ATP熒光法微生物(細菌總數)快速檢測系統(tǒng)方案

1、ATP熒光法微生物（細菌總數）快速檢測系統(tǒng)使用說明書第一部分 ATP熒光法微生物（細菌總數）快速檢測系統(tǒng)簡介1、系統(tǒng)原理 32、組成部件及相關功能 43、應用領域、特點、效益 44、檢測注意事項及操作步驟 .45、ATP快檢系統(tǒng)使用注意事項及故障排除 .96、對應關系曲線 .107、有關食品安全和衛(wèi)生檢測的問答 .118、具體樣品檢測的操作方法及方案 .14第二部分ATP熒光法微生物（細菌總數）快速檢測系統(tǒng)使用說明1 、 技 術 參 數 及 性能.232 、儀器操作 說明 .242.1 開 機、 初 始化.2422參數設置 .242. 2. 1 選擇 RL昉式 .252.2.3設置文件類型 .

2、262.2.4設置日期時間. .272.2.5設置檢測時間 .272. 2. 6 U盤格式化 .272. 3測試 .272.4 查詢 .282.4.1查詢測試結果 .282 . 4. 1. 1刪除測試結果 293 .4.1.2刪除文件.292.4.2 查詢文件信息 .302.4.3 查詢儀器信息.302.4.4 查詢電池電量 .302.4.5 快速查詢 .302 .5通訊 323 、上位機軟件 .333.1 軟件安裝 333.2 驅動程序的安裝 363.3 3軟件啟動 383.4 軟件運行 393. 5樣品及回歸方程設定 403. 6 “文件名”說明414. 7文件、記錄操作和數據庫 424

3、、電池充電.435 、保修 .43第一部分 ATP熒光法微生物（細菌總數）快速檢測系統(tǒng)簡介1、系統(tǒng)原理螢火蟲會發(fā)光是由于它能合成將化學物質的化學能轉變?yōu)楣饽艿纳锎呋瘎?一螢火蟲熒光素酶（簡稱蟲光素酶，luciferase ）、蟲熒光素（D-luciferin ）以 及所有細胞生物都產生的生物能量物質一三磷酸腺甘（ATB。在有氧的條件下，蟲光素酶催化蟲熒光素和 ATP之間發(fā)生氧化反應，形成氧化熒光素并發(fā)出熒光， 其生化反應式如下：ATA D-Luciferin + Q _Mg+1_AMP + Oxyluciferin + PP+ CO+ LightLuciferase上式表明，只要具備適當條件

4、，不僅螢火蟲，即使在試管中也能發(fā)出熒光。當 反應系統(tǒng)中，蟲光素酶和蟲熒光素處于過量的情況下，熒光的強弱取決于ATP的數量。以檢測含細菌的樣品為例，細菌細胞越多，ATP量越高，發(fā)出的熒光也就越強。由于蟲光素酶對ATP的反應非常靈敏，熒光強弱可通過熒光儀1015秒內計量。所以，在排除樣品中非細菌ATP干擾的情況下，通過熒光值就能確定樣品中細菌ATP的含量，從而確定細胞數量，因此，此系統(tǒng)為半定量快速檢測系統(tǒng)。維持胞內ATP濃度的相對恒定，是ATP在細胞代謝中發(fā)揮中心作用的關鍵。每 個細胞的ATP量與胞內容積成正比，但 ATP量與菌落形成單位（colony-forming units=cfu ）之間卻

5、常常偏離這種關系，主要原因是樣品中細菌細胞與細胞碎片彼 此聚集成團，這種效應曾在大腸桿菌培養(yǎng)物這種單一菌群模式系統(tǒng)中有過描述，一個菌落有可能由單個或幾個細胞擴增形成；另一種原因是檢測者沒有對樣品作適當 的預處理，比如沒有去除胞外游離 ATR根據相關文獻記載，不同種類細菌中的ATP 含量不同，由于細菌ATP含量都處于10-18mol數量級，細微差別忽略不計，均值約 為2.5X10-I8mol。對于同種細菌，影響細胞內 ATP含量的因素也很多，生長階段、 培養(yǎng)基種類、有氧無氧以及代謝抑制物的存在，都會影響細胞數和熒光值的對應關 系。實測表明處于同一生長狀態(tài)和批次樣品中的ATP是相對恒定的，即在同一

6、環(huán)境中微生物種類及生長情況固定，其 ATP含量也相對恒定。2、組成部件及相關功能2.1 試劑組，按檢測操作順序分為：(1)體細胞裂解試劑(TRA,能專一而有效地裂解樣品中的非細菌細胞(主 要為體細胞)并釋出ATP，然后通過過濾比色杯底部的濾膜將其排除。(2)細菌細胞裂解試劑(XRA,能專一而有效地裂解樣品中細菌細胞并釋出 ATR(3)熒光反應試齊I組(LLR),能與細菌ATP相互作用并有效地發(fā)出熒光。(4)物表清潔度才測試劑組(SCR,能與物體表面ATP相互作用并有效地發(fā) 出熒光。2.2 微量熒光檢測儀(也稱微量光度計)，準確計量檢樣的熒光值。2.3 可供100次測定的樣品預處理耗材。(1)過

7、濾比色杯的杯架一個，用于固定過濾比色杯。(2)加壓器一個，用于加壓、排出體細胞 AT所口試劑組。(3)帶濾膜熒光反應比色杯100個，為熒光反應容器。(4)專用無菌吸水紙，置于過濾比色杯架，吸收加壓后流出的液體。(5)帶密封圈專用無菌濃縮器，用于濃縮樣品。(6)自備微生物學無菌操作所需常規(guī)用具、器皿，樣品采集無菌、無 ATP的 容器、塑料袋、手套、銀子等。3、應用領域、特點、效益使用ATP熒光法細菌快檢儀實施食品、飲料、乳品加工等全程衛(wèi)生學監(jiān)測生產程序監(jiān)測內容加工生產前生產設施清潔、消毒效果檢測，原、輔料細菌總數檢測，以保障原料質量或明確原料品質級別。加工生產過程中生產設備關鍵控制點（例如供水、

