生物化學課程實驗指導書

1、生物化學實驗指導書適用專業(yè)：生物技術、生物工程、食品科學與工程生物與食品工程學院生物科學系生物化學實驗細則為了保證生物化學實驗的順利進行，培養(yǎng)同學們掌握良好、規(guī)范的生物化學基本實驗技能，特制定以下實驗細則，請同學們嚴格遵守。1. 實驗前應提前預習實驗指導書并復習相關知識。2. 嚴格按照生物化學實驗分組，分批進入實驗室，不得遲到。非本實驗組的同學不準進入實驗室。3. 進入實驗室必須穿實驗服。各位同學進入各自實驗小組實驗臺后，保持安靜，不得大聲喧嘩和嬉戲，不得無故離開本實驗臺隨便走動。絕對禁止用實驗儀器或藥物開玩笑。4. 實驗中應保持實驗臺的整潔，廢液倒入廢液桶中，用過的濾紙放入垃圾桶中，禁止直接

2、倒入水槽中或隨地亂丟。5. 實驗中要注意節(jié)約藥品與試劑，愛護儀器，使用前應了解使用方法，使用時要嚴格遵守操作規(guī)程，不得擅自移動實驗儀器。否則，因非實驗性損壞，由損壞者賠還。6. 使用水、火、電時，要做到人在使用，人走關水、斷電、熄火。7. 做完實驗要清洗儀器、器皿，并放回原位，擦凈桌面。8. 實驗后，要及時完成實驗報告。2006年1月目 錄生物化學實驗細則····················&

3、#183;··············1目 錄··································

4、83;···········2實驗1 蛋白質的沉淀、變性反應······················3實驗2 醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白··········

5、83;··6實驗3 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質分子量···11實驗4 凝膠過濾層析法測定蛋白質分子量·············16實驗5 DNA的瓊脂糖凝膠電泳·····················

6、·20實驗6 唾液淀粉酶的性質和活力測定·················24實驗7 生物氧化與電子傳遞·························25實驗8 植物

7、體內的轉氨基作用·······················27實驗1蛋白質的沉淀、變性反應（3學時）目的要求1. 加深對蛋白質膠體溶液穩(wěn)定因素的認識。2. 了解沉淀蛋白質的幾種方法及其實用意義。3. 了解蛋白質變性與沉淀的關系。4.了解蛋白質兩性性質原 理在水溶液中，蛋白質分子表面形成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的膠體顆粒，所以蛋白質溶液和其他親水膠體溶液相類似。但是

8、，蛋白質膠體顆粒的穩(wěn)定性是有條件的，相對的。在一定的物理化學因素影響下，蛋白質顆粒失去電荷，脫水，甚至變性，則以固態(tài)形式從溶液中析出，這個過程稱為蛋白質的沉淀反應。這種反應可分為以下兩種類型：1可逆沉淀反應在發(fā)生沉淀反應時，蛋白質雖已沉淀析出，但它的分子內部、空間結構并未發(fā)生顯著變化，基本上保持原有的性質，沉淀因素除去后，能再溶于原來的溶劑中。這種作用稱為可逆沉淀反應。如大多數蛋白質的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時間作用于蛋白質以及利用等電點的沉淀，提純蛋白質時，常利用此類反應。2不可逆沉淀反應在發(fā)生沉淀反應時，蛋白質分子內部結構、空間構象遭到破壞，失去原來的天然性質，這時蛋白質已發(fā)生

9、變性。這種變性蛋白質的沉淀不能再溶解于原來溶劑中的作用稱為不可逆沉淀反應。重金屬鹽、生物堿試劑，強酸、強堿、加熱、震蕩、超聲波、有機溶劑等都能使蛋白質發(fā)生不可逆沉淀反應。蛋白質變性后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷）并不析出，因此，變性蛋白質不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質也未必都已變性。試劑和器材一、試劑1. 蛋白質溶液： 取5ml雞或鴨蛋清，用蒸餾水稀釋至100ml，攪拌均勻后用48層紗布過濾，新鮮配置。2. 蛋白質氯化鈉溶液： 取20ml蛋清，加蒸餾水200ml和飽和氯化鈉溶液100ml，充分攪勻后，以紗布濾去不溶物（加入氯化鈉的目的是溶解球蛋白）。3. 其余試劑：硫酸銨粉

