綠色熒光蛋白_GFP_的特性及其在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用

1、綠色熒光蛋白(GFP 的特性及其在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用薛啟漢(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物遺傳生理研究所,南京210014薛啟漢:男,56歲,大學(xué),研究員。本綜述系聯(lián)合國(guó)教科文組織生物技術(shù)合作研究項(xiàng)目部分內(nèi)容。收稿日期:1997212202摘要作為1種新型、方便的活性標(biāo)記,來自水母的綠色熒光蛋白(GFP 正在多種原核和真核生物研究中應(yīng)用。近來研究表明,GFP 具有很多理想的特性,適合用作普遍的報(bào)告標(biāo)記,尤其適合于活體細(xì)胞或組織。譬如,GFP 在細(xì)胞中表達(dá),在藍(lán)光或紫外光照射下可以產(chǎn)生明亮的綠色熒光。而且,GFP 在細(xì)胞中呈自主性表達(dá),沒有細(xì)胞或位置表達(dá)的專一性,無需外源反應(yīng)底物,無需進(jìn)行細(xì)胞或組

2、織的固定和滲透處理,使表達(dá)檢測(cè)很方便。由于GFP 對(duì)光漂白、氧化劑、還原劑以及其它許多化學(xué)試劑具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性,因此,可用來監(jiān)測(cè)基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、共轉(zhuǎn)染、蛋白運(yùn)輸與定位,以及細(xì)胞系譜分類等。本文就GFP 的特性及其在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用潛力,作一簡(jiǎn)要闡述。關(guān)鍵詞綠色熒光蛋白(GFP ;分子生物學(xué)中圖法分類號(hào)Q 71Character istics of the Green Fluorescen t Prote i n (GFP and Its Application i n M olecular B iology ResearchX U E Q ihan(Institu te of A g

3、 robiolog ica l Genetics and P hy siology ,J iang su A cad e my of A g ricu ltu ra l S ciences ,N anj ing 210014Abstract T he green 2fluo rescent p ro tein (GFP from jellyfish A equorea v ictoria has been used as a convenientnew vital m arker in a w ide spectrum of p rokaryo tes and eukaryo tes.T he

4、 GFP gene has recently been show n to po ssess a m unber of desirable traits as a universal repo rter especially in living cells and tissues.Fo r examp le ,GFP exp ressed in cells can yield a brigh t green fluo rescence w hen the cells are excited by blue o r UV ligh t .GFP exp ressi on is cell auto

5、nomous and independent of cell type and locati on ,w h ich m akes its detecti on covenient w ithout need of exogenous substrates ,cell fixati on and per m ealizati on .M o rever ,GFP w ith mo re stabillity to pho tobleach ing ,oxidati on reducti on ,and chem ical reagents etc .can be used in monito

6、ring gene exp ressi on ,signal transducti on ,co 2transfecti on ,transfo r m ati on ,p ro tein traffick ing and localizati on ,p ro tein 2p ro tein interacti on ,cell seperati on and purificati on ,and cell lineage etc .T he characteristics of GFP and its po tential app licati on inmo lecular bi o l

7、ogy research w ere m ainly review ed in th is paper .Key words green fluo rescent p ro tein ;mo lecular bi o logy生物發(fā)光現(xiàn)象,在無脊椎動(dòng)物中很普遍。它是生物能量的一種轉(zhuǎn)換方式1,2。在水母(Jellyfish 中,當(dāng)能量從Ca +活化的水母蛋白(A equo rin 轉(zhuǎn)移到綠色熒光蛋白(Green F luo rescen t P ro tein ,簡(jiǎn)稱GFP 上以后,它即發(fā)出綠色熒光3,4?；铙wGFP 與純化的GFP 具有相同光譜特性,即吸收藍(lán)光,放射綠光?？?5江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)(J

8、 iang su J .of A g r .S ci .,1999,15(1:5258以用紫外燈、熒光顯微鏡或熒光活化流體分光光度計(jì)進(jìn)行活體檢測(cè)5。由于GFP 穩(wěn)定、靈敏度高、無生物毒性、熒光反應(yīng)不需要任何外源反應(yīng)底物及表達(dá)無物種或細(xì)胞組織的專一性,因此它是一種獨(dú)特的報(bào)告蛋白(R epo rter p ro tein ,可廣泛用于基因的表達(dá)與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移及相互作用、信號(hào)傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化,以及細(xì)胞的分離與純化等研究領(lǐng)域。90年代后,有關(guān)GFP 及其利用的研究進(jìn)展較快,已引起分子生物學(xué)家極大的興趣與關(guān)注。本文僅闡述GFP 的一些基本特性、研究進(jìn)展,以及在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用前景。1G

