn)的誤差，因此每次實(shí)驗(yàn)都需平行試驗(yàn)三次，最終確定提取苦蕎麥蛋白質(zhì)的最佳提取工藝

43、條件是：提取溫度為 50、料液比為50:1、提取時(shí)間為 70min，氫氧化鈉溶液濃度為 0.14mol/l。4.4.2 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果表 4-7 最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果編號(hào)苦蕎麥蛋白提取率（%）平均提取得率（%）125.11225.3425.41325.79最優(yōu)提 取條件為：提 取溫度為 50、提取時(shí)間為料液比為 50:1、70min，氫氧化為 0.14mol/l。在下進(jìn)行驗(yàn)證，得鈉溶液濃度此提取條件到結(jié)果見表 4-7 。以最優(yōu)條到的苦蕎麥蛋件提取所得白質(zhì)平均提取率為 25.41%，驗(yàn)中的所有其優(yōu)于正交試他組分，表明該最佳提取工藝穩(wěn)定可行。4.5 水解苦蕎麥蛋白結(jié)果圖 4-7 酶底比對苦蕎麥

44、蛋白質(zhì)水解的影響如圖 4-7 結(jié)果表明，苦蕎麥蛋白的水解作用隨著堿性蛋白酶用量的增加而增強(qiáng)，當(dāng)酶底比在 1%4%之間，水解作用增強(qiáng)幅度明顯，4%6%間則逐漸增加緩慢，出于降低生產(chǎn)成本考慮，堿性蛋白酶水解苦蕎麥蛋白的較適宜酶底比是 4%。4.6 苦蕎麥多肽的抗氧化測定結(jié)果4.6.1 苦蕎麥多肽與 Vc清除 DPPH 自由基能力的測定圖 4-8 .DPPH 自由基清除率DPPH（1,1-二苯基-2-三肼），是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，在波長 517nm 處，DPPH 自由基有強(qiáng)吸收，其乙醇溶液呈紫色12。當(dāng)抗氧化劑存在時(shí)，DPPH自由基會(huì)與其孤對電子配對而使吸收減弱或消失，可以通過計(jì)算 DPPH 清除

45、率來反映抗氧化劑清除自由基的能力，這也是其中一個(gè)用來評價(jià)物質(zhì)是否有抗氧化能力的重要指標(biāo)。如圖 4-8 結(jié)果表明，在低濃度時(shí)，Vc 的 DPPH 清除能力大于苦蕎麥多肽， 而在高濃度時(shí)兩者的 DPPH 清除率相當(dāng)，差別不大。在測定的樣品濃度范圍內(nèi)， 苦蕎麥多肽的清除率隨著濃度的增加而增加；而維生素 C 作為一種強(qiáng)抗氧化劑， 對 DPPH 自由基的清除率一直在 90%以上。綜上所述，苦蕎麥多肽的對 DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力。4.6.2 苦蕎麥多肽與 Vc清除羥基自由基能力的測定圖 4-9 羥基自由基清除率如圖 4-9 結(jié)果表明，與同濃度的強(qiáng)抗氧化劑 Vc 相比，Vc 的羥基自由基清除能力一直

46、大于苦蕎麥多肽，但是苦蕎麥多肽的清除率也有達(dá)到 50%以上。在測定的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，兩樣品對羥基自由基的清除率均呈上升趨勢，苦蕎麥多肽的增長趨勢比較平緩，但也能達(dá)到 60%以上。綜上所述，苦蕎麥多肽的對羥基自由基有較強(qiáng)的清除能力。5.討論本實(shí)驗(yàn)采用的原材料是產(chǎn)自云南境內(nèi)的苦蕎麥，對原材料進(jìn)行脫脂處理后，采用了堿法提取進(jìn)行單因素試驗(yàn)以及正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化苦蕎麥蛋白質(zhì)的提取工藝，再通過水解蛋白質(zhì)確定出較合適的酶底比，蕎麥蛋白經(jīng)堿性蛋白酶水解后，可得到蕎麥活性多肽。多肽是一種兩性電解質(zhì)，一定的肽鏈長度和一定的電荷密度時(shí)表現(xiàn)出一定的表面活性13。最后對苦蕎麥多肽進(jìn)行抗氧化活性研究。蕎麥多肽具

47、有較高的抗氧化性，能夠清除體內(nèi)的自由此可以作為抗氧化劑添加到食品中，同時(shí)可以作為老年食品中的功能型成分，有著廣泛的應(yīng)用前景14。在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線中，本實(shí)驗(yàn)繪制了牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線以及酪蛋白磷酸肽標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中牛血清白蛋白（BSA）的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 y=0.0445x+0.0035，R2=0.9995，酪蛋白磷酸肽（CPP）的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 y=0.0352x-0.0131， R2=0.9991，兩曲線的 R2 值均較高，表明兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線都具有良好的線性關(guān)系。在單因素試驗(yàn)中，選擇了溫度、時(shí)間、液料比以及氫氧化鈉濃度作為條件因素。其中溫度最終選擇的合適范圍是 50至 70，因?yàn)樵?60時(shí)蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最高并逐漸開始降低，可能是由于溫度過高導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)發(fā)生了變質(zhì)，因此需控制好適當(dāng)?shù)奶崛囟龋乐沟鞍踪|(zhì)在提取過程中被破壞。提取時(shí)間對蛋白質(zhì)提取率的影響也是