10、末，飽和硫酸銨溶液(150ml)，3%硝酸銀（280ml），0.5%乙酸鉛（200ml），濃硫酸（5ml/組），5%磺基水楊酸（100ml），0.1%硫酸銅（100ml），飽和硫酸銅溶液（400ml），0.1%乙酸（500ml），10%乙酸（500ml），飽和氯化鈉溶液（25ml），10%氫氧化鈉溶液（500ml）。二、器材試管，過濾漏斗，試管架，玻璃棒，沸水浴，量筒，燒杯，試劑瓶，移液管，濾紙，洗瓶，廢液缸，藥匙，移液管架。操作方法一、蛋白質的可逆沉淀反應蛋白質的鹽析作用(分級鹽析)二、蛋白質的不可逆沉淀反應1. 重金屬沉淀蛋白質2. 酸沉淀蛋白質1）2）3. 加熱沉淀蛋白質取5支試管，編號

11、，按下表加入有關試劑（單位/滴）。試劑管號 蛋白質溶液0.1%乙酸10%乙酸飽和氯化鈉10%氫氧化鈉蒸餾水123451010101010555227225將各管混勻，觀察記錄各管現(xiàn)象后，放入沸水浴中加熱10min，比較各管的沉淀情況。思 考 題1. 名詞解釋：水化層；雙電層；蛋白質變性；鹽溶與鹽析；蛋白質等電點沉淀。2. 將實驗結果寫在實驗報告中操作方法的對應位置上并就實驗現(xiàn)象作簡要解釋。3. 根據實驗現(xiàn)象，討論下列問題：1） 蛋白質可逆沉淀與不可逆沉淀的本質區(qū)別是什么？2） 簡述蛋白質的沉淀反應、變性作用和凝固作用的相互關系。4. 作為殺菌劑，氯化汞是怎樣起作用的？實驗2醋酸纖維素薄膜電泳分

12、離血清蛋白（4學時）目的要求1. 學習蛋白質電泳的一般原理及方法。2. 掌握用醋酸纖維素薄膜電泳分離蛋白質的操作技術。原 理帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。帶電顆粒之所以能在電場中向一定的方向移動，并具有一定的遷移速度，是取決于帶電顆粒本身性質的影響，以及電場強度、溶液的pH值、離子強度及電滲等因素的影響。蛋白質具有兩性性質，在溶液中可解離的基團除肽鏈末端的氨基和羧基外，還有很多側鏈基團在一定的pH條件下能解離而使蛋白質帶電。當溶液的pH>pI（等電點）時，蛋白質帶負電荷，在電場中向正極移動，而的pH<pI時，則帶正電荷，電泳時向負極移動。由于

13、蛋白質分子在溶液中解離成帶電的顆粒，所以在電場中除等電點外均能定向泳動，其電泳的方向和速度主要決定于所帶電荷的性質，以及所帶電荷數量、顆粒大小和形狀。不同的帶電顆粒在同一電場中泳動速度不同，常用遷移率來表示。遷移率的定義是指帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度。其計算公式如下：式中：m為遷移率（cm2/V·s）；v為顆粒的泳動速度（cm/s）；E為電場強度（V/cm）；為顆粒泳動的距離（cm）；為支持物的有效長度（cm）；V為實際電壓（V）；t為電泳時間（s）。各種蛋白質的等電點、分子量及顆粒大小各不相同，在某一指定的pH值溶液中，各種蛋白質所帶的電荷不同，因而在電場中遷移的方向和速度

14、不同。根據這個原理，就可以從蛋白質混合物中將各種蛋白質分離出來。因此，電泳技術在生物化學與分子生物學研究中被廣泛用于生物大分子或小分子（如蛋白質、核酸、氨基酸等）的分離純化與分析鑒定等。同時此項技術也普遍用于臨床診斷和工農業(yè)生產實踐中，并已發(fā)展成為這些部門的重要分析分離手段。醋酸纖維素薄膜電泳是以醋酸纖維素薄膜為支持物的一種區(qū)帶電泳。這種薄膜具有均一的泡沫狀結構，厚度為120m，滲透性強，對樣品無吸附作用，用它作支持物進行電泳，電泳效果比紙電泳好，具有樣品用量少，分離速度快，電泳圖譜更為清晰，靈敏度也較高（5g / ml以上）等優(yōu)點。目前已廣泛應用于血清蛋白、血紅蛋白、脂蛋白、同工酶的分離和測

