植物中 DREBs 類轉(zhuǎn)錄因子及其在非生物脅迫中的作用

1、植物中DREBs類轉(zhuǎn)錄因子及其在非生物脅迫中的作用張梅1,2,劉煒2,畢玉平1,21.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,濟南 250014;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心,山東省作物與畜禽品質(zhì)改良生物技術(shù)重點實驗室,濟南 250100摘要:低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫能夠嚴(yán)重影響植物的生長及作物的產(chǎn)量。最近發(fā)現(xiàn)了許多調(diào)控多種與逆境相關(guān)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子,其中DREBs類轉(zhuǎn)錄因子能夠通過與含有DRE/CRT順式作用元件的抗逆相關(guān)基因啟動子區(qū)相互作用,進而調(diào)控一系列抗逆基因的表達,使植物品質(zhì)得到綜合改良從而提高植物對非生物脅迫耐受力。文章通過對DREBs的結(jié)構(gòu)、表達調(diào)控、作用方式及機理進行總結(jié),并結(jié)

2、合其在植物脅迫信號通路中的作用以及提高轉(zhuǎn)基因植株脅迫耐受性的最新研究成果加以綜述,并對其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用前景進行展望。關(guān)鍵詞:非生物脅迫;DREBs類轉(zhuǎn)錄因子;DRE/CRT順式作用元件;表達調(diào)控Dehydration-responsive element-binding (DREB transcription factor in plants and its role during abiotic stressesZHANG Mei 1, 2, LIU Wei 2, BI Yu-Ping 1, 21. College of Life Science, Shandong Normal Uni

3、versity, Jinan 250014, China;2. Hi-Tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory for Genetic Improvement of Crop, Animaland Poultry of Shandong Province, Jinan 250100, ChinaAbstract: Abiotic stresses such as cold, drought and high salinity are common adverse environ

4、mental conditions that seriously influence plant growth and crop productivity worldwide. Some transcription factor(s (TFs have been isolated and verified recently toplay roles under abiotic stresses. Among them, the TF of DREB (Dehydration Responsive Element Binding can therefore regulate the expres

5、sion of many stress-inducible genes in plants and play a critical role in improving abiotic stress tolerance of plants by interacting with specific cis-acting element named DRE/CRT, which are present in the promoter region of various abiotic stress-related genes. In this review, we summarized the cu

6、rrent knowledge of DREBs in the structural and functional characters with emphasis on the regulation and mechanisms of DREBs on plant development, as well as new research approaches and complexity ofthe signal transduction pathway of DREBs. The practical and application value of DREBs in crop improv

7、ement engineering was also discussed.Keywords: abiotic stresses; DREBs transcription factor; DRE/CRT cis-acting element; expression and regulation干旱、高鹽以及低溫等極端條件又稱為水分脅迫或滲透脅迫,是植物生長過程中所面臨的主要的逆境脅迫因子。植物生長在土壤里,本身不能自由移動,以上多種非生物脅迫因素,極易通過影響氣孔開度,細胞壁或細胞膜成分等生理、生化指標(biāo)的改變進而對植物造成傷害,嚴(yán)重影響了作物的產(chǎn)量和種植區(qū)域。針對植物的抗性育種,傳統(tǒng)的方法一般具

8、有目的性差、周期性長、工作量大等局限性?；蚬こ碳夹g(shù)的迅速發(fā)展及在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用提高并促進了作物抗逆育種及品質(zhì)的改善,在提高產(chǎn)量的同時還可減少農(nóng)業(yè)上的灌溉用水,使作物在干旱和貧瘠的土地上生長出高新品種,從而產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益1。目前,對-收稿日期:2008-09-10;修回日期:2008-10-18 基金項目:山東省農(nóng)科院博士科研啟動基金項目(編號:2007YBS008資助作者簡介:張梅(1983,女,碩士,專業(yè)方向:發(fā)育生物學(xué)。Tel:158*;E-mail:200200139通訊作者:劉煒(1975,女,副研究員,博士,研究方向:植物轉(zhuǎn)錄因子功能、植物生長發(fā)育調(diào)節(jié)。Tel:0531-