9、FP 的結(jié)構(gòu)、特性與功能1.1GFP 的結(jié)構(gòu)P rasher DC 首先克隆了水母Jellyfish (A equorea v ictoria GFP 的c DNA 6。c DNA 克隆的序列分析(圖1表明,GFP 編碼的238個(gè)氨基酸的多肽單體,推導(dǎo)分子量M r =26888, 與先前用變性電氨基酸序列下方橫線部位表示從天然GFP 直接測(cè)定的序列。T he ho rizontal lines underline tho se aa sequenced directly from native GFP .圖1gfp 10D NA 的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列6F ig .1Nucleotid

10、e sequence of the gfp 10D NA and the dedused aa sequence 6泳測(cè)得的天然GFP 分子量(30KD a 接近。根據(jù)DNA 序列推導(dǎo)的氨基酸序列與大部分天然GFP 的多肽片段相同。只有完整的GFP 分子才會(huì)產(chǎn)生生物熒光,但與熒光的產(chǎn)生直接有關(guān)的是GFP 分子中一小段被稱為色基(Ch rom op ho re 的部位(圖2。在GFP 的初級(jí)氨基酸序列上,第6567個(gè)氨基酸(Ser 2T yr 2Gly 形成環(huán)狀六肽三體,以共價(jià)形式與GFP 蛋白肽鍵骨架相連7。色基形成的機(jī)理目前尚不清楚,但在有分子氧存在的條件下,酪氨酸氧化成脫氫酪氨酸,并環(huán)化形

11、成六肽,這可能是形成色基的必然過程8。Sh i m om u ra 最先推導(dǎo)了水母GFP 色基結(jié)構(gòu)9,后來W ard 等進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證與修改。GFP 的c DNA 克隆序列分析表明,在216kb 范圍內(nèi)至少分布有3個(gè)啟動(dòng)子,組成色基的Ser 2T yr 2Gly 三體就位于第二個(gè)內(nèi)含子3端。NN CH CH 2OHN HC OCH H 2NCH 2CHHOO CH 2C O N HCH CH CH 3CH 3C O N HCH COOHCH 2CH 2C O N H 2圖2GFP 色基的結(jié)構(gòu)及附近序列6F ig .2Structure of the GFP chro mophore and

12、nearly sequence 61.2GFP 的光譜特性GFP 吸收的光譜,最大峰值為395nm (紫外,并有一個(gè)峰值為470nm 的副峰(藍(lán)光;發(fā)射光譜最大峰值為509nm (綠光,并帶有峰值為540nm 的側(cè)峰(Shouder 。GFP 的光譜特性與熒光素異硫氰酸35薛啟漢:綠色熒光蛋白(GFP 的特性及其在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用鹽(F ITC很相似,因此為熒光素F ITC設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡濾光片組合同樣適用于GFP觀察。盡管450 490nm(藍(lán)光是GFP的副吸收峰,但由于長(zhǎng)波能量低,細(xì)胞忍受能力強(qiáng),因此更適合于活體檢測(cè)。Ch rom a技術(shù)公司(Ch rom a T echno log

13、y Co rp.B rattlebo re,V T05301,U SA已研制出一系列適合于GFP觀察的濾光片組合。利用重組突變10,11,12和數(shù)字聯(lián)想分光顯微鏡(D igital I m aging Sp ectro scop y技術(shù)13,14,15可以誘發(fā)GFP色基突變,改變GFP光譜特性。H ei m R等16,17獲得了野生型GFP的一系列隨機(jī)突變,其激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)都發(fā)生了變化(表1。如獲得的藍(lán)色熒光突變,就是原GFP分子中表1野生型GFP突變的特性16Table1Character istics of mutated VS.wild-type GFP16綠色熒光蛋白GFP1突變M

14、 utati on激發(fā)光譜最大值Excitati onm axi m a(nm發(fā)射光譜最大值Em issi onm axi m a(nm相對(duì)熒光R elativefluo rescence(%野生型W ild type無N one396(476508(503(=100突變體H9 M utant H9Ser2202PheT h r2203Ile398511117突變體P9M utant P9Ile2167V al471(396502(507166突變體P11M utant P11Ile2167T h r471(396502(507188突變體P4M utant P4T yr266H is3824