8、通風閥門）衛(wèi)生學 監(jiān)測，影響乳品發(fā)酵飲料、酒類特殊微生物總數檢測。加工生產后制成品污染細菌總數檢測。廢弁物排放、環(huán)境、人員衛(wèi)生學及細菌總數檢測。4、檢測注意事項及操作步驟4.1 試劑的準備和注意事項：4.1.1 本公司提供的“ ATP熒光法細菌總數快檢系統(tǒng)”所含試劑組與微量熒光 檢測儀需匹配使用，不可用其它試劑替代。4.1.2 LLR試劑（含螢火蟲熒光素酶和 D-熒光素）應在冰箱冷凍室-20C中貯 存，有效期6個月。LLR試劑組易變質，室溫下不高于 25c時不彳#超過24小時， 在0-4 C有效期為5天。4.1.3 試劑（LLR）在用于檢測前按規(guī)定低溫存放，檢測前 20分鐘取出平衡到 室溫方可

9、應用。如果超過有效期，應棄用，重新購置。體細胞裂解試劑（ TRA及 細菌細胞裂解試劑（XRA可處于室溫下保存，2-8 C下保存效果最佳。4.1.4 ,螢火蟲熒光素酶對 ATP極其敏感，生物材料容易引起 ATP交叉污染， 所以檢測應盡量滿足微生物學常規(guī)無菌操作，才能取得準確、真實的檢測數據。4.2 樣品采集和預處理簡介非生理條件下，細菌細胞的 ATP濃度將急速下降，但也同樣擁有快速補償機制 以維持胞內ATP濃度相對穩(wěn)定，保障生命活動正常進行。因此，在采集細菌樣品或 進行預處理時要注意下列事項。4.2.1 為避免離心濃縮一類非生理狀況的步驟出現，可使用注射器將樣品轉移 到一次性濾膜上。如需洗滌細胞

10、，應用無菌、無 ATP的PBS緩沖液淋洗，以免影響 胞內ATP濃度。4.2.2 衛(wèi)生監(jiān)測時，常用涂抹法或用棉拭子擦拭采集樣品，但此法對于有生物 膜結構的細菌并非最佳方式，具一，細胞收集率不高；其二，棉花纖維干擾光檢測?？筛倪M為用滴瓶將ATP提取液滴加到待檢表面，用海綿簽收集 ATP后進行光檢4.2.3 細胞的ATP含量與細胞大小成正比，體細胞和酵母細胞的AT哈量大約分別是細菌細胞的1000倍和100倍，但ATP®和菌落形成單位（cfu）之間常常偏 離這種關系，理論上每個活細胞都形成一個菌落，而實際上細胞彼此聚集常常出現 二個或幾個活細胞形成一個菌落的情況。4.2.4 樣品預處理?？捎?/p>

11、ATP降解酶如三磷酸酶（apyrase）去除非細菌ATR 用溫和的去污劑如TritonX-100去除樣品中體細胞ATR也可使用上述兩種制劑同 時處理。不同試劑的處理效果因樣品而異，試劑的選擇和搭配需經實驗確定。4.3 檢測樣品的預處理：（操作過程中需配戴一次性無菌手套）必須用無菌、無ATP的PBS容液：磷酸二氫鉀34g;1mol/L氫氧化鈉溶液175mL 蒸儲水825mL pH7.2;使用時將上述溶液吸取1.25ml,定容至1000ml,滅菌后備 用。實驗室標準菌：在室溫條件下用不含鈣離子和鎂離子的磷酸鹽緩沖液（ PBS 洗滌樣品細胞3次，最后用1ml同種PBS緩沖液懸浮樣品細胞。物表清潔程度

12、：將無菌棉簽頭部用 TRA試劑潤濕，在10cmx 10cm范圍內進行 涂抹，涂抹時需不斷旋轉棉簽頭部，用 1ml PBS緩沖液（不含鈣、鎂離子）浸泡棉 簽頭部，從PBS爰沖液中吸出50口待測。液體樣品：純凈水、自來水等細菌含量較低的樣品需按比例濃縮；牛乳、果汁 等濃度較大無法通過濾膜洗滌的樣品需按比例稀釋，稀釋液應使用PBS（如使用國標生理鹽水，檢測數值會偏低）。液體被檢樣品含細菌細胞數若高于 1000cfu/ml , 可直接抽取50/被檢樣品進行測試；液體被檢樣品含細菌細胞數若低于1000cfu/ml ,應進行濃縮處理。濃縮方法如下：打開專用濃縮器，用無菌銀子取無菌過濾比色杯放入專用濃縮器內

13、，注意上下膠圈 放好，以免濃縮樣品時發(fā)生泄露，擰緊濃縮器。用一次性無菌醫(yī)用針管抽取10ml或其整倍數的被檢樣品，接到專用濃縮器上進行濃縮，用適當的壓力緩緩地往下推 注射器的柱塞（此時被檢液體樣品中的細菌被過濾比色杯的微孔濾膜截留，液體部 分通過濾膜被排出）直到注射器與濃縮器中的液體部分完全被推出；擰開濃縮器， 用消毒過的銀子從濃縮器中取出過濾比色杯備用。固體樣品處理：無菌操作稱取25g被檢固體樣品溶于225mlPBS容液中，然后把 處理好的懸濁液用滅菌后的濾紙進行粗濾，抽取過濾后基本澄清無肉眼可見懸濁物 液體進行測試。（注：溶于PBS后所測結果為每克樣品稀釋10倍后所得光值）。特殊樣品處理：如

14、需檢測高鹽、高糖、深加工產品，含抑菌劑、色素類樣品需增加TRA洗滌次數，洗滌5次為佳。冷藏或冷凍樣品中微生物所含 ATP會降低，如 需檢測冷凍的肉類、面食等，需使樣品完全解凍至室溫后再進行檢測。4.4 ATP標準曲線制定步驟4.4.1 用雙蒸水將濃度為1mM勺ATP容液，按1: 10梯度比例制備成100仙mol、 10mol、1 n mol、100nmol、10nmol 及 1nmol 系歹!J溶液。4.4.2 用微量移液器吸取50仙l熒光反應試劑組（LLR）,加入熒光反應比色杯 中，然后分別加入5/ 稀釋后的各梯度ATP容液，用微量熒光檢測儀檢測 RLUO, 重復上述步驟，得到系列ATP溶液