9、* ;E-mail:wheiliu植物抗逆機制的研究及培育作物抗逆新品種已成為廣大植物學(xué)家和育種學(xué)家研究的主要目標(biāo)。抗逆基因工程采用的基因大致可分為兩類,一類是功能基因,其編碼產(chǎn)物主要包括LEA蛋白、抗凍蛋白等,同時還包括一些滲透調(diào)節(jié)因子的合成酶,以及毒性降解酶等2;另一類是與抗逆相關(guān)的、其編碼產(chǎn)物參與信號傳遞途徑和基因表達調(diào)控過程的轉(zhuǎn)錄因子,主要分為MYB類、bZIP類、WRKY類、AP2/EREBP類和NAC類5個家族3。其中,DREBs(Dehydrationresponsive element binding,與干旱應(yīng)答元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子可特異的識別并結(jié)合DRE(Dehydration

10、responsive element,干旱應(yīng)答元件,進而參與逆境信號的傳遞,調(diào)控下游逆境應(yīng)答基因的表達,提高植物在多種逆境條件下的適應(yīng)性和耐受性,從而對植物抗性進行綜合改良。本文對該類轉(zhuǎn)錄因子從結(jié)構(gòu)特征,功能,基因的表達調(diào)控及生產(chǎn)應(yīng)用等方面進行了綜述,并對其應(yīng)用前景進行了展望。1 DREBs類轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征作為AP2/EREBP(APETALA2/ethlene responsive element binding protein, APETALA2/乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白家族的一類成員,DREBs類轉(zhuǎn)錄因子特異的存在于植物中,參與植物對干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫的應(yīng)答與響應(yīng)。其典型特征是

11、其DNA結(jié)合區(qū)含有AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域(約57-70AA,主要分為AP2、DREB、ERF和RA V4個主要的亞族,并進一步將DREB亞族分成6個小類(A1-A6。DREBs類轉(zhuǎn)錄因子序列中只含有一個AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域,其中包含YRG和RAYD兩個保守區(qū)4。YRG區(qū)為N端富含有20個氨基酸殘基的堿性親水區(qū),位于第二個折疊的第14位和第l9位的氨基酸殘基分別為纈氨酸(V14和谷氨酸(El9,是與DRE作用元件相互結(jié)合的關(guān)鍵位點,對識別并結(jié)合各類順式作用元件具有重要作用。RAYD區(qū)位于AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的C端,其核心區(qū)由大約l8個氨基酸殘基組成,可形成雙親性的螺旋,其主要行使調(diào)

12、節(jié)轉(zhuǎn)錄因子與DRE順式作用元件結(jié)合能力的功能,通過影響YRG保守區(qū)的構(gòu)象或通過與其它蛋白發(fā)生相互作用進而發(fā)揮作用4。同時,DREBs類轉(zhuǎn)錄因子在序列中存在一段富含Ser/Thr的區(qū)域,在基因間的磷酸化及相互作用中起重要的作用5。2 順式作用元件DRE/CRTDRE/CRT順式作用元件普遍存在于脅迫應(yīng)答相關(guān)基因的啟動子中,DREBs轉(zhuǎn)錄因子能夠特異地識別并結(jié)合該順式作用元件,進而參與調(diào)控相關(guān)基因的表達及功能行使。一般情況下,植物處于干旱、高鹽和低溫等非生物逆境脅迫下,其體內(nèi)的ABA含量會明顯升高,ABA 含量的升高進一步誘導(dǎo)下游一系列抗逆相關(guān)基因的表達,但之后的研究發(fā)現(xiàn)有些受內(nèi)源ABA誘導(dǎo)表達的