15、4857突變體W M utant W T yr266T rp458480未測(cè)N on deter m ine括號(hào)內(nèi)數(shù)字為實(shí)測(cè)波長(zhǎng)變化范圍。B racketed data indicates the variable extent of tested excitati on spectra.1GFP=Green F luo rescent P ro tein.第66個(gè)氨基酸由酪氨酸突變成的組氨酸,但熒光信號(hào)減弱了近50%。D elagrave S獲得的紅色漂移(R ed2sh ifed突變,與野生型GFP相比,其激發(fā)波長(zhǎng)向紅色方向漂移了近100nm18。具有不同光譜特性的GFP突變體的獲得,使在

16、同一細(xì)胞中同時(shí)分析兩種不同蛋白或啟動(dòng)子成為可能,可以用于發(fā)育細(xì)胞學(xué)、藥物篩選、分析診斷等研究。1.3GFP的穩(wěn)定性GFP熒光極其穩(wěn)定,在熒光顯微鏡強(qiáng)光照射下,GFP抗光漂白(Pho tob leach ing能力比熒光素(fluo rescein強(qiáng)19。特別在450490nm藍(lán)光波長(zhǎng)下更穩(wěn)定,但在340390nm或395440nm范圍內(nèi),仍會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象。GFP在不同物種中穩(wěn)定性不同,在果蠅和斑紋魚(Zeb ra fish中極穩(wěn)定;在大腸桿菌中會(huì)有光漂白;在線蟲中10mM的N aN3將加速光漂白。GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光,強(qiáng)還原劑如5mM N a2S2O4或2mM FeSO4能使GFP

17、 轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问?但一旦重新暴露在空氣或氧氣中,GFP熒光便立即得到恢復(fù)。而一些弱還原劑,如2%巰基乙醇、10mM DD T、10mM還原谷胱甘肽、10mM半胱氨酸等并不影響GFP熒光。中度氧化劑對(duì)GFP熒光影響也不大,如生物材料的固定、脫水劑戊二酸或甲醛等,但GFP對(duì)某些封片指甲油特別敏感,苯氧丙烷對(duì)GFP熒光也有影響。強(qiáng)氧化劑如1%H2O2,或硫氫基試劑如1mM D TNB會(huì)造成GFP不可逆性破壞20。大多數(shù)中等濃度的有機(jī)試劑不減弱GFP熒光,但其最大吸收峰值會(huì)改變21。在高蛋白、高鹽條件下,GFP通過疏水反應(yīng)形成二聚體,使470nm吸收峰值下降近4倍。GFP很容易從細(xì)胞中分離并結(jié)晶22

18、。在離體狀態(tài)下,GFP蛋白對(duì)熱(70、堿性、除垢劑、鹽、有機(jī)溶劑和大多數(shù)普通蛋白酶(鏈霉蛋白酶P ronase除外有較強(qiáng)抗性23。GFP熒光在pH值為712時(shí)穩(wěn)定,在pH值為515 710時(shí)開始受影響24。在納克級(jí)水平,SD S2聚丙烯酰胺電泳凝膠中仍能觀察到GFP熒光。在高溫、極端pH、或胍基氯化物條件下,GFP會(huì)變性,熒光消失。一旦復(fù)性,熒光會(huì)部分恢復(fù)25,但可能需要某些硫醇類化合物的作用26。GFP在各種生物活體條件下表現(xiàn)穩(wěn)定。例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CA T在生物體內(nèi)很穩(wěn)定,用35S2甲硫氨酸分別標(biāo)記CA T和GFP,并轉(zhuǎn)染玉米葉肉原生質(zhì)體,用放線菌酮處理原生質(zhì)體,通過CA T檢測(cè),發(fā)現(xiàn)

19、510g m l放線菌酮可完全抑制CA T在玉米原生質(zhì)體中的蛋白合成,但通過GFP觀察,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,仍未發(fā)現(xiàn)GFP熒光有明顯減弱,僅有部分GFP被放線菌酮降解。說明GFP在植物活體細(xì)胞中比CA T還要穩(wěn)定27。此外,盡管GFP的消光系數(shù)較低,但和熒光素一樣,額定含量可高達(dá)80%。在熒光顯微鏡下,GFP 融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高,抗光漂白能力強(qiáng),因此更適用于定量測(cè)定與分析。但因?yàn)镚FP不是酶,熒光信號(hào)沒有酶學(xué)放大效果,因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報(bào)告蛋白。由于GFP熒光是生物細(xì)胞的自主功能,熒光的產(chǎn)生45江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)1999年第15卷第1期不需要任何外源反應(yīng)底物,因