15、數據。4.4.3 以RLUfi為縱座標，對應AT啾度系列為橫座標作圖。在1nmol-1仙molATP 濃度范圍內，ATP度與相應RL必問存在線性關系。標準ATP溶液可以作為鑒定LLR試劑組是否失效及失效程度的陽性對照。如按4.4.2步驟加入1nmolATP溶液時RLU值低于200,表示開始失效，應棄用。4.5 樣品檢測步驟：4.5.1 開機4.5.1.1 打開儀器電源前，拉開儀器抽屜，確保抽屜小槽內清潔無異物，關閉 抽屜。4.5.1.2 打開電源，進行初始化及參數設置。（詳見操作說明）4.5.1.3 準備測試時，返回到主菜單界面（如下圖），光標移動到“測試”選項。測 五t查作參數設置 通訐J1

16、4.5.2 試劑組本底的測定4.5.2.1 取出比色杯架，中間墊放5張專用吸水紙，將未放置樣品的過濾比色 杯放入架孔內。4.5.2.2 拿起TRA細胞裂解試劑，向杯中滴加4滴，再用加壓器置杯頂加壓,排出杯中所有液體，由吸水紙吸凈。重復上述步驟一次4.5.2.3 拉開抽屜后，屏幕顯示準備測試狀態(tài) （如下圖）。從杯架上取下過濾比 色杯置于儀器可拉動抽屜小孔內。準備測試4.5.2.4 拿起XR國田菌細胞裂解試劑，垂直滴加 2滴于杯中。4.5.2.5 用移液器從LLR試劑瓶吸取熒光反應試劑50/加入杯底，緩和地吸 擠三次混勻。關閉抽屜，開始測試。（注意：加入LLR試劑后，反應已經開始，所 以操作應該迅

17、速，務求操作時間一致，對樣品測試達到平行數據十分關鍵。測量完 畢前不可再拉動抽屜。）4.5.2.6 本底空白RLU讀數應低于200,如讀數過高，則提示過濾比色杯或試 劑有污染。4.5.3 樣品測定4.5.3.1 取出比色杯架，中間墊放 5張專用吸水紙，將含濃縮后樣品的過濾比 色杯放入架孔內（不需濃縮的液體樣品用移液器直接吸取被檢樣50/注入過濾比色杯內進行測試）。4.5.3.2 拿起TRAft細胞裂解試劑，向杯中滴加4滴，再用加壓器置杯頂加壓， 排出杯中所有液體，由吸水紙吸凈。重復上述步驟一次。4.5.3.3 拉開抽屜后，屏幕顯示準備測試狀態(tài) （如下圖）。從杯架上取下過濾比 色杯置于儀器可拉動

18、抽屜小孔內。準備測試4.5.3.4 拿起XR國田菌細胞裂解試劑，垂直滴加 2滴于杯中。4.5.3.5 用移液器從LLR試劑瓶中吸取熒光反應試劑 50仙l加入杯底，緩和地 吸擠三次混勻。關閉抽屜，開始測試。（注意：加入LLR試劑后，反應已經開始， 所以操作應該迅速，務求操作時間一致，對樣品測試達到平行數據十分關鍵）4.5.3.6 根據“參數設置”所選測定模式，屏幕顯示相應的測試結果。4.6 清潔程度標準快速制訂步驟：4.6.1 確定質控點和關鍵質控點。4.6.2 清潔產品表面，重復二到三次以到達最佳清潔度。4.6.3 建議結合平皿計數和RLU值設定自己的初始化數值。4.6.4 連續(xù)幾天在不同位置

19、進行 ATP衛(wèi)生監(jiān)控檢測，得出20 50個結果。計算這些 RLUR值的平均值和標準偏差（s.d）。4.6.5 計算通過標準RLUF均數值。4.6.6 將通過標準數量增加2到3倍即為不合格值。4.6.7 警告值介于合格與污染值之間。4.6.8 定期重新計算以更新限定值，不斷提高標準。5、ATP快檢系統(tǒng)使用注意事項、故障排除5.1 ATP快檢系統(tǒng)使用注意事項：5.1.1 檢測完畢后，須將微量熒光檢測儀做適當清潔以免下次使用時交叉污染。 儀表外部可用干凈的微濕布巾擦拭，可拉動抽屜可用沾有少許異丙醇或酒精的棉簽 擦拭。5.1.2 為保持檢測工作臺不受污染，可用75函用酒精擦拭桌面，或在超凈臺內操作。5

20、.1.3 操作時要戴一次性無菌手套，或用75函用酒精擦拭雙手以免試劑、臺面污染。5.1.4 臨用前套上無菌移液管尖，使用移液器吸取或轉移試劑、樣品時務求準 確，避免移液器與樣品或試劑交叉污染。5.1.5 完成檢測后，立即取下過濾比色杯。未取出前，避免晃動或倒置微量熒 光檢測儀以免杯內試劑濺出污染光學部件。5.1.6 冷藏或冷凍樣品將導致其中微生物（細菌）細胞ATP量變化明顯，應于避免，或待完全解凍平衡至室溫后再做檢測并設置對照。5.1.7 高鹽、高離子、高糖或高油脂組份將干擾 ATP檢測，重復加入體細胞裂 解試劑（TRA可改善。5.2 故障排除：故障可能原因排除方法在無過濾比色杯或樣 品情況卜

21、，可拉動抽屜 推入后，仍顯示高背景 讀數1、抽屜被樣品污染2、光敏部件有誤1、用酒精擦抽屜去除污染2、更換或檢修測光儀有樣品的可拉動抽屜推入后無讀數1、電池電量不足2、斷電3、可拉動抽屜關閉不嚴1、如顯示電池電量不足，需充電2、查對供電情況3、重新關閉抽屜給出的讀數顯著低于應啟讀數1、試劑過期，失效2、加入LLR試劑后沒有 立即關閉抽屜讀數3、樣品經冷凍或冷藏后 使其中的細菌細胞內ATP量顯著降低1、及時更換試劑2、更換樣品，重新試驗讀數3、待樣品及試劑恢復到室溫 后再測定6、對應關系曲線6.1 ATP濃度和相應熒光值（RLU關系曲線(33翹架割我即ATP戒度（atTODOll與分別表示采用本