13、基因,如rd29A/lti78/cor78、kin1、cor6.6/kin2、cor47/rd17、cor15a等,在ABA缺失或ABA不敏感的擬南芥突變體中,也可被干旱、高鹽和低溫所誘導(dǎo),表現(xiàn)為ABA非依賴型表達模式6。進一步通過啟動子缺失實驗結(jié)合凝膠阻滯分析,Yamaguchi-Shinozaki7發(fā)現(xiàn)rd29A基因的啟動子區(qū)除了存在ABA應(yīng)答元件ABRE(ABA responsive element,還存在一個核心序列為CCGAC的干旱應(yīng)答元件DRE(ATCCGACTA。同年,一段與DRE極為相似的序列TGGCCGAC也被研究者從擬南芥低溫應(yīng)答基因COR15A的啟動子區(qū)中分離并鑒定出來,

14、稱之為CRT(C-Repeat元件8。之后,在RD17、KIN1和COR6.6等擬南芥干旱和低溫應(yīng)答相關(guān)基因啟動子區(qū)、及大麥(Hordeum vulgare L.Dhn9、油菜(Brassica napus L.BN11510、玉米(Zea mays L.RAB1711和小麥(Triticum aestivum L.WCS12012等脅迫相關(guān)基因的啟動子區(qū)中,DRE或DRE核心序列(CCGAC元件均被分離并鑒定。3 植物中DREBs類轉(zhuǎn)錄因子順式作用元件DRE/CRT的分離并鑒定,揭示出一條ABA非依賴型的逆境信號傳導(dǎo)途徑。進而使相關(guān)特異識別并結(jié)合DRE/CRT元件、進一步調(diào)控下游基因表達的D

15、RE/CRT結(jié)合蛋白的研究也逐漸深入。3.1擬南芥中的DREBs類轉(zhuǎn)錄因子Yamaguchi-Shinozakiaib等7于1994年首次在擬南芥的核抽提物中檢測到能夠與DRE作用的蛋白質(zhì)因子DRBF1。之后,轉(zhuǎn)錄因子CBF1(C-repeat/DRE Binding Factor l被Stockinger等13通過酵母單雜交的方法,從擬南芥cDNA文庫中首次分離并進行了驗證。進而Gilmour等14及Liu等5借助于相似的方法及材料,分別對基因DREB1A(或稱CBF3、DREB1B(或稱CBF1和DREB1C(或稱CBF2進行了克隆;并在干旱處理的擬南芥cDNA文庫中克隆到2個受干旱和高鹽

16、脅迫誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子DREB2A和DREB2B。Northern雜交結(jié)果顯示,這5個轉(zhuǎn)錄因子具有不同的表達模式,在4處理10 min內(nèi),DREB1A、DREB1B和DREB1C被迅速、強烈的誘導(dǎo);在干旱或250 mmol/L NaCl 處理下,DREB2A 和DREB2B 基因表達量在10 min 內(nèi)也明顯增強,但它們均不受ABA(100 mol/L 誘導(dǎo),為ABA 非依賴型。目前,經(jīng)序列同源檢索,在擬南芥全基因組中發(fā)現(xiàn)可能存在6個DREB1轉(zhuǎn)錄因子,8個DREB2轉(zhuǎn)錄因子。Sakuma 等15根據(jù)序列專一性,從擬南芥中分離到3個新的DREB1(DREB1D 、DREB1E 和DREB1F 轉(zhuǎn)錄

17、因子基因和6個DREB2(DREB2C -DREB2H 轉(zhuǎn)錄因子基因,通過對這八種轉(zhuǎn)錄因子在干旱、高鹽、低溫以及ABA 處理等多種非生物逆境脅迫下的表達模式進行研究,發(fā)現(xiàn)只有DREB1D 、DREB1F 、DREB2C 、DREB2D 和DREB2F 在高鹽處理下表達量有微弱變化,而DREB2E 的表達受ABA 誘導(dǎo),表明在DREB1/CBF 和DREB2脅迫響應(yīng)中可能存在著表達調(diào)控途徑的交叉。3.2其他植物中的DREBs 類轉(zhuǎn)錄因子隨著對擬南芥中DREBs 類轉(zhuǎn)錄因子研究的深入,對其他植物中DREBs 類基因家族的研究也得以不斷深入(表1。2001年,Jaglo 等16分別從油菜(Brass