20、此GFP是迄今為止唯一一種活體報(bào)告蛋白,其作用是任何其它酶類報(bào)告蛋白無法比擬的。2GFP在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用2.1GFP作為報(bào)告基因用于轉(zhuǎn)基因研究自P rasher DC從水母(A.v ictoria中克隆了GFP的c DNA后,GFP能在原核和真核細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)載體相繼被構(gòu)建成功。Chalfie M構(gòu)建了GFP大腸桿菌表達(dá)載體,GFP基因在T7啟動(dòng)子控制下很容易在大腸桿菌中高效表達(dá)。從轉(zhuǎn)染的大腸桿菌中分離的GFP蛋白與水母的天然GFP離體光譜特性無差異。利用維管蛋白(2tubu lin基因m ec2 7啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染線蟲(Caenorhabd itis eleg ans,在幼

21、蟲的4種胚性起源觸覺受體神經(jīng)元細(xì)胞中,觀察到很強(qiáng)、很穩(wěn)定的GFP熒光,包括部分2齡幼蟲、所有4齡幼蟲和絕大多數(shù)幼小成蟲。據(jù)報(bào)道, GFP基因在酵母(S accha ro m y ces cerev isiae、果蠅(D rosop h ila m elanog aster以及多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞(中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞系、人體胚性腎細(xì)胞系、猿猴Co s21細(xì)胞系以及鼠N I H3T3細(xì)胞系等中表達(dá),都相繼成功20,29,30,31,32。GFP在高等植物中的利用較晚,表達(dá)成功的例子還不多。Sheen J等報(bào)道,通過電擊法(E lectropo rati on轉(zhuǎn)染玉米葉肉原生質(zhì)體,有50%原生質(zhì)體觀察到G

22、FP熒光,集中在細(xì)胞質(zhì)或核周圍部。紫外光下液泡顯藍(lán)色熒光,藍(lán)光下葉綠體顯紅色熒光,出現(xiàn)黃色熒光是葉綠體紅色熒光與GFP綠色熒光的重疊效果。H u W也報(bào)道,用電擊法和PEG法同時(shí)轉(zhuǎn)化玉米和擬南芥菜(A rabid op sis原生質(zhì)體, GFP在玉米原生質(zhì)體中表達(dá),但PEG介導(dǎo)比電擊法轉(zhuǎn)化效率高,而擬南芥菜原生質(zhì)體中未觀察到GFP表達(dá)33。不過Sheen J等利用基因槍(M icrop ro jectile bom bardm en t轟擊擬南芥菜完整葉片和根組織,觀察到活體GFP熒光。N iedz R P等用電擊法轉(zhuǎn)化甜橙(C itrus sinensis原生質(zhì)體,450 490nm藍(lán)光下觀

23、察到20%60%原生質(zhì)體發(fā)生較強(qiáng)綠色熒光34。此外,也有GFP在菸草、水稻中表達(dá)的報(bào)道。GFP在多種原核和真核生物細(xì)胞中表達(dá),表明GFP色基形成的翻譯后修飾過程并非需要原有水母(A.v ictoria細(xì)胞中任何其它成份或共因子。亦表明GFP作為報(bào)告基因,其表達(dá)不受生物類型、基因型或細(xì)胞組織類型的限制,具有廣泛的利用前景。2.2GFP作為報(bào)告蛋白用于基因表達(dá)的調(diào)控效果研究C lon tech公司構(gòu)建了一種叫啟動(dòng)子報(bào)告載體(P rom o ter repo rter vecto r即沒有啟動(dòng)子的GFP 質(zhì)粒,專門用來測(cè)試各種啟動(dòng)子對(duì)GFP表達(dá)的效率,以及某些增強(qiáng)子對(duì)GFP表達(dá)的調(diào)控效果。發(fā)現(xiàn)用玉米