22、公司提供的微量熒光檢測儀及美國New Horizons 公司 PROFILE-1-3560微量熒光檢測儀所得結果。 分別以log相對熒光值（RLU、logATP濃度（atto mol）值為縱坐標和橫坐標作圖（ y = 0.8362x + 1.175 , R2= 0.9866 ）。上圖表明，在 ATP濃度 為1pmol 1nmol范圍內，ATP濃度與 RLU呈線性關系。6.2 不同濃度多種細菌混合物熒光值和相應細胞數關系曲線圖i<nIM期電思穎CFU/iiD、分別表示三批次不同濃度大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物的混合 物，進行平皿計數和相對熒光值檢測 （本公司微量熒光檢測儀），并

23、分別以10g相對熒光值（RLU 和log平皿計數值（cfu/ml ）為縱坐標和橫坐標作圖。由上述關系圖推演的RLU-CFU （相對熒光值對應細菌菌落總數）可供參考。7、有關食品安全和衛(wèi)生檢測的問答一問：哪些因素可能影響食品安全和衛(wèi)生？生物（如細菌總數超標、致病菌污染等）、化學（農藥殘留、有毒添加劑等）、 物理（放射污染等）及轉基因產品（有害遺傳效應等）四大因素。其中，以細菌污 染食物、飲用水引發(fā)食源性中毒最為常見，其危害的范圍最廣。二問：國內外通常采用什么方法進行食品細菌總數和衛(wèi)生、防疫檢測？“常規(guī)法”和“ATP熒光快檢法”。常規(guī)法是我國衛(wèi)生部規(guī)定至今仍然沿用的方 法，因此，又稱“國標法”，即

24、（細菌）活細胞平皿計數法。三問：“常規(guī)法”和“ ATP熒光快檢法”的共同點和主要差別是什么？兩種方法都能用于檢測樣品中的細菌總數，提供有關衛(wèi)生防疫數據。主要差別 在“時效性”，常規(guī)法至少要12天才能得到結果，快檢法能在15分鐘內得到 實時檢測數據。四問：為什么兩種方法在“時效性”上有這樣大的差異呢？因為它們所依據的基本原理各不相同?！俺Ｒ?guī)法”是讓檢樣中原先看不見的細 菌細胞，在稀釋涂布后通過在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上 37C, 48小時的保溫培育，這樣， 一個活的細菌細胞經多次分裂繁殖形成數以億計，肉眼可見的細菌集群（菌落），然后通過計數得到結果，即菌落形成單位/毫升（克）CFU/ml （g）?！癆T

25、P熒光快檢法”則基于蟲光素酶能催化細菌細胞的ATP發(fā)出熒光，熒光檢 測儀能快速、準確計量熒光值的原理。因此，檢樣中細菌細胞越多， ATP*就越大， 發(fā)出的熒光就越強。這樣，在排除檢樣中非細菌ATPT擾的情況下，檢測熒光值（RLU 就能確定細菌的細胞數CFU/ml （g）。五問：兩種檢測方法哪一種更準確？兩種檢測方法得到的數據一致嗎？在回答這一問題前，讓我們重溫微生物學的兩個基本概念：細菌或微生物對人 類生活，生產造成的有利（如用于抗菌素生產）或有害影響（如污染食品、引發(fā)疾 ?。┒挤菃我换蛏贁导毦毎淖饔?，而是單位體積內數以十萬、百萬細胞群體的 效應。其次在適宜條件下，細菌每 2030分鐘就能

26、分裂繁殖一代。以大腸桿菌為 例，10萬個細胞/毫升二小時后就成了 640萬細胞/毫升。因此，正確的回答是，兩種方法都能滿足特定時期細菌總數檢測和衛(wèi)生監(jiān)測的 需求，但時效性有重大差異。快檢方法更有利于保障食品安全水平的全面提高。通 過常規(guī)法和ATP熒光快檢法實際檢測建立一個兩者之間可以互相參照，符合食品安 全衛(wèi)生標準的有效范圍（如合格、警告、不合格）是發(fā)達國家的通用做法。六問：在食品安全方面國外有哪些值得借鑒的經驗和措施？上世紀90年代后，美、英、日等國就已依據螢火蟲發(fā)光原理，研制并推廣使 用ATP熒光法快檢設備用于檢測食品細菌總數或衛(wèi)生防疫監(jiān)測。這些設備既能提供 實時的檢測數據，又有準確、便攜

27、、使用容易等特點。不僅彌補了 “常規(guī)法”時效 性差的不足，又能發(fā)揮防患于未然的預警作用。有效地保障了食品安全總體水平的 提高，也促進了如HACC喈食品衛(wèi)生理念的誕生。七問：HACC隊證體系的主要涵義和作用是什么？HACC陛“危害分析關鍵控制點” 一t的英語縮寫，源于上世紀 70年代美國太 空總署提出的有關食品安全基本理念，即（1）危害食品安全的可能因素包括生物 （轉基因產品）、化學、物理四個方面；（2）從原料到食品通常經歷加工生產一產 品包裝、儲存、運輸一配發(fā)銷售等環(huán)節(jié)；（3）食品原料的品質、生產環(huán)境、設施、 操作人員的衛(wèi)生水平都將影響終產品一食品的安全衛(wèi)生水平。因此，只有將所有可 能影響食品