15、定等方面。本實驗以醋酸纖維素薄膜為電泳支持物，分離各種血清蛋白。血清中含有清蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質由于氨基酸組分、立體構象、分子量、等電點及形狀不同（如圖2-1），在電場中遷移速度不同。分子量小、等電點低、在相同堿性pH緩沖體系中、帶負電荷多的蛋白質顆粒在電場中遷移速度快。例如，正常人血清在pH8.6的緩沖體系中電泳1h左右，染色后可顯示5條區(qū)帶。清蛋白泳動最快，其余依次為1，2，-及-球蛋白（如圖2-2）。這些區(qū)帶經洗脫后可用分光光度法定量，也可直接進行光吸收掃描自動繪出區(qū)帶吸收峰及相對百分比。臨床醫(yī)學常利用它們間相對百分比的改變或異常區(qū)帶的出現(xiàn)作為臨床

16、鑒別診斷的依據。蛋白質名稱等電點（pI）分子量清蛋白-球蛋白-球蛋白-球蛋白4.885.065.126.857.50690001-2000002-30000090000150000156000300000圖2-1 人血清中5種蛋白質的等電點及分子量圖2-2 正常人血清醋酸纖維素薄膜電泳示意圖1為清蛋白（或稱為白蛋白），2、3、4、5分別為1-、2-、-及-球蛋白，6為點樣原點試劑和器材一、測試材料未溶血的人或動物血清。二、試劑1.巴比妥巴比妥鈉緩沖液（PH8.6，0.07mol/L，離子強度0.06）：稱取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥鈉（AR），置于三角燒瓶中，加蒸餾水約600

17、ml，稍加熱溶解，冷卻后用蒸餾水定容至1000ml。置4保存，備用。2. 染色液（0.5%氨基黑10B）：稱取0.5g氨基黑10B，加蒸餾水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸（AR）10ml，混勻溶解后置具塞試劑瓶內貯存。3. 漂洗液：取95%乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸餾水50ml，混勻置具塞試劑瓶內貯存。三、器材醋酸纖維素薄膜（2×8cm），培養(yǎng)皿，鑷子，直尺和鉛筆，電泳儀及電泳槽，試管及試管架，普通濾紙。操作方法一、薄膜與儀器的準備1. 醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇用鑷子取一片薄膜，小心地平放在盛有緩沖液的平皿中。若漂浮于液面的薄膜在1530s內迅速潤濕，整

18、條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳；若薄膜潤濕緩慢，色澤深淺不一或有條紋及斑點等，則表示薄膜不均勻應棄去，以免影響電泳結果。將選好的薄膜用鑷子輕壓，使其完全浸泡于緩沖液中約30min后，方可用于電泳。2. 電泳槽的準備根據電泳槽膜支架的寬度，裁剪尺寸合適的濾紙條。在兩個電極槽中，各倒入等體積的電極緩沖液，在電泳槽的兩支架上，各放一層濾紙條，使濾紙一端的邊與支架前沿對齊，另一端侵入電極緩沖液內。當濾紙條全部潤濕后，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上。濾紙條是兩個電極槽聯(lián)系醋酸纖維素薄膜的橋梁。 用平衡裝置連接兩個電泳槽，使兩個電極槽內的緩沖液彼此處于同

19、一水平狀態(tài)。 二、點樣1. 制備點樣模板取一張干凈濾紙（10×10cm），在距紙邊1.5cm處用鉛筆劃一平行線，此線為點樣標志區(qū)。2. 點樣用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層濾紙間輕輕按壓，吸去多余的緩沖液。無光澤面向上平放在點樣模板上，使其底邊與模板底邊對齊。點樣區(qū)距陰極端1.5cm處。點樣時，先用玻片一端截面沾取一定量的血清，然后將沾有樣品的玻片截面垂直地與纖維素薄膜點樣區(qū)處輕輕接觸，樣品即呈一條線“印”在薄膜上，（如圖2-3）使血清完全滲透至薄膜內，形成細窄而均勻的直線。此步是實驗的關鍵，點樣前應在濾紙上反復練習，掌握點樣技術后再正式點樣。圖2-3 醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點樣位置示意

20、圖。虛線處為點樣位置三、電泳用鑷子將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上，如圖所示。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。如一電泳槽中同時安放幾張薄膜，則薄膜之間應相隔幾毫米。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10min。圖2-4 電泳裝置剖視示意圖1.濾紙橋2.電泳槽3. 醋酸纖維素薄膜4.電泳槽支架5.電極室中央隔板用導線將電泳槽的正、負極分別連接，注意不要接錯。在室溫下電泳，打開電源開關，用電泳儀上細調節(jié)旋扭調到每厘米膜寬電流強度為0.3mA（8片薄膜則為4.8 mA）。通電1015min后，將電流調節(jié)到每厘米膜寬電流強度為0.5mA（8片共8mA）

