雙熒光素酶報告試驗x

1、雙熒光素酶報告實(shí)驗實(shí)驗名稱：雙熒光素酶報告實(shí)驗實(shí)驗基礎(chǔ)知識：熒光素酶（英文名稱：Luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱，其中最有代表性的是一種學(xué)名為Photinuspyralis的螢火蟲體內(nèi)的熒光素酶。在相應(yīng)化學(xué)反應(yīng)中，熒光的產(chǎn)生是來自于螢光素的氧化，有些情況下反應(yīng)體系中也包括三磷酸腺甘（ATP）。沒有熒光素酶的情況下，螢光素與氧氣反應(yīng)的速率非常慢，而鈣離子的存在常?？梢赃M(jìn)一步加速反應(yīng)（與肌肉收縮的情況相似）。雙報告基因用于實(shí)驗系統(tǒng)中作相關(guān)的或成比例的檢測，通常一個報告基因作為內(nèi)對照，使另一個報告基因的檢測均一化。檢測基因表達(dá)時雙報告基因通常用來瞬時轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞，帶有實(shí)驗報

2、告基因的載體共轉(zhuǎn)染帶有不同的報告基因作為對照的第二個載體。通常實(shí)驗報告基因偶聯(lián)到調(diào)控的啟動子，研究調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)和生理基礎(chǔ)。報告基因表達(dá)活力的相對改變與偶聯(lián)調(diào)控啟動子轉(zhuǎn)錄活力的改變相關(guān)，偶聯(lián)到組成型啟動子的第二個報告基因，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照，使測試不被實(shí)驗條件變化所干擾。通過這種方法，可減少內(nèi)在的變化因素所削弱的實(shí)驗準(zhǔn)確性，比如，培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目和活力的差別，細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率。理想的雙報告基因方法應(yīng)該使用戶能夠以螢火蟲熒光素酶所具有的速度，靈敏和線性范圍對同一樣品中的兩個報告基因同時測定。這在傳統(tǒng)的報告基因，如CAT,(3-Gal和GUS是不可能的，由于它們測試化學(xué)，處理要求所固有的局限。

3、相反，結(jié)合螢火蟲(Photinuspyralis)和海洋腔腸(Renillareniformis)雙熒光素酶的系統(tǒng)可滿足這些要求，在單管中完成這些測試。實(shí)驗原理：將目的基因3'UTR區(qū)域或者lncRNA序列構(gòu)建至載體中報告基因Luciferase的后面，構(gòu)建熒光素酶質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，通過比較過表達(dá)或者干擾miRNA后，檢測報告基因表達(dá)的改變(以螢火蟲熒光素酶為報告基因，以海腎熒光素酶為內(nèi)參基因)可以定量反映miRNA對目的基因的抑制作用。結(jié)合定點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確定miRNA與靶基因3'UTR的作用位點(diǎn)。從這兩個圖譜中可以發(fā)現(xiàn)，ppGL3-Basic這個載體主要是用于評估

4、miRNA與靶基因3'UTR的結(jié)合，靶基因的3'UTR放在熒光素酶的后面，這個熒光素酶是熒火蟲熒光素酶，而pRL-TK這個載體則表達(dá)海腎熒光素酶，將這兩個質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染進(jìn)入293細(xì)胞中來檢測熒光時，pRL-TK這個質(zhì)粒起到一個內(nèi)參的作用。3、pmir-GLO將熒火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶構(gòu)建到一個載體上，偏差更小且單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染更簡單。該質(zhì)粒也是由promega公司開發(fā)的，圖譜如下所示：螢光素酶是理想的報告基因，因為哺乳動物細(xì)胞中不含內(nèi)源性螢光素酶，一旦轉(zhuǎn)錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶，同時在所有的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，它的光產(chǎn)物具有最高的量子效率，檢測靈敏度高。熒光素酶報