28、安全的危害因子全部納入監(jiān)控范圍，采用快檢方法實施監(jiān)控才能從源頭 開始，從而有效地保障食品，并留有補救時間防患于未然。美、日、歐盟等國已將實施HACCP1證體系列為法定措施。我國衛(wèi)生部已于2002 年頒發(fā)食品加工企業(yè)的HACC改施指南衛(wèi)法監(jiān)發(fā)174號。八問：“ATP熒光快檢法”和實施食品安全的HACC頤警、溯源管理制度有何關系？在建立和推廣使用ATP熒光法快檢技術前，只能靠目測或平皿計數法評估產前 或清潔消毒后生產線、食品接觸表面的衛(wèi)生水平。這兩種方法要不是靈敏度不夠， 就是取得結果的時間太長，無法滿足生產的實際需要。換一句話說，只有采用 ATP 熒光法快檢一類方法才能實施HACC和食品安全的溯

29、源和預警制度。九問：美、日、歐盟各國如何評價 ATP熒光快檢法和建立相關檢測標準？通過ATP熒光快檢法得到的是來自食物殘渣和微生物細胞兩個部分ATP的總值。多數情況下，來自微生物細胞的比例較小。但是，由于食物殘渣既是微生物生 長的培養(yǎng)基，又起抵消滅菌效果的作用。因此，關鍵在確定避免重新污染的ATP臨界值，而非單純依據細菌細胞 ATP值折算的細菌菌落數(cfu)。這就是多數衛(wèi)生監(jiān) 測試劑盒不設置通用ATP標準，也不必期望ATP與CFlfc間有確定相關關系，容易 引起初用者疑慮的原因。統(tǒng)計結果證實，凡 ATP熒光法顯示衛(wèi)生水平改善，則平皿 計數結果也一定改善。如果檢測點 ATP*平高，即便是無菌的

30、，次日早上必然大量 滋生細菌導致食品污染。因此，發(fā)達國家的普遍做法是：首先通過ATP快檢步驟對食品原料及經過清潔、 消毒后食品原料接觸表面是否達到衛(wèi)生標準作出有數字依據的評價。其次，對易于 引發(fā)微生物污染的關系部位實施重點監(jiān)控。最后，制訂出符合本單位情況，又符合 衛(wèi)生要求的ATP數值范圍。十問：具備什么條件有利于在我國普遍實施HACCP1證體系？(1)發(fā)展擁有我國自主知識產權的食品安全關鍵技術，提供準確、有效、便 攜、操作容易、價格能為國內廣大用戶接受的食品安全檢測設備和試劑系統(tǒng)。(2)建立與快檢技術相匹配的國家、企業(yè)檢測標準。(3)普及與快檢技術相關的衛(wèi)生學和衛(wèi)生監(jiān)督指導新理念、新知識。8.

31、具體樣品檢測的操作方法及方案飲用水細菌指標ATP生物熒光快速檢測法和分級判定(草案)1范圍本標準規(guī)定了飲用水細菌指標 ATP （三磷酸腺甘）生物熒光快速檢測法的術語和定義、試驗方法、細菌指標的分級及判定。本標準適用飲用水細菌指標的現場快速檢測。2術語和定義2.1 相對發(fā)光值 rlu （relative light unit ）樣品與試劑反應經微量熒光檢測儀檢測后，所顯示在儀器上的讀數。3原理在有氧的條件下，蟲光素酶催化D-熒光素和ATP之間發(fā)生氧化反應，形成氧化熒光素并發(fā)出熒光，其生化反應式如下：ATP+ D-Luciferin + Q Mg2+ AMP + Oxyluciferin + PP

32、 + CO+ LightLuciferase當反應系統(tǒng)中，蟲光素酶和D-熒光素處于過量的情況下，熒光的強弱取決于ATP的數量。以檢測含細菌的樣品為例，細菌細胞越多，ATP量越高，發(fā)出的熒光也就越強。在排除樣品中非細菌ATP干擾的情況下，通過熒光值就能確定樣品中細菌ATP的含量，通過測量相對熒光值從而快速得知被檢飲用水的細菌指標。4試驗設備和材料4.1 微量熒光檢測儀：量程范圍0-10 10cfu/mL實際檢測靈敏度（ATP）5 x 10-18mol檢測時間1秒-99秒自由設定精確誤差士 5燦儀器生產廠家采用穩(wěn)定的 C1做射源進行定標、校準可檢波長300nm 650nm4.2 試劑組，按檢測操作

33、順序分為：體細胞裂解試劑：主要成份是非離子去污劑及表面活性劑，能專一而有效地裂解樣品中的非細菌細胞（體細胞）并釋出ATP,然后使用過濾比色杯底部的濾膜將體細胞裂解試劑、體細胞碎片及游離 ATP排除，試劑可室溫保存。細菌細胞裂解試劑：主要成份是陽離子去污劑及表面活性劑，能專一而有效地裂解樣品中細菌細胞并釋出 ATP,試劑可室溫保存。熒光反應試劑組：主要成份是D-熒光素、蟲熒光素酶、鎂離子，能與樣品中的細菌ATP相互作用并發(fā)出熒光，20C低溫避光貯藏。4.3 樣品預處理耗材。過濾比色杯的杯架一個，用于固定過濾比色杯。加壓器一個，用于加壓、排出體細胞ATP和體細胞裂解試劑。帶0.45科m濾膜熒光反應

34、過濾比色杯，為熒光反應容器。專用無菌吸水紙，置于過濾比色杯架，吸取加壓后流出的液體。帶密封圈無菌濃縮器，用于濃縮樣品。自備微生物學無菌操作所需常規(guī)用具、器皿、樣品采集無菌、無ATP的容器、塑料袋、手套、鐐子等。5分析步驟5.1 打開微量熒光檢測儀電源，使微量熒光檢測儀進入系統(tǒng)初始化。5.2 飲用水的濃縮處理：用注射器從樣品中取出10ml的待測飲用水。打開微量熒光檢測儀檢查過濾比色杯讀數為0后，將過濾比色杯放入無菌濃縮器內，并使注射器接到濃縮器上，用適當的壓力緩緩推下注射器柱塞，直到注射器中的溶液推凈。用消毒過的鐐子從濃縮器中取出過濾比色杯，放在墊有吸水紙的過濾比色杯架上。5.3 樣品檢測步驟：