21、，電泳時間約5080min。電泳后調節(jié)旋扭使電流為零，關閉電泳儀切斷電源。四、染色與漂洗用解剖鑷子取出電泳后的薄膜，放在含0.5%氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中，浸染5min。取出后再用漂洗液浸洗、脫色，每隔10min換漂洗液一次，連續(xù)數次，直至背景藍色脫盡。取出薄膜放在濾紙上，用吹風機的冷風將薄膜吹干。注 意 事 項1 醋酸纖維素薄膜的預處理市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的重要關鍵之一。將干膜片漂浮于電極緩沖液表面，其目的是選擇膜片厚薄均勻，如漂浮1530s時，膜片吸水不均勻，則有白色斑點或條紋，這提示膜片厚薄不均勻，應棄去不用，以免造成電泳后區(qū)帶扭曲，界限不清，背景

22、脫色困難，結果難以重復。由于醋酸纖維素薄膜親水性比紙小，浸泡30min以上是保證膜片上有一定量的緩沖液，并使其恢復到原來多孔的網狀結構。最好是讓漂浮于緩沖液的薄膜吸滿緩沖液后自然下沉，這樣可將膜片上聚集的小氣泡趕走。點樣時，應將膜片表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免緩沖液太多引起樣品擴散。但也不能吸得太干，太干則樣品不易進入薄膜的網孔內，而造成電泳起始點參差不齊，影響分離效果。吸干的程度以不干不濕為宜。為防止指紋污染，取膜時，應戴指套或用夾子。2 緩沖液的選擇醋酸纖維素薄膜電泳常選用pH8.6巴比妥緩沖液，其濃度為0.050.09mol/L。選擇何種濃度與樣品及薄膜的厚薄有關。在選擇時，先初步定

23、下某一濃度，如電泳槽電極之間的膜長度為810cm，則需電壓25V/cm膜長，電流強度為0.40.5mA/cm膜寬。當電泳時達不到或超過這個值時，則應增加緩沖液濃度或進行稀釋。緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動速度快，并由于擴散變寬；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動速度慢，區(qū)帶分布過于集中，不易分辨。3. 加樣量加樣量的多少與電泳條件、樣品的性質、染色方法與檢測手段靈敏度密切相關。作為一般原則，檢測方法越靈敏，加樣量越少，對分離更有利。如加樣量過大，則電泳后區(qū)帶分離不清楚，甚至互相干擾，染色也較費時。如電泳后用洗脫法定量時，每厘米加樣線上需加樣品0.15L，約相當5-1000g蛋白。血清蛋白常規(guī)電泳分離時，每

24、厘米加樣線加樣量不超過1L，相當于60-80g蛋白質。但糖蛋白和脂蛋白電泳時，加樣量則應多些。對每種樣品加樣量應先作預實驗加以選擇。點樣好壞是獲得理想圖譜的重要環(huán)節(jié)之一，以印章法加樣時，動作應輕、穩(wěn)，用力不能太重，以免將薄膜弄破或印出凹陷而影響電泳區(qū)帶分離效果。4. 電量的選擇電泳過程應選擇合適的電流強度，一般電流強度為0.40.5mA/cm膜寬為宜。電流強度高，則熱效應高，尤其在溫度較高的環(huán)境中，可引起蛋白質變性或由于熱效應引起緩沖液中水分蒸發(fā)，使緩沖液濃度增加，造成膜片干涸。電流過低，則樣品泳動速度慢且易擴散。5. 染色液的選擇 對纖維素薄膜電泳后應根據樣品的特點加以選擇。其原則是染料對被

25、分離樣品有較強的著色力，背景易脫色；應盡量采用水溶性染料，不宜選擇醇溶性染料，以免引起醋酸纖維素薄膜溶解。應控制染色時間。時間長，薄膜底色深不易脫去；時間太短，著色淺不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要時可進行復染。 思 考 題1通過本次實驗，討論下列問題：（1）簡述醋酸纖維薄膜電泳原理。（2）根據人血清中血清蛋白各組分等電點，如何估計它們在pH8.6的巴比妥巴比妥鈉電極緩沖液中，移動的相對位置。（3）醋酸纖維素薄膜與濾紙相比較，有哪些優(yōu)點？(4)電泳時為什么要將點樣的一端靠近負極端？實驗4葡聚糖凝膠過濾層析法測定蛋白質分子量(4學時)目的要求1. 初步掌握利用凝膠層析法測定蛋白質分子量的原理