18、ica napus L.、黑麥(Secale cereale L.、小麥(Triticum aestivum L.和番茄(Lycopersicon esculentum Mill.中分離得到與擬南芥CBF1同源的CBF/DREBs 轉(zhuǎn)錄因子,表達模式分析顯示BnCBF 的表達受低溫誘導(dǎo),并對其下游靶基因BN115的表達進行調(diào)控。后來,Gao 等17又從油菜cDNA 文庫中篩選出4種CBFs 基因,即BnCBF5、BnCBF7、BnCBF16和BnCBF17,其中部分序列在氨基酸水平上相似性達90%。Choi 等18從低溫處理的大麥(Hordeum vulgareL.cDNA 文庫中篩選出與擬南

19、芥CBF3同源并受低溫誘導(dǎo)的基因Hvcbf3。2003年,Shen 等19分別從干旱處理的小麥cDNA 文庫和鹽處理的山菠菜(Atriplex hortensis L.cDNA 文庫中篩選出基因TaDREB1和AhDREB1,Northern 雜交顯示,TaDREB1可同時受低溫(0°C、鹽(200 mmol/L NaCl、干旱(20%PEG6000和ABA(25 mol/L 的誘導(dǎo),并對溫度的響應(yīng)最強。Dubouzet 等20在水稻基因組數(shù)據(jù)庫中,用擬南芥DREB1A 和DREB2A 的序列進行同源檢索,也分離到DREBs 類轉(zhuǎn)錄因子OsDREB1B 、1C 、1D 和OsDREB

20、2A 。表1 不同植物中的DREBs 類轉(zhuǎn)錄因子表達模式 物種DREBs TF冷 干旱 高鹽 脫落酸 CBF113/DREB1B 5 × - × CBF214/DREB1C 5 × - × CBF314/DREB1A 5 × × × DREB2A 5× × 擬南芥(Arabidopsis thalianaL. DREB2B 5× × BnCBF517 × × × BnCBF717 × × × BnCBF1617 ×

21、× × 油菜(Brassica napus L. BnCBF1717 × × × 小麥(Triticum aestivum L.TaDREB119 山菠菜(Atriplex hortensis L.AhDREB119- - - 黑麥(Secale cereale L.ScCBF 16 - - - 番茄(Lycopersicon esculentumMill.LeCBF 16 - - - 大麥(Hordeum vulgare L. HvCBF318 - - - OsDREB1A 20 × × OsDREB1B 20 ×

22、; × × OsDREB1C 20 OsDREB1D 20× × × × 水稻(Oryza sativa L. OsDREB2A 20× ×辣椒(Capsicum annuum L.Ca-DREBLP21× ×GmDREBa22大豆(Glycine max L.GmDREBb22 ×GmDREBc22× 注:受誘導(dǎo);×:不受誘導(dǎo);-:未知;:組成型表達。2003年,Qin等23從玉米(Zea mays L.的cDNA文庫中分離到一個與DREB1/CBF同源并受低溫誘

23、導(dǎo)的基因ZmDREB1A。2005年,Hong和Kim等24從辣椒(Capsicum annuum L.中分離到一種新的與DREB2A 的表達模式相似、可被干旱、高鹽快速誘導(dǎo)表達、并受機械損傷輕微誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子Ca-DREBLP1,但由于其結(jié)構(gòu)特征更接近于基因DREB1,故把它列為DREB1類24。同年,Li22等從大豆(Glycine max L.中分離到3種DREBs類轉(zhuǎn)錄因子,即GmDREBa、GmDREBb和GmDREBc。其中GmDREBa受鹽、旱、低溫和ABA 的誘導(dǎo);GmDREBb受鹽、旱和冷誘導(dǎo),但不受ABA影響;而GmDREBc僅在根中受鹽、干旱和ABA的誘導(dǎo)。2006年,筆