24、C4PPD K基因5端的非翻譯片段(5V TR與花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子連接,GFP在玉米原生質(zhì)體中的表達(dá)效率比對(duì)照質(zhì)粒(只有35S啟動(dòng)子提高近15倍,因?yàn)?V TR片段中含轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。用擬南芥菜熱體克(H eat2shock基因啟動(dòng)子構(gòu)建GFP表達(dá)載體,用以轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體。發(fā)現(xiàn)42熱激處理中50%原生質(zhì)體表達(dá)GFP熒光;37處理的熒光較弱;而常溫下培養(yǎng),則完全觀察不到原生質(zhì)體中的GFP熒光。在高等植物遺傳轉(zhuǎn)化的基因表達(dá)調(diào)控研究中,已有很多報(bào)告蛋白被應(yīng)用,包括L ac Z(2 galacto sidase35、CA T(Ch lo ram phen ico l acethytran sf

25、erase36、L uc(熒光蟲L uciferase37,38和GU S(2glucu ron idase39等。但這些報(bào)告蛋白都是酶,其表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)都需要進(jìn)行細(xì)胞固定、組織切片或蛋白提取等破壞性處理,很難用于活體觀察和檢測(cè)。GFP作為一種活體報(bào)告蛋白40,用于研究基因表達(dá)的調(diào)控,明顯具有其它報(bào)告蛋白不可替代的優(yōu)點(diǎn)。2.3GFP融合蛋白用于研究蛋白質(zhì)定位、移動(dòng)及相互作用異質(zhì)蛋白可以和GFP的N2端或C2端連接組成融合蛋白。GFP融合蛋白既保留了異質(zhì)蛋白的固有特性,也保留了GFP的正?；钚?。因此,GFP融合蛋白,實(shí)際上可作為一種“熒光標(biāo)簽”用來研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位、轉(zhuǎn)移、相互作用等內(nèi)容。

26、C lon tech公司構(gòu)建了6種GFP融合蛋白載體。Kai m SR利用GFP融合蛋白載體研究細(xì)菌致病性,即用GFP融合蛋白載體轉(zhuǎn)化沙門氏桿菌(S a l m onella typ h i m u rium,再侵染人的H EP22細(xì)胞,并用若丹明(rhodam ine2phallo idin染色,在熒光顯微鏡下觀察。若細(xì)菌只侵染到細(xì)胞表面,只在細(xì)胞表面呈現(xiàn)綠色熒光(GFP表達(dá)信號(hào);若細(xì)菌已侵入細(xì)胞內(nèi)部,則培養(yǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)黃色熒光,這是GFP表達(dá)的綠色熒55薛啟漢:綠色熒光蛋白(GFP的特性及其在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用光與細(xì)胞若丹明染色的紅色熒光的重疊效果。因此,利用GFP融合蛋白為“熒光標(biāo)簽”,

27、可以直接活體觀察到細(xì)菌蛋白和報(bào)告蛋白在細(xì)胞中的確切位置,以表明細(xì)菌在活體細(xì)胞中的侵染狀況。同樣原理, Youvan構(gòu)建了菸草花葉病毒和GFP的融合蛋白載體TW V2GFP。B an lcom be DC構(gòu)建了馬鈴薯X病毒和GFP的融合蛋白載體PV X2GFP41接種菸草(N.cleveland ii12天后,在紫外光下可以直接觀察到病毒侵染的確切部位。再用首次感染的菸草汁液接種另一種菸草(N.ben tham iana,觀察到已放大的第二次系統(tǒng)感染的綠色熒光斑點(diǎn)。葉片提取液蛋白電泳凝膠在紫外光下也能見到GFP熒光信號(hào),從感染葉片中回收的病毒經(jīng)鑒定,確認(rèn)為PV X2 GFP。構(gòu)建載體時(shí),直接用G

28、FP基因替代病毒外殼蛋白基因,接種后觀察到GFP綠色熒光只局限于接種的細(xì)胞部位,不擴(kuò)散。證實(shí)了早先的論斷,即PV X 外殼蛋白對(duì)于病毒在寄主細(xì)胞內(nèi)的增殖,以及在細(xì)胞間的移動(dòng)、擴(kuò)展是不可缺少的條件42,43,44,45,46,47。顯然,GFP融合蛋白作為一種報(bào)告標(biāo)記,可以為病毒學(xué)研究,或以病毒載體為途徑研究外源基因在轉(zhuǎn)基因生物細(xì)胞中的表達(dá)及蛋白質(zhì)定位,提供理想的工具48,49,50。與傳統(tǒng)的熒光抗體相比,GFP不僅靈敏度高,不需要反應(yīng)底物,還可以消除因抗體與非靶位點(diǎn)結(jié)合帶來的背景熒光的干擾。2.4GFP報(bào)告蛋白用于細(xì)胞活體分離與純化利用細(xì)胞表面標(biāo)記,通過流體細(xì)胞分光光度計(jì)或熒光活化細(xì)胞篩選儀(