26、。2. 學習用標準蛋白質混合液制作Ve, Kav對的“選擇曲線”以及測定未知蛋白質樣品分子量的方法。原 理凝膠是由膠體溶液凝結而成的固體，它們的內部有很細微的多孔網狀結構。目前關于凝膠層析的原理有許多假設和理論，普遍接受的是分子篩效應。凝膠顆粒在合適的溶劑中浸泡，充分吸液膨脹，然后裝入層析柱內，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫。在洗脫過程中，大分子不能進入凝膠內部而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，而小分子可以進入凝膠顆粒內部的多孔網狀結構，流速緩慢，以至最后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質得到分離。對凝膠層析分離的簡單過程可用圖4-1表示。圖4-1 小分子由于擴散作用進入凝膠顆粒

27、內部而被滯留，大分子被排阻在凝膠顆粒外面，在顆粒之間迅速通過。外水體積、內水體積、柱床體積 、洗脫體積 外水體積（Vo）是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積內水體積（Vi）是指凝膠顆粒中孔穴的體積。柱床體積 是（Vt）凝膠柱所能容納的總體積洗脫體積（Ve）是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積。它包括自加入樣品時算起，到組分最大濃度出現(xiàn)時所流出的體積。 Ve一般是介于Vo 和Vt之間的。    對于完全排阻的大分子由于其不進入凝膠顆粒內， 故其洗脫體積 Ve Vo對于完全滲透的小分子由于它可以存在于凝膠柱整個體積內，故其洗脫體積 Ve Vt分子量介于

28、二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。洗脫容積Ve是自加入樣品時算起，到組分最大濃度峰出現(xiàn)時所流出的容積，它與V0,Vi的關系為：式中Kd為分子量不同的溶質在凝膠內部和外部的分配系數，只與被分離物質分子的大小和凝膠顆粒空隙的大小分布有關。上式可改寫成：Kav是有效分配系數，對交聯(lián)度小的凝膠Kav與Kd差別較小，而對交聯(lián)度大的凝膠二者差別較大。Kav可用下式表示：根據凝膠層析原理，對同一類型化合物的特征與組分的分子量有關。流過凝膠柱時，按分子大小順序流出，分子量大的走在前面。洗脫容積Ve是該物質分子量對數的線性函數：式中，為常數，為分子量。也可以用（有效分配系數）代替，與分子量的關系同上

29、式，只是常數不同。通常多以對分子量的對數作圖得一曲線，稱為“選擇曲線”。如圖4-2所示。選擇曲線的斜率說明凝膠性質的一個很重要的特征。在允許的工作范圍內，曲線愈陡，則分級愈好，而工作范圍愈窄。凝膠層析主要決定于溶質分子量大小，每一類型的化合物如球蛋白類等都有自己特殊的選擇曲線，可用于測定未知物的分子量，測定時以使用曲線的直線部分為宜。圖4-2 球蛋白分子量選擇曲線為了測定分子量，就必須知道一根特定柱的Vt，V0和Vi，從而計算出Kd，Kav等。V0可用不被凝膠滯留的大分子物質的溶液，如血紅蛋白，印度黑墨水，分子量約200萬的藍色葡聚糖2000等有顏色的溶液，通過測定大分子物質的洗脫曲線，洗脫峰

30、峰頂洗出的體積就是該柱的V0值。選一種分子量小于凝膠工作范圍下限的化合物，測出其洗脫體積Ve，減去V0就是Vi，常用硫酸銨來測定。Vt可用下式計算：為常數3.14，為柱直徑，為凝膠床的高度。試劑和器材一、試劑1. 標準蛋白質混合液：1ml/組3mg/ml藍色葡聚糖，8mg/ml肌紅蛋白。溶劑為含15%（V/V）甘油的洗脫緩沖液。2. 洗脫液0.05mol/LTris鹽酸溶液(pH7.5)，內含0.1mol/LNaCl：50ml 0.1mol/L Tris溶液與40.3ml 0.1mol/L鹽酸混勻后，溶解0.585克NaCl，加水稀釋至100ml，即得洗脫液3. Sephadex G-75二、