24、者在花生(Arachis hypogaea L.未成熟種子的全長cDNA文庫中篩選到近15個具有AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域的基因,其中已經(jīng)分離并初步鑒定了3個新的DREBs類轉(zhuǎn)錄因子,即PNDREB1(Accession No. FM955398、AHTINY1(Accession No.FM955394、AHTINY2(Accession No.FM955395,其中PNDREB1與DREB 亞家族成員的序列同源性較高,而AHTINY1與AHTINY2同該類基因為組成型表達;誘導(dǎo)表達模式分析顯示, PNDREB1受干旱及低溫誘導(dǎo);AHTINY1受低溫、乙烯及ABA誘導(dǎo);而AHTINY2僅受

25、乙烯誘導(dǎo);這種表達模式之間的交叉及差異暗示該類轉(zhuǎn)錄因子在對非生物脅迫響應(yīng)的過程中及功能上存在一定的不同,推測可能在不同脅迫信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用,目前對這類基因理化功能的研究正在進行中25。4 DREBs類轉(zhuǎn)錄因子的表達調(diào)控4.1 DREB1類轉(zhuǎn)錄因子的表達調(diào)控DREBs類基因的表達受干旱、低溫及高鹽等非生物脅迫的誘導(dǎo),其表達量會在短時間內(nèi)明顯增加5。1998年,Gilmour等14提出在細胞中存在一個位于DREB1/CBF基因上游的轉(zhuǎn)錄因子ICE(Inducer of CBF Expression,它在低溫條件下被磷酸化修飾或與其他相關(guān)蛋白結(jié)合而被激活,活化的ICE與位于DREB1啟動子區(qū)中

26、的特異順式作用元件結(jié)合,從而啟動DREB1類基因的表達,而在常溫下ICE則以非活性形式存在(圖1。由于DREB1啟動子區(qū)域中并不含有DRE/CRT元件,故Gilmour等推測ICE不屬于DREBs類轉(zhuǎn)錄因子。Chinnusamy等26在2003年報道了一種轉(zhuǎn)錄因子ICE1(Inducer of CBF Expression 1,它可在低溫下調(diào)控其下游DREB1基因的表達,ICE1基因編碼一個MYB類型的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH轉(zhuǎn)錄因子,為組成性表達并定位在核內(nèi),受冷刺激后表達稍有增強。在冷脅迫下,它與DREB1A/ CBF3啟動子區(qū)的MYC順式

27、元件結(jié)合激活DREB1A/ CBF3基因的表達,進而通過與下游RD29A等基因相互作用對植物的抗寒性產(chǎn)生影響。低溫敏感型擬南芥ice1,其ICE1多肽鏈第236位的精氨酸可能會影響第243和245位的絲氨酸(潛在的磷酸化和去磷酸化位點的磷酸化和去磷酸化,從而影響與DREB1A/ CBF3啟動子區(qū)域的MYC順式作用元件結(jié)合,致使靶基因(DREB1A/ CBF3表達量下降,從而導(dǎo)致ice1突變體植株對低溫的耐受力明顯低于野生型26。 圖1 冷脅迫下DREB1s介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑(*所示為活性形式擬南芥中的HOS1基因編碼一個有功能的RING-finger蛋白,在低溫處理下轉(zhuǎn)運至核內(nèi)積累,具有泛素E

28、3的連接酶(Ubiquitin ligases活性,催化特定的信號蛋白水解27。在hos1缺失突變體中,DREB1基因過量表達,說明HOS1可能是其基因上游的負調(diào)節(jié)物,HOS1與ICE1相互作用證明HOS1通過催化ICE1蛋白的水解來負調(diào)節(jié)ICE1靶基因的表達28。另外,對冷超敏感的fry突變體在冷和ABA的處理下DREB1和COR基因的表達量明顯增加,說明FRY2也是DREB1和COR基因的負調(diào)節(jié)子29。LOS4作為DREB1的上游基因,其富集于細胞核的邊緣,對于DREB1基因的表達有促進作用,在los4隱性純合突變株中,CBF轉(zhuǎn)錄受到削弱或延遲30。擬南芥sfr6(Sensitive to