29、FA CS,可以分離與純化特殊類型細(xì)胞,對(duì)分析c DNA文庫、研究基因的細(xì)胞發(fā)育或組織專一性表達(dá)十分重要51,52。利用GFP 融合蛋白為細(xì)胞表面活體熒光標(biāo)記,通過篩選已經(jīng)獲得GFP表達(dá)的大腸桿菌、人體腎細(xì)胞和猿猴CO S21細(xì)胞特殊類型。Sheen J等在GFP轉(zhuǎn)染玉米原生質(zhì)體的流體參數(shù)分析中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染1518小時(shí)后,對(duì)照中只有一類細(xì)胞叢,表現(xiàn)較強(qiáng)紅色熒光和微弱的綠色熒光,并且細(xì)胞間熒光強(qiáng)度相當(dāng)一致,沒有明顯差異。而GFP轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)體中出現(xiàn)兩類細(xì)胞叢,第一類與對(duì)照相似,呈現(xiàn)紅色熒光,約占細(xì)胞總數(shù)6613%;第二類細(xì)胞叢呈現(xiàn)綠色熒光,熒光強(qiáng)度是對(duì)照的74倍。因此,用流式細(xì)胞分光光度計(jì)或熒光活

30、化細(xì)胞篩選儀(Ep ics E lite,Con lter E lectron ics, M iam i FL,U SA很容易將兩類細(xì)胞分離開來。原生質(zhì)體可以來源于不同類型的組織細(xì)胞原生質(zhì)體表達(dá)的GFP信息,即可代表某種組織的信息。采用發(fā)育專一性啟動(dòng)子構(gòu)建GFP表達(dá)載體,可以將這些具有基因表達(dá)特異性的細(xì)胞類型分離出來。利用不同表達(dá)文庫轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體,通過流體參數(shù)分析和細(xì)胞分類,可以揭示在信號(hào)傳導(dǎo)途徑中所包含的許多反方活化因子(tran s2activating fecto rs。GFP在生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中的利用還不僅僅局限于上述幾個(gè)方面。隨著研究的深入開展,其廣泛利用的潛力將不斷表現(xiàn)出來。

31、3GFP應(yīng)用中的問題及注意事項(xiàng)野生型GFP的c DNA(gfp10中GFP編碼序列的框架結(jié)構(gòu)會(huì)抑制GFP表達(dá)。在構(gòu)建GFP表達(dá)載體時(shí)可以將其修飾成Kozak con sen su s,以提高GFP在真核細(xì)胞中的翻譯效率53。長(zhǎng)時(shí)間的高強(qiáng)度激發(fā)光可能使GFP產(chǎn)生自由基(F ree radicles,對(duì)細(xì)胞有毒害?？蛇x用450490nm長(zhǎng)波光激發(fā),將其減少到最低程度。GFP表達(dá)熒光強(qiáng)度可能會(huì)產(chǎn)生變異和不穩(wěn)定,影響因素之一可能是缺乏分子氧,致使GFP色基形成緩慢。此外,細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境往往會(huì)影響GFP表達(dá)效率,如大腸肝菌在24或30下培養(yǎng),GFP表達(dá)效率會(huì)明顯高于37培養(yǎng)的菌落。有些研究者在自己的GF

32、P轉(zhuǎn)化體系中未能成功地觀測(cè)到GFP熒光信號(hào),可能有多種原因,包括表達(dá)載體構(gòu)建不合理、使用的熒光顯微鏡濾光片組合不合適、GFP在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)量過低,以及樣品或塑料容器的自然熒光干擾或激發(fā)光受阻等。目前科學(xué)家正在致力于構(gòu)建表達(dá)水平更高,特別是適合于高等植物遺傳轉(zhuǎn)化的GFP載體。參考文獻(xiàn)1M o rise JG,Sh i m om ura O,Johnson FH,et al.Inter mo lecular energy transfer in the bi o lum inescent system of A equouea.B i ochem istry,1974,13:265626622W

33、 ard WW.Energy transfer p rocess in bi o lum inescence.In: Sm ith KC.ed.Pho tochem ical and Pho tobi o logical R eview s.N ew Yo rk:P lenum,1979,4:1573W ard WW,Co r m ier M J.Energy transfer via p ro tein2p ro tein interacti on in R en illa bi o lum inescence.Pho tobi ochem.Pho tobi o l.1978,27:3893