31、器材層析柱：柱管（直徑1.01.3cm；管長50cm）1個/組，試管，玻璃棒，濾紙，移液管，（721分光光度計）試管架、鐵架臺操作方法一、一般操作方法1. 凝膠的處理（教師準備）將稱好的干粉傾入過量的洗脫液中，在室溫下放置，使之充分溶脹。為了縮短時間，可在沸水浴中加熱將近100，這樣可縮短溶脹時間至幾小時，而且可以殺死細菌和霉菌，并排除凝膠內氣泡。2. 裝柱裝柱前將凝膠上面過多的溶液傾出，用真空干燥器抽盡凝膠中空氣。關閉層析柱出水口，并向柱管內加入約1/3柱容積的洗脫液，然后在緩慢攪拌下，將濃漿狀的凝膠連續(xù)地傾入柱中，使之自然沉降，待凝膠沉降約23cm后，打開柱的出口，調節(jié)合適的流速，使凝膠繼

32、續(xù)沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時停止裝柱，關閉出水口。接著通過23倍柱床容積的洗脫液使柱床穩(wěn)定，然后在凝膠表面上放一張濾紙片或一團脫脂棉，以防將來在加樣時凝膠被沖起，并始終保持凝膠上端有一段液體。3. 加樣加緊上、下進出水口夾子，以防止操作壓改變。用1ml移液管吸取1ml樣品混合液，將移液管尖端小心插入柱中液面下方1cm處，小心釋放樣品，使其在脫脂棉上端形成一個層面，過程大約需要2分鐘完成。看到樣品層剛好完全流入凝膠床時，向柱上小心的添加緩沖液至合適高度（約5cm左右），以保證流速的穩(wěn)定。（注意：不能使膠床上端無充裕的緩沖液，以防干裂）4. 洗脫洗脫時，打開上、下進出口夾子，先

33、收集10ml流出液，用洗脫液以每管4ml/管流速洗脫，用試管收集流出液，并對每管編號。當所有有色物質洗脫下來后，關閉螺旋夾停止洗脫。然后在對應的波長下讀各管的光吸收值。二、蛋白質分子量的測定1. 測定V0和Vi將0.5ml藍色葡聚糖2000和硫酸銨混合液（2mg/ml）上柱、洗脫，分別測出藍色葡聚糖的洗脫體積Ve即為該柱的V0，硫酸銨的洗脫體積Ve即為該柱的Vi。藍色葡聚糖的洗脫峰可根據顏色判斷，硫酸銨的洗脫峰用Ba(Ac)2判斷。2. 標準曲線的制作按上述方法將1ml標準蛋白質混合液上柱、洗脫，用試管收集。收集后，于以下對應波長下讀各管的光吸收值：藍色葡聚糖（藍色）：650nm肌紅蛋白（琥珀

34、色）：500nm以洗脫體積為橫坐標，光吸收值為縱坐標作洗脫曲線。根據洗脫峰位置，量出每種蛋白質的洗脫體積（Ve），然后以蛋白質分子量的對數lgMr為縱坐標，Ve為橫坐標，作出標準曲線。同時根據已測出的V0和Vi以及計算出的Vt，求出Kav。也可以Kav為橫坐標，lgMr為縱坐標作出標準曲線。3. 未知樣品分子量的測定將未知樣品按標準曲線的條件操作。根據洗脫峰的位置，量出洗脫體積，也可以計算出Kav，分別由標準曲線查得樣品的分子量。思 考 題1. 根據實驗中遇到的各種問題，概述做好本實驗的經驗與教訓。2. 凝膠過濾的介質有哪些，各過濾介質的異同是什么？3. 通過本次實驗學習，討論SDSPAGE和

35、凝膠過濾法測定蛋白質分子量的異同。實驗5 DNA的瓊脂糖凝膠電泳（4學時）目的要求1. 掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法。2. 學習利用瓊脂糖電泳方法測定DNA片段大小。3. 學習有關建立DNA限制性內切酶圖譜的基本技術。原 理DNA分子在堿性環(huán)境中（pH8.3緩沖液）帶負電荷，外加電場作用下，向正極泳動。不同的DNA片段由于其電荷、分子量大小及構型的不同，在電泳時的泳動速率就不同，從而可以區(qū)分出不同的區(qū)帶，電泳后經溴乙錠染色，在波長254nm紫外光照射下，DNA顯橙紅色熒光。瓊脂糖凝膠電泳對DNA的分離作用主要依據DNA的分子量及分子構型，同時與凝膠的濃度也有密切關系。一定大小的DN