35、5.3.1 取出過濾比色杯架，底層墊放5張專用無菌吸水紙，并將帶濾膜比色杯放入架眼內，用移液器吸取檢樣 50科L注入杯底。檢測前打開熒光檢測儀電源，此時液晶顯示屏顯“0”值。5.3.2 將體細胞裂解試劑向杯中滴加4滴，加壓器置杯頂加壓，使杯中非細菌 ATP游離ATP通過底部濾膜排出，由吸水紙吸凈。重復加壓步驟一次。5.3.3 將細菌細胞裂解試劑向杯中滴加2滴，取下比色杯置于可拉動抽屜內。5.3.4 用移液器從熒光反應試劑瓶吸取熒光反應試劑50 dL加入杯底，緩和地吸擠三次，混勻反應液。（關閉抽屜）5.3.5 設置檢測時間為10s,屏幕顯示的相對熒光值（RLU對照標準進行合格及不合格判a

36、3;o6細菌指標分級及判定分級及判定見表1。RLU潔凈度分級判定<400清 潔合 格401 -1000警 告/ A 絲/卜 口 惜>1000污 染ATP生物熒光快速檢測衛(wèi)生學方面監(jiān)測（草案）衛(wèi)生監(jiān)測方面檢測可以使用中西公司生產的ATP熒光法餐飲具及清潔度快檢試劑。范圍、術語和定義、原理、試驗設備和材料參照“飲用水細菌指標 ATP生物熒光快速檢測法和分級判 定”。簡易操作如下：，取出1根（1）帶上一次性無菌手套，打開餐飲具清潔度快檢試劑包裝袋（鋁膜復合包裝）無菌棉簽，并掰下一個透明檢測杯，注意不要污染杯內白色檢測膜。(2)取無菌棉簽，在棉簽頭部滴加5滴細菌細胞釋放劑(XRA),使棉簽

37、頭部濕潤，然后用此2棉簽在被測處橫豎往返均勻涂擦，并隨之轉動棉簽，采樣總面積100cm。(3)將透明檢測杯放入可拉動抽屜小孔內，再向棉簽頭部滴加1滴細菌細胞釋放劑(XRA)后置于透明檢測杯中的白色檢測膜上，使液體全部被吸收。(4)立即關閉抽屜，進行測試操作。操作應該迅速，務求試驗操作時間一致以得到平行測試數據。測量完畢前不可再拉動抽屜。(5)屏幕顯示相應的測試結果。RLU潔凈度分級判 定<300清 潔合 格301-900警 告/|、 口 怕900污 染ATP熒光法應用于化妝品微生物的比對試驗方案根據國外知名ATP快檢企業(yè)Celsis在其網站上提過的相關資料可以知道，當 檢測化妝品時使用R

38、apiscreen系統(tǒng)一般需要24-48小時，這個過程主要是一個微 生物的富集和增殖的過程。通過24小時增殖的過程可以檢測到1 cfu/g的微生物， 所以微生物的污染程度很低的時候理論上低于1000cfu/g就有必要進行這種富集和增殖的過程。對于低微生物污染的情況一般的富集和增殖的過程只需要簡單的三個步驟：把樣品用培養(yǎng)基稀釋成(1% -10% w/v),可根據國標1: 10進行稀釋。在32c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時，具體時間根據樣品判定標準和試劑靈敏度 確定。經過培養(yǎng)后取均勻的50微升用ATP熒光法進行檢測。進行樣品微生物富集和增殖的培養(yǎng)基也是關鍵，培養(yǎng)基要能保證適合各種微生 物生長并且能夠

39、中和樣品中的防腐劑和去污劑成分，同時培養(yǎng)基本身的ATP背景要保證非常低。Letheen牌的改良肉湯培養(yǎng)基是個不錯的選擇，如果沒有可用國標法 的培養(yǎng)基進行擴增培養(yǎng)。先用LLR試劑檢測國標法的培養(yǎng)基如果 ATPW景較高，則需要用apyrase處理使本底降低。目前國標法中和劑為卵磷脂和吐溫80。1實驗儀器試劑1.1 樣品：市面上銷售的化妝品，每個樣品都需有無菌對照樣品1.2 儀器和試劑1.2.1 儀器ATP 生物發(fā)光快速檢測系統(tǒng)配套儀器，包括：BLW0401微量光度計、過濾比色杯、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、1ml移液槍及槍頭。1.2.2 試劑發(fā)光反應試劑(LLR)、細菌細胞ATP釋放試劑(X

40、RA、卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、液體石蠟和吐溫80、PBS緩沖液。卵磷脂、吐溫80一營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分：蛋白陳20g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g卵磷脂1g吐溫80 7g蒸儲水1000mL現在有商售的，可直接加水配制。卵磷脂、吐溫80一營養(yǎng)液體培養(yǎng)基成分：蛋白陳20g牛肉膏3g氯化鈉5g卵磷脂1g吐溫80 7g蒸儲水1000mL制法：先將卵磷脂加到少量蒸儲水中，加熱溶解，加入吐溫 80,將其他成分加到其 余的蒸儲水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、 ？吐溫80,混勻，調pH值為7.1 7.4, 103.43kPa (121C 15 lb ) 20min高壓滅菌，儲存于冷暗處備用。0.5 %氯化

41、三苯四氮口坐(2,3,5-triphenyl terazolium chloride , TTQ成分：TTC 0.5g蒸儲水100mL溶解后過濾，103.43kPa (121C 15 lb) 20min高壓滅菌，裝于棕色試劑瓶，置4c 冰箱備用。2實驗方法取化妝品10g置于滅菌的錐形瓶中，用培養(yǎng)基稀釋成(1% - 10% w/v),可根據國標1: 10進行稀釋，對于油包水型化妝品還應加液體石蠟和吐溫80助溶劑，充 分震搖樣品使其充分混合均勻，在 32c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時。2.1 平板菌落計數法按照化妝品衛(wèi)生規(guī)范（2007年版）中菌落總數的檢測方法進行檢測。2.2 ATP熒光法2.2.1