34、964W ard WW,Cody CW,H art RC,et al.Spectropho tom etric identity of the energy transfer ch romopho res in R en illa andA equorea green fluo rescent p ro teins.Pho tobi ochem Pho tobi o l,1980,31:61161565江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)1999年第15卷第1期薛啟漢: 綠色熒光蛋白 (GFP 的特性及其在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用 5 Chalfie M , T u YT , Eu sk irchen G, et al

35、 Green fluo rescen t . p ro tein as a m arker fo r gene exp ression. Science, 1994, 263: 802 57 24 Bokm an SH , W ard WW. 805 6 P rasher DC, Ecken rode V K, W ard WW , et al . P rim ary structu re of the A equorea v ictoria g reen 2fluo rescen t p ro tein. sited irected m u tagenesis u sing the po l

36、ym erase chain reaction. Younvan DC. sp ectro scop y fo r m assively p arallel screen ing of m u tan ts. I p roved g reen fluo rescence. m 1380 g reen 25 W ard WW , Bokm an SH. R eversib le denatu ration of A equorea fluo rescen t p ro tein: p hysical sep aration and Gene, 1992, 111: 229 233 7 Cody

37、CW , P rasher DC, W esler WM , et al Chem ical structu re of . the hexap ep tide ch rom op ho re of the A equorea g reen fluo rescen t p ro tein. B iochem istry, 1993, 32: 1212 1218 26 Su rp in M A , W ard WW. R eversib le denatu ration of A equorea g reen 2fluo rescen t 784 R, Pho tob io l, 49: W P

38、M 2 2 B 1994, 14: 8399 8407 Sheen J Y. p ro tein 2th io l A T sien requ irem en t. Pho tochem 8 D elag rave S, Youvan DC. Search ing sequence sp ace to eng ineer p ro tein s: Exponen tial en sem b le m u tagenesis. B io T echno logy, 1993, 11: 1548 1552 9 Sh im om u ra O. Structu re of the ch rom op

39、 ho re of A equorea g reen fluo rescen t p ro tein. FEBS L etters, 1979, 104: 220 222 10 D elag rave S. Go ldm an ER , Youvan DC. R ecu rsive en sem b le m u tagenesis. P ro tein Eng ineering , 1993, 6: 327 331 11 H em sley A , A rnheim N , Toney M D , et al A sim p le m ethod fo r . N ucleic A cid

40、s R esearch, 1989, 17: 6546 6551 12 L nouye S, T su ji F I Exp ression of the gene and fluo rescence . characteristics of the recom b inan t p ro tein. FEBS letters, 1994, 341: 277 280 13 Go ldm an ER , A n algo rithm ically op tim ized com b inato rial lib ray screened by d ig ital im ag ing sp ect

41、ro scop y. B io T echno logy, 1992, 10: 1557 1561 14 Youvan DC, Go ldm an ER , D elag rave S, et al D ig ital im ag ing . M ethod s in Enzym o logy, 1995, 246: 732 748 15 Youvan DC. I ag ing sequence sp ace. N atu re, 1994, 369: 79 80 m 16 H eim R , P rasher DC, T sien R Y. W aveleng th m u tation s

42、 and po sttran slational au tox idation of g reen fluo rescen t p ro tein. P roc N atl A cad Sci U SA , 1994, 91: 12501 12504 17 H eim R , Cub itt AB , T sien R Y. N atu re, 1995, 373: 663 664 18 D elag rave S, H aw tin R E, Siiva CM , et al R ed 2sh ifted excitation . m u tan ts of the g reen fluo

43、rescen t p ro tein. 1995, 13: 151 154 B io T echno logy, 19 W ang S, H azelrigg T. . from sp atial d istribu tion of ex u p ro tein in D rosop h ila oogenesis I p lication s fo r bcd m RNA localization m N atu re, 1994, 369: 400 403 20 Inouye S, T su ji F I Evidence fo r redox fo rm of the A equorea

44、 . g reen fluo rescen t p ro tein. FEBS L etters, 1994, 351: 211 214 fluo rescen t p ro tein. Pho tochem Pho tob io l, 1990, 51: 92s 21 Robart FD , W ard WW. So lven t p ertu rbation s of A equorea g reen 22 Perozzo M A , W ard KB , T hom p son RB , et al X 2ray d iffraction . 23 W ard WW. p ro tein