29、 freezing 6突變體在低溫條件下,DREB1基因的表達水平與野生型相比并未下降,而下游靶基因kinl、lti78和cor15a等的表達卻顯著減少,推測SFR6可能通過DREB1蛋白對靶基因的轉(zhuǎn)錄激活能力進行調(diào)控31。2004年,Novillo等32利用T-DNA插入突變體對DREB1C/CBF2進行了研究,發(fā)現(xiàn)當(dāng)突變位于DREB1C/CBF2起始密碼子的上游時,雖然DREB1C/CBF2的表達受到了抑制,但其下游脅迫相關(guān)基因,如DREB1B/CBF1和DREB1A/CBF3仍能夠受低溫誘導(dǎo)并表達增強,從而使突變體對干旱和高鹽的耐受力提高,表明DREB1C/CBF2對DREB1B/CBF

30、1和DREB1A/CBF3的表達起負調(diào)節(jié)作用,并受其本身基因產(chǎn)物及下游靶基因產(chǎn)物的反饋抑制。Fowler等33研究還發(fā)現(xiàn),CBF1-3的表達及產(chǎn)物的積累不僅與低溫誘導(dǎo)的時間密切相關(guān),而且還受晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié),在黎明后4 h和16 h,處于低溫脅迫下的植物其體內(nèi)CBF1-3轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物積累分別達到最高和最低水平。4.2 DREB2類轉(zhuǎn)錄因子的表達調(diào)控擬南芥中的DREB2A和DREB2B被認為是在高鹽和干旱脅迫條件下起作用的轉(zhuǎn)錄因子3,但是DREB2A 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株既不表現(xiàn)生長遲緩、其脅迫耐受力也未提高5,表明DREB2A可能需要經(jīng)過諸如磷酸化等轉(zhuǎn)錄后修飾才能被激活。2006年,Sakuma等21利

31、用擬南芥原生質(zhì)體對DREB2A蛋白質(zhì)進行功能域分析,發(fā)現(xiàn)第136-165AA缺失能使DREB2A轉(zhuǎn)變?yōu)榻M成型激活形式DREB2A-CA(DREB2A constitutive active form;將GFP與DREB2A-CA融合,在非脅迫生長條件下可檢測到該融合蛋白在細胞核中發(fā)出的很強的熒光信號,而將GFP與DREB2A全長基因融合時,僅檢測到很微弱的信號。這個結(jié)果表明DREB2A蛋白的穩(wěn)定性對于蛋白激活具有重要的作用,激活的DREB2A能促進下游干旱脅迫應(yīng)答基因的表達,從而增強植株的脅迫耐受力。在植物中過量表達DREB1A或者DREB2A-CA都會對植物產(chǎn)生一定的毒害作用,會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植

32、物生長遲緩,影響了植物的生長發(fā)育15,所以控制植物體內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白的表達量對于維持植物的內(nèi)在穩(wěn)態(tài)具有重要作用。1998年,Liu等發(fā)現(xiàn)在脅迫處理之前的擬南芥中根本檢測不到DREB1A mRNA的存在,但在根和葉子中卻能夠檢測到DREB2A mRNA,表明即使在非脅迫條件下DREB2A蛋白仍會有少量表達。那么植物又是通過什么樣的機制維持體內(nèi)DREB2A蛋白表達量的內(nèi)在平衡的呢?2008年Qin等34發(fā)現(xiàn)在非脅迫條件下這些非必須的DREB2A蛋白會通過RING 泛素連接酶DRIP1、DRIP2介導(dǎo)的26S蛋白酶體途徑降解,而在植物體感受到脅迫信號后這種泛素化及蛋白降解過程就會被抑制,DREB2A蛋白會