5、告基因被廣泛用于miRNA靶基因驗證。熒光素酶報告基因的原理在于miRNA主要通過作用于靶基因的3'UTR起作用，可以將目的基因3'UTR區(qū)域構(gòu)建至pGL3-basic載體中報告基因Luciferase的后面，構(gòu)建熒光素酶質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，通過比較過表達(dá)或者干擾miRNA后，檢測報告基因表達(dá)的改變（監(jiān)測螢光素酶的活性變化）可以定量反映miRNA對目的基因的抑制作用。結(jié)合定點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確定miRNA與靶基因3'UTR的作用位點(diǎn)。同時，為了減少內(nèi)在的變化因素，比如：培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等對實(shí)驗準(zhǔn)確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinillal

6、uciferase）的質(zhì)粒（phRL-TK）作為對照質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提供轉(zhuǎn)錄效率的內(nèi)對照，使測試結(jié)果不受實(shí)驗條件變化的干擾。在測量過程中，首先加入熒光素酶檢測試劑LuciferaseAssayReagentI對產(chǎn)生螢火蟲熒光信號，這樣先測量螢火蟲熒光素酶活性。定量螢火蟲熒光強(qiáng)度之后，再在同一樣品中加入Stop&GloReagent試劑，將上述反應(yīng)淬滅，并同時啟動海腎熒光素酶反應(yīng)，進(jìn)行第二次測量，稱之為雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?。?shí)驗檢測步驟：一、樣品準(zhǔn)備：1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(1)細(xì)胞鋪板：將細(xì)胞按50%的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)12孔板內(nèi)。(2)轉(zhuǎn)染：16h左右細(xì)胞約70%時轉(zhuǎn)染螢光素

7、酶報告基因質(zhì)粒，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。首先設(shè)計四組：1.空白組(轉(zhuǎn)染試劑+細(xì)胞)2,質(zhì)粒組3.質(zhì)粒+miRNANC組4,質(zhì)粒+miRNAmimics組2.1 配制質(zhì)粒組：按照每空50ng質(zhì)粒，同時每孔20ul無血清培養(yǎng)基計算需用量，標(biāo)記為A。2.2 配制miRNANC/mimics:miRNANC/mimics的終濃度為20nM,同時每孔20ul無血清培養(yǎng)基計算需用量，分別標(biāo)記為B、Co2.3 配制對應(yīng)轉(zhuǎn)染試劑：按照每孔0.5抹L轉(zhuǎn)染試劑，同時每孔20ul無血清培養(yǎng)基計算需用量，標(biāo)記為D。2.4 稀釋好的四組試劑常溫孵育5min。2.5 將稀釋好的質(zhì)粒DNA和miRNAmimics分別和對應(yīng)轉(zhuǎn)

8、染試劑混勻，常溫孵育20min。2.6 將2.4步驟中試劑對應(yīng)加入孔中。2.7 轉(zhuǎn)染6h后，換新鮮完全培養(yǎng)基。2雙報告基因檢測(1)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染36-48h后，棄去培養(yǎng)基，用100pL1XPBS清洗細(xì)胞(2)傾斜12孔板，吸干剩余的PBS。(3)去離子水將5XPLB(裂解液)稀釋成1XPLB(現(xiàn)配現(xiàn)用)，使用前放到常溫。(4)每孔加50pL稀釋好的1XPLB,置搖床振搖20-30min以保證裂解緩沖液完全裂解細(xì)胞。(5)選用白色不透光的96孔酶標(biāo)板中每孔加步驟4的上清液10pL,加入100pL預(yù)先混好的LuciferaseAssayReagentII,2s后測數(shù)據(jù)，檢測熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。注意此步需在避光條件下進(jìn)行。(6)測定結(jié)束后，每孔添加100pL預(yù)先混好的Stop&GloReagent,靜止2s后，測數(shù)據(jù)，檢測內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。(7)記錄讀數(shù)：每個樣品會有3個數(shù)值：RLU1一螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度，RLU2一內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度，計算兩組數(shù)據(jù)比值，即RLU1/RLU2。(8)分析數(shù)據(jù)：比較1、2組可以發(fā)現(xiàn)由于