45、 s. and chem ilum inescence: Basic Chem istry and and tim e reso lved fluo rescence analysis of A equorea g reen 2 fluo rescen t p ro tein crystals. J B io l Chem , 1988, 263: 7713 7716 In: D eluca M , M cE lroy W D. ed s. B io lum inescence P rop erties of the coelen terate g reen 2fluo rescen t an

46、alytical 27 Sheen J , Hw ang S, N iw a Y, et al Green 2fluo rescen t p ro tein as a . 28 F lach J , Bo ssie M , V ogel J , et al A yeast RNA 2b ind ing p ro tein . shu ttles betw een the nucleu s and the cytop lasm. M o l Cell B io l, 29 Kain SR , A dam s M , Kondep ud i A , et al . p ro tein as a r

47、epo rter of gene exp ression and p ro tein localization. B io techn iques, 1995, 19: 650 655 30 M o ss JB , Ro sen thal N. A nalysis of gene exp ression p attern s in p ro tein. J Cell B iochem , 1994, S180: 489 ( ab stract 31 Ro sario R , B rin i M , P izzo P , et al Ch im eric g reen fluo rescen t

48、 . p ro tein as a too l fo r visualizing subcellu lar o rganelles in living 32 Stearn s T. T he g reen revo lu tion. Cu rr B io l, 1995, 5: 262 264 33 H u W , Cheng CL. p ro tein in p lan t cells. FEBS L etters, 1995, 369: 331 334 Su ssm an M R , Satterlee J S. 34 N iedz EP , p ro tein: an in vivo r

49、epo rter of p lan t gene exp ression. P lan t Cell R epo rts, 1995, 14: 403 406 35 H elm er G, Casadabam M , Bevan M , et al A new ch im eric gene . as a m arker fo r p lan t tran sfo rm ation: the exp ression of E scherich ia co il galacto sidase in sunflow er and tobacco cells. B io T echno logy,

50、1984, 2: 520 527 36 Seed B , 277 37 M illar A J , Sho rt SR , H iro tsuka K, et al F irefly luciferase as a . repo rter of regu lated gene exp ression in h igh p lan ts. P lan t M o l . app lication s N ew Yo rk: A cadem ic P ress inc, 19811235 242 21: 4535 4540 R enatu ration of A equorea g reen fl

51、uo rescen t p ro tein. B iochem B iop hys Comm un, 1981, 101: 1372 characterization of the renatu red p ro tein. B iochem istry, 1982, new vital m arker in p lan t cells. T he P lan t Joum al, 1995, 8: 777 Green fluo rescen t the em b ryon ic m ou se m yo tom e w ith the g reen fluo rescen t cells.

52、Cu rr B io l, 1995, 5: 635 642 Exp ression of A equorea g reen fluo rescen t Green fluo rescen t sim p le p hase ex traction assay fo r ch lo ram p hen ical acetyltran sferase activity. Gene, 1988, 67: 271 B io l R ep , 1992, 10: 324 337 38 Ow DW , W ood KV , D eluca M , et al . T ran sien t and sta

53、b le exp ression of the firefly luciferase gene in p lan t cells and tran sgen ic p lan ts. Science, 1986, 234: 856 859 39 J efferson RA , Kavanagh TA , Buvan MW. g lucu ron idase as a sen sitive and versatile gene fu sion m arker in h igher p lan ts. EM BO J , 1987, 6: 3901 3907 Cub itt AB , R Y. 4

54、0 H eim P ro tein m arker developm en t. N atu re, 1995, 373: 663 664 2 GU S fu sion s: fo r 58 江 蘇 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) 1999 年 第 15 卷 第 1 期 and exp ression in p lan ts by a rep licating gem in iviru s vecto r. 41 Bau lcom be DC, Chapm an S, C ruz SS. J ellyfish g reen fluo rescen t . p ro tein as a repo rter fo

55、 r viru s infection s T he P lan t Jou rnal, 1995, 7: 1045 1053 42 A ngell SM , Ban lcom be DC. Cell to cell m ovem en t of po tato viru s X revealed by m icro 2in jection of a viral vecto r tagged w ith vecto r fo r gene exp ression in p lan ts. P lan t Jou rnal, 1992b, 2: 549 557 g lucu ron idase in to the viral po lyp ro tein. . genes M o l P lan t 2 icrobe In teract, 1993, 6: 309 322 M N atu re, 1988, 34: 179 182 49 Jo sh i RL , Jo sh iV , Ow DW. BSM V genom e m ed ia