42、 用移液槍抽取50履 樣品加入到過濾比色杯；2.2.2 再滴加2滴XRA2.2.3 用移液槍加50口LLR ,推入儀器抽屜讀數。3實驗結果3.1 平板菌落計數法根據化妝品衛(wèi)生規(guī)范（2007年版）中微生物檢驗法總則 中的相關菌落計數方法進行平板菌落的計數。3.2 ATP熒光法的標準確定將ATP熒光法測的熒光值與相應的菌落計數法所得的數值進行比較，初步確定 出ATP熒光法檢測化妝品菌落總數的判定標準。然后再通過3-4個批次的ATP熒光法檢測結果與國標法得到的細菌數進行比對來修正判定標準。ATP熒光法應用于乳品微生物的應用指南一、背景資料AT吸光法細菌總數快速檢測方法是乳品中細菌總數快檢中較為成型的

43、方法， 已經在歐美普遍推廣，我國的臺灣地區(qū)于1999前后引進并推廣該技術。目前國際上 比較有名的Celsis M4000 system是這個方面的先驅，但價格極為昂貴售價約為人 民幣50萬左右，難于得到廣泛應用和推廣。南京農業(yè)大學周劍忠、董明盛發(fā)表的生物熒光技木在乳品工業(yè)中的應用及 東北農業(yè)大學田波、霍貴成等發(fā)表的乳與乳制品中細菌總數的檢測技術，分別 屬于國家科技攻關項目（2002BA518A12）和“十五”重大攻關項目（ 2002 BA518A06 均把AT吸光法細菌總數快速檢測方法作為一個乳品中細菌總數快檢的一個成型技 術和發(fā)展方向加以介紹和推廣。中西公司自主開發(fā)生產的AT吸光法細菌總數快

44、速檢測已經達到了國外先進水平，并在東北農大教育部乳品重點實驗室和國家食品質 量監(jiān)督檢驗中心進行了相關原料奶的相關技術性能驗證實驗，得到的結果是工作性能比較穩(wěn)定，對周圍環(huán)境要求低（電流、電壓、噪聲、溫度等），體積小，易操作， 工作流程簡捷、清晰，操作結果可儲存并以文件記錄的方式查詢，可與電腦連接實 時檢測并傳輸檢測結果，可直接將檢測數據轉換成 EXCEL件，便于統(tǒng)計、匯總。 經過對比在原料乳的檢測中可有效排除原奶中的游離體細胞干擾，ATP僉測結果與國標法檢測結果基本相符合。二、乳品檢測中應用的方向1 .在未經處理的原料乳質量控制中的應用用ATW物熒光法對原奶中的細菌總數進行檢測，可以便于乳品企業(yè)

45、在收奶的過程 中對原奶的品質做出快速判斷，不合格的原奶當場拒收，合格的可根據檢測結果對 其進行分級。2 .在巴氏殺菌奶質量控制中的應用制定貨架期，控制巴氏殺菌后牛奶的二次污染對公眾的健康有著重要意義。用 ATP 生物熒光法測得選擇性培養(yǎng)牛奶中的 ATPt后，就可預測巴氏殺菌奶的貨架期，這 種試驗和最近歐洲委員會介紹的保證質量試驗的結果一致。3 .用于UH就和其他乳制品的無菌檢測用平板計數法檢測無菌UH初耗時長，等檢測結果出來后，產品已經上市流通造成 也影響也很難挽回。AT吸光法細菌總數快檢方法可以在產品出廠前就得到產品的 衛(wèi)生安全情況，而且這種方法對UHT5克力奶特別有用。另外生物熒光檢測也常

46、被 用來檢測奶粉中的細菌總數。4 .牛奶中抗生素或噬茵體殘留的快速檢測牛奶中的乳酸乳球菌和嗜酸乳桿菌，在含抗生素或被噬菌體污染的牛奶中乳酸菌的 生長受到了抑制，其抑制程度與抗生素含量或噬菌體污染程度有關。通過乳酸菌在 牛奶中生長時ATPE化的檢測，可以很快檢出牛奶中的抗生素或噬菌體的殘留，在 90 min內可檢測到低于0.005 U /mL勺青霉素。5 .在衛(wèi)生監(jiān)測方面的應用在乳制品的生產過程中，加強對設備衛(wèi)生、環(huán)境衛(wèi)生、個人衛(wèi)生的管理，可以防止產品的二次污染，延長產品的保質期。利用 ATW物熒光檢測，可以在5 min內檢 出結果，及時知道清洗消毒的狀況，如果不符合標準，可以重新進行清洗消毒。

47、這 樣就可以保證最終產品的質量，起到事先控制的作用。ATW物熒光監(jiān)測也可用來監(jiān)測奶制品生長過程中的關鍵控制點，及時了解關鍵控制點的檢測結果，將事故隱 患消滅在萌芽之中，從而確保產品的安全可靠。三、ATPt光法細菌總數快檢方法在乳品中的應用3.1 原奶樣品制備無菌條件下將原奶樣品稀釋適宜濃度，當原奶中的脂肪含量不高于國家標準 1.5倍 按1: 10用滅菌PBS容液稀釋；當原奶中的脂肪含量高于國家標準 1.5倍按1: 20 用滅菌PBS容液稀釋。3.2 UHT奶和其他要求商業(yè)無菌乳制品中菌落的富集培養(yǎng)及殘存抗菌素的中和對于低微生物污染的情況一般的富集和增殖的過程只需要二個簡單步驟：把樣品用國標法卵

48、磷脂、吐溫 80一營養(yǎng)液體培養(yǎng)基稀釋成10% w/v,稀釋方 法參照國標法微生物檢測操作。乳制品和卵磷脂、吐溫80一營養(yǎng)液體培養(yǎng)基10晰釋7在32。叵溫振蕩培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)8小時。3.3 ATP熒光法檢測操作(1)按照標準化操作取50/制備好的樣品加入到ATP檢測杯中，并將ATP 檢測杯置于比色杯架內，底部鋪墊吸水紙。(2)向杯底滴加4滴TRA用加壓器推擠液體，使含非細菌細胞的溶解物通 過杯底濾膜。重復上述步驟一次(如果是花式奶一般TRA洗滌過程需要5次可洗 凈糖類、食品添加劑、乳酸菌等干擾)。(3)手持XRA式劑瓶，棄去第一滴，然后向ATP僉測杯底垂直滴加兩滿滴 XRA 從過濾比色杯架取下比色