33、發(fā)生某種修飾變成具有活性蛋白,進而識別DRE元件激活下游抗逆相關(guān)基因的表達,從而達到提高植物抗逆性的目的。5 植物DREBs類轉(zhuǎn)錄因子在抗非生物脅迫中的作用機制非生物脅迫如干旱、高鹽及低溫等,是嚴(yán)重影響植物生長發(fā)育和農(nóng)作物產(chǎn)量的限制因子。與病、蟲害等生物脅迫相比,干旱、高鹽及低溫等脅迫對植物造成的傷害要廣泛、復(fù)雜得多,往往不取決于單個因子,而是受許多因子共同影響,而植物的響應(yīng)及產(chǎn)生抗性的機制,也要復(fù)雜得多。近年來,通過對DREBs類轉(zhuǎn)錄因子功能的研究深入,發(fā)現(xiàn)DREBs在多種脅迫適應(yīng)性及抗性中具有重要作用。Liu等5和Kasuga等35將CaMV35S:At DREB1A轉(zhuǎn)入擬南芥,篩選出At

34、 DREB1A表達量不同的a、b、c3種轉(zhuǎn)基因株系。株系a中At DREB1A的表達量最高,但植株矮小;株系c中,At DREB1A的表達量較低,植株表型變化也較小;株系b則介于株系a和c之間。相對于野生型植株,轉(zhuǎn)基因株系中均檢測到RD29A、RD17等啟動子中含DRE/CRT元件的脅迫相關(guān)基因的表達,并且轉(zhuǎn)基因植株對干旱和低溫的耐受力也明顯提高。將轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株于-6處理2 d再放回正常生長條件下培養(yǎng)(225 d后,野生型全部死亡,而株系b和株系c的存活率分別為 83.9%和 35.7%。 4 周大的 35S:OsDREB1A轉(zhuǎn)基因擬南芥植株于-6處理 30 h后， 再于正常條件 (

35、22 下恢復(fù)生長 5 d 后，其存活率為 28%45% ，而野生型的存活率只有 17%20 。與 35S:AtDREB1A 轉(zhuǎn)基因擬南芥相比， 35S:OsDREB1A轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的脅迫耐受力以及生長遲緩的程度都 相對低一些。 采用競爭性(ACCGAC和GCCGAC凝膠移位分析， Dubouzet等20發(fā)現(xiàn)OsDREB1A只與GCCGAC 有效結(jié)合，而不同于AtDREB1A能夠與A/GCCGAC皆有效結(jié)合，從而推測 35S:AtDREB1A的擬南芥轉(zhuǎn)基因植 株與 35S:OsDREB1A的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株在表型上的差異可能是由于誘導(dǎo)的脅迫應(yīng)答基因的個數(shù)不同引起 的。 Jaglo等16把擬南

36、芥的DREB1A/ CBF3、DREB1B/ CBF1、DREB1C/CBF2 基因分別導(dǎo)入油菜，可組成型 的提高轉(zhuǎn)基因油菜的耐寒性。后來，Savitcn等將BnCBF5、BnCBF17 轉(zhuǎn)入油菜后發(fā)現(xiàn)BNCBF/DREB1 不僅能 夠提高轉(zhuǎn)基因植株的冷耐受力，而且還可進一步調(diào)控葉綠體發(fā)育并增強光化效率和光合能力36。 2002 年Hsieh等37將擬南芥中 35S:CBF1 基因轉(zhuǎn)入番茄后轉(zhuǎn)基因番茄對凍害的耐性增加，同時抗旱和抗 氧化能力也明顯提高，并且這種抗性可以穩(wěn)定遺傳，其F1代和F2代轉(zhuǎn)基因作物的抗寒性均比野生型高，結(jié)合 外施赤霉素，可使轉(zhuǎn)基因番茄在保持凍害耐受力的基礎(chǔ)上克服生長遲緩的