36、A 片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中，電泳遷移率不相同。不同濃度的瓊脂糖凝膠適宜分離DNA片段大小范圍見表1。因而要有效分離大小不同的DNA片段，主要是選用適當的瓊脂糖凝膠濃度。不同構型的DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差別較大。在分子量相當的情況下，不同構型的DNA移動速度次序如下：共價閉環(huán)DNA直線DNA開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。在同一濃度的凝膠中，分子量較小的DNA片段比較大的片段快。DNA片段的遷移距離（遷移率）與它的大?。ǚ肿恿浚┑膶党煞幢?。將未知DNA的遷移距離與已知分子大小的DNA標準物的電泳遷移距離進行比較，即可計算出未知DNA片段的大小。瓊脂糖凝膠濃度/%可分辨的線性DNA大小范圍/

37、kb0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1表5-1 DNA大小范圍與瓊脂糖凝膠濃度的關系本實驗采用限制性內切酶Hind或EcoR酶解DNA的片段為標準物，建立其酶切圖譜，同時以酶解各片段的分子量為縱坐標，以它們對應的遷移率為橫坐標，在半對數坐標紙上，連接各點繪制出測定DNA分子量的標準曲線。共價閉環(huán)質粒pBR322DNA只有一個EcoR酶切位點，酶解后成為一條線狀DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳，測量酶解后線型DNA的遷移距離，可以直接在分子量標準曲線上得出其分子大小。試劑和器材一、試劑1. 限制性內切酶Hind、EcoR試劑盒 2. 標準D

38、NA：按使用說明配制3. 標準pBR322：按使用說明配制4. 酶反應終止液（10×0.1mol/L EDTA，20%Ficoll，0.25%溴酚藍）：10L/組稱取3.72克EDTA·Na2·2H2O，20克Ficoll，0.25克溴酚藍，溶解后定容至100ml。5. 電極緩沖液（5×TBE）：用前稀釋10倍稱取10.88克Tris，5.52克硼酸，0.74克EDTA·Na2·2H2O，溶解后用蒸餾水定容至200ml。使用前用蒸餾水稀釋10倍，稱為TBE稀釋緩沖液（0.5×TBE）。6. 溴乙錠（EB）染色貯存液（1mg/

39、ml）或者gold view溶液：將100mg溴乙錠溶于蒸餾水或電極緩沖液100ml，棕色瓶內封好，避光保存。EB是誘變劑，配制和使用時應戴手套，并且不要將該溶液灑在地面或桌面上。凡是沾污過EB的器皿或物品，必須經專門處理后，才能進行清洗或棄去。gold view溶液按照說明書配制7. 1%瓊脂糖二、器材Eppendorf離心管，電泳槽，電泳儀，凝膠塑料托盤，小燒杯，移液器，一次性塑料手套，膠頭滴管，紫外反射投射儀，洗瓶，大燒杯，量筒。操作方法一、DNA的酶解（參考）取2只清潔、干燥、無菌的Eppendorf管，編號，按照限制性內切酶Hind、EcoR試劑盒說明書用量，用微量注射器加入各種試劑

40、質粒DNA和pBR322，最后用雙蒸水補足至20L，小心混勻。37水浴保溫12h，然后各小管內加入2L的酶反應終止液，混勻，終止酶促反應，冰箱內保存?zhèn)溆?。操作前各試劑用量要反復核對，保證準確無誤，所加試劑用量很少，必須認真操作。實驗中有DNA標樣做對照二、1.0%瓊脂糖凝膠板的制備1. 用配套擋板將凝膠塑料托盤短邊缺口封住，置水平玻板或水平工作臺面上，將樣品槽模板（梳子）插進托盤長邊上的凹槽內（距一端約1.5cm），梳齒底邊與托盤表面保持0.51mm的間隙，安置好后保持靜置狀態(tài)。（擋板與托盤縫隙處可用膠帶或者瓊脂糖溶液封?。?. 稱取0.3克瓊脂糖置于小錐形瓶中，加入30mlTBE稀釋緩沖液