49、杯，并放進光度計的抽屜內。(4)用無菌的移液器從LLR試劑瓶吸取熒光反應試劑組50仙l加入杯中，和 緩地吸擠3次，混勻反應液。保持擠吸時間、次數一致十分關鍵。默數從 LLR加 入樣品直到關嚴抽屜的時間，并力求所有樣品的這段操作時間一致。(5)關上微量光度計抽屜，此時微量光度計自動進行熒光值測量，等微量光 度計顯示出熒光值后記錄屏幕顯示的相對熒光值(RLU o3.4 國標法：菌落總數按照 GB/T4789.2-2003規(guī)定菌落總數的檢測方法進行檢 測。3.5 建立工作曲線：將每一試樣同時按照國標法和 ATP法進行檢測，以國標法 檢測的菌落總數(CFU/g)的對數值為橫坐標，以 ATP法所得RLU

50、值的對數值為縱坐標作圖并進行線性回歸分析，得到兩種方法的相關關系，當每一類試樣的相關系 數達到一定要求（r0.8）后，將其與以往的工作曲線進行比較并修正，等到一個 較為科學的工作曲線并將回歸方程的系數添加到 ATP熒光微量光度計中，用于后繼 實驗。3.6 比對試驗：用獲得的工作曲線把各樣品在檢測時得到的RLUft算成菌落總數對數值，再與該樣品用國標方法得到的菌落總數對數值作相對誤差來進行比較。3.7 添加劑影響實驗：實驗中得到的明顯偏離已有標準曲線的原料乳進行抗生 素等添加劑的檢測，用以印證添加抗生素是否會引起發(fā)光值的偏離。同時某一樣品 添加不同濃度的抗生素或其它乳品常見添加劑并檢測乳品中微生

51、物的發(fā)光值。再將 添加不同濃度的抗生素或其它乳品常見添加劑乳品按國標法檢測其中含有的菌落 總數。四、實驗操作注意事項：1 .經實驗驗證本系統(tǒng)配備的細菌細胞 ATP釋放試劑（XRA對于處在抱子狀態(tài) 的細菌裂解率比較低，所以對奶品在實驗前應經 37c溫育30分鐘使抱子活化成為 營養(yǎng)細胞。2 .生乳放置時間過長油脂析出分層，脂肪凝結破壞生乳的自然狀態(tài)，影響實 驗結果的準確性，因此該儀器較適宜新鮮生乳的菌落總數檢測。3 .從冰箱取出的生乳樣品應在室溫平衡一段時間， 否則可能導致細菌中的ATP 沒有恢復到自然狀態(tài)而使檢測結果的熒光值偏低。4 .液態(tài)奶稀釋時應充分混勻，否則影響實驗數據的重現性。同時應嚴格

52、按照 國標方法進行平皿涂布，確保涂布平皿與熒光值有可比性。5 .如在ATP熒光檢測實驗過程中，發(fā)現某一樣品多次測量其RLU值均異常高超過200萬時，則應再進一步稀釋倍數，使其 RLUB落在儀器最佳測量值范圍內。6.滴加TRA后，應將體細胞完全排凈，否則影響最終數值。測量過程中保證光度 計電量充足，否則影響數據準確性。第二部分 ATP熒光法微生物（細菌總數）快速檢測系統(tǒng)使用說明1、技術參數及性能檢測時間1秒-99秒自由設定靈敏度5X 10-18mol/L (標準 ATR檢測范圍0-1010cfu/ml 或 10-13mol/ml-10 -9mol/ml (ATB重復誤差（批間差）<

53、7;5 %數據輸出RLU （細菌細胞ATP含量）、菌落總數存儲媒體FLASHROM 64KB數據存儲數據以文件方式分類儲存數據內容包括RLU（數值）、菌落總數、樣品名稱、文件名、記錄號、 日期、時間、檢測時間長度等菌落總數換算公式可自由設定儲藏空間1000個數據記錄顯小方式4行漢字LCD液晶顯示數據查詢以文件記錄方式查詢連續(xù)工作時間連續(xù)工作時間大于10小時計算機連接US眼口電源充電鋰電池供電與PC連接可實時檢測并傳輸檢測結果PC機軟件數據存入ACCES數據庫可以多種方式查詢、統(tǒng)計、匯總等； 可宜接將檢測數據轉換EXCELS件儀器尺寸165x 90 x 55 mm儀器重量0.65Kg操作溫度5

54、c 60 C相對濕度20 80%2、儀器操作說明2. 1開機、初始化開機后，儀器進行系統(tǒng)初始化，如果日期、時間沒有設置，屏幕會提示（如圖1.1 ）,進入主菜單工作界面。請輸入日期、時間圖1.1特別提示：日期和時間是很重要的數據。請參照2. 2. 4主菜單工作界面（如圖1.2）測試-查 詢參數設置通 訊圖1.2利用，或f鍵可以選擇菜單項，然后按鍵選擇“測試”，儀器進行初始化。初始化XX圖1.3初始化的時間長度設定請參照2.2.5說明，工作方式為倒計時。2. 2參數設置將圖1.2的光標移到第3行，“參數設置"，按®D鍵后顯示（如圖2.1 ）設置樣品 設置文件名類型 設置日期時間 設置檢測時間 U盤格式化圖2.1以方便查詢測試“樣品名”，詳細“設置樣品”的功能是將被測試的樣品以名字或符號的方式存儲在儀器中，結果。“樣品名”由上位機軟件設定并傳輸給儀器，儀器中最多可以設定8個說明見上位機軟件。2. 2. 1選擇RLU方式圖2.4圖2.2RLU方式是指儀器只將檢測結果以RLU數值顯示輸出，而無任何判定結果。圖2.2按顯示信息如下：樣品名：RLU合格值：無污染值：無K=無 b=無圖2.32. 2. 2選擇其它樣品名方式RLU方式水A牛奶SY利用J或f鍵，選擇“樣品名”樣品名：牛奶SY