41、，在電爐上加熱融化，一定要煮沸兩次排盡氣泡。3. 待瓊脂糖冷卻至放在手背不覺太燙手（約60）后，滴一滴EB或gold view，然后將瓊脂糖溶液在靠近擋板一側連續(xù)地倒入托盤內（注意中間不要間斷），使凝膠緩慢而連續(xù)地展開直至在托盤表面形成一層約3mm厚均勻膠層（7.1×9.0cm）。膠內不要存有氣泡，室溫下靜置約20分鐘。4. 待凝固完全后，用小滴管在梳齒附近加入少量TBE稀釋液潤濕凝膠，雙手均勻用力輕輕拔出樣品槽模板（注意勿使樣品槽破裂），則在膠板上形成相互隔開的樣品槽。5. 取下封邊的擋板，將凝膠連同托盤放入電泳槽平臺上，倒入大量TBE稀釋緩沖液直至浸沒過凝膠面23mm，要防止樣品

42、槽內窩存氣泡，可以用微量注射器挑除。 圖5-1 凝膠托盤的組裝1. 托盤 2. 擋板 3. 梳子三、加樣用微量注射器或移液槍將經酶切的樣品液和未經酶切的樣品液（要加2L的酶反應終止液）分別加入到膠板的不同加樣槽內，每個槽（5×2×2.5mm）容積約為25L，因此加樣量不要超過15L，避免因樣品過多而溢出，污染鄰近樣品。加樣時，注射器針頭或槍頭穿過緩沖液小心靠近加樣槽底部，但不要損壞凝膠槽，然后緩慢地將樣品推進槽內，讓其集中沉于槽底部。加完一個樣品后的微量注射器應反復洗凈后才能用以加下一個樣品，加完一個樣品后移液器需要更換槍頭。四、電泳加樣完畢，將靠近樣品槽一端連接負極，另一

43、端連接正極（千萬不要搞錯），接通電源，開始電泳。在樣品進膠前可用略高電壓，防止樣品擴散，樣品進膠后，應控制電壓降不高于5V/cm。當染料帶移動到距離凝膠前沿約1cm時，停止電泳。五、觀察小心地取出凝膠置托盤上，將膠板推至預先浸濕并鋪在紫外燈觀察臺上的玻璃紙內，在波長245nm紫外燈下進行觀察。DNA存在的位置呈現(xiàn)橘紅色或綠色熒光，可觀察到清晰的條帶。觀察時應帶上防護眼鏡，避免紫外燈對眼睛的傷害。六、制作測定分子量標準曲線用卡尺量出DNAHind酶解各片段的遷移距離（cm），以DNA酶解各片段分子量為縱坐標，它們的遷移距離為橫坐標，在半對數坐標紙上連結各點劃出曲線，即為DNA分子量的標準曲線。D

44、NAHind酶解各片段大小見表5-2。片段堿基對數目（kb）道爾頓（×106）1234567823.1309.4196.5574.3712.3222.0280.5640.12515.06.124.262.841.511.320.370.08注 意 事 項1. 溴乙錠（EB）是誘變劑，配制和使用時應帶乳膠手套，并且不要將該溶液灑在桌面或地面上。凡是沾污過EB的器皿或物品，必須經過專門處理后，才能進行清洗或棄去。2. DNA酶解過程中，使用的器具都應干凈，并經消毒。配制時急需用滅菌的雙蒸水，還要防止限制性內切酶被污染。3. 加樣量的多少取決于加樣槽最大容積?？梢圆捎么笮〔煌臉悠凡勰０逡?/p>

45、形成容積不同的加樣槽，加入樣品的體積應略小于加樣槽容積，為此，對于較稀的樣品液應設法調整其濃度或加以濃縮。4. DNAHind酶解后應有8條帶，但實際上只能看見6條，分子量小的2條帶由于其熒光弱，往往看不見。思考題1. 名詞解釋：DNA；限制性內切酶；Marker2. 根據實驗結果，解釋瓊脂糖凝膠電泳測定DNA片段大小的根據，聚丙烯酰胺凝膠電泳能否測定DNA分子的大小，它們的區(qū)別是什么？3. 說明DNA限制性內切酶圖譜的構建在核酸研究和遺傳工程等方面的應用價值。實驗6 唾液淀粉酶的性質和活力測定（8學時）目的要求通過唾液淀粉酶性質的測定，了解酶的專一性和多種因素對酶促反應速度的影響，如：底物濃度、酶濃度、溫度、pH值、激活劑和抑制劑等。通過對唾液淀粉酶活力的測定，學習酶活力、蛋白質含量的測定方法，及酶活力和比活力的計算方法。試劑和器材主要器材：可見光分光光度計、試