37、缺陷。但外施赤霉素卻不能改變 35S:AtDREB1A轉(zhuǎn)基因擬南芥和轉(zhuǎn)基因煙草生長遲緩的表型，推測植株表現(xiàn)出的生長遲緩可能是由于赤霉素 生物合成受阻之外的其他機制引起的。 Dubouzet等20在研究水稻OsDREB1A的抗逆功能時， 發(fā)現(xiàn)OsDREB1A擬南芥轉(zhuǎn)基因植株不僅對冷脅迫的 耐受力提高， 而且耐鹽性也提高了。 將 3 周大的野生型及轉(zhuǎn)OsDREB1A的擬南芥經(jīng) 60 mmol/L NaCL處理 2 h， 移于正常條件繼續(xù)生長 3 周后，轉(zhuǎn)OsDREB1A植株的存活率較野生型高近 45%。2003 年，Shen等將從山菠 菜中克隆出的AhDREB1 轉(zhuǎn)入煙草中， 3 周大的轉(zhuǎn)基因植株

38、和野生型煙草轉(zhuǎn)入含有 1.5%NaCl的MS培養(yǎng)基上， 生長一周后發(fā)現(xiàn)AhDREB1 轉(zhuǎn)基因煙草生長狀態(tài)良好，且其干重比對照植株高 2 倍，表明AhDREB1 轉(zhuǎn)基因 煙草的抗鹽性明顯提高38。 2006 年Sakuma等21將 35S:AtDREB1A和 35S:AtDREB2A CA轉(zhuǎn)化擬南芥，在 2 周干旱處理（停止?jié)菜?過程中， 35S:AtDREB1A和 35S:AtDREB2A CA轉(zhuǎn)基因植株的存活率分別為 60%和 83.3%， 而野生型全部死亡。 39 2007 年Chen 等從大豆中克隆到一種新的轉(zhuǎn)錄因子GmDREB2，并將其轉(zhuǎn)化擬南芥，進行干旱處理（19 d 不澆水）后，野

39、生型全部死亡，35S：GmDREB2 和Rd29A：GmDREB2 轉(zhuǎn)基因植株的成活率分別為 45.9% 和 21%39。 最近，Sakuma等40通過對DREB2A-CA過量表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥中DREB2A的上調(diào)基因做微陣列分析， 發(fā)現(xiàn)DREB2A-CA不僅可進一步誘導(dǎo)下游干旱和鹽脅迫基因、也可誘導(dǎo)熱激（Heat-shock HS）相關(guān)基因的表 達；37下DREB2A會被快速、瞬時誘導(dǎo)，其表達量在熱處理約30分鐘后達到最高，之后DREB2A的表達量 銳減到一個相對較低的水平并一直持續(xù)到處理10小時后。將35S:AtDREB2A CA轉(zhuǎn)化擬南芥，45熱激1 h， 然后轉(zhuǎn)入22復(fù)蘇7 d， 發(fā)現(xiàn)

40、對照植株的成活率為13.4%， 而35S:AtDREB2A CA轉(zhuǎn)基因植株的成活率高達88%。 41 2007年Lim 等通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)AtDREB2B受到熱激后也會在一個小時后快速誘導(dǎo)表達，并且表達會一直 持續(xù)12 h，而AtDREB2C受到熱激3 h后才緩慢誘導(dǎo)表達，因此推測DREB2A、DREB2B、DREB2C 3種DREB2 基因可能在應(yīng)答熱激脅迫的不同階段起作用。后來，Qin等將玉米中克隆得到的ZmDREB2A轉(zhuǎn)化擬南芥，發(fā) 現(xiàn)其過量表達能夠激活下游HSPs和HsfA3等熱激相關(guān)基因的表達， 從而進行脅迫信號的傳導(dǎo)和響應(yīng)， 提高轉(zhuǎn) 42 基因植株的耐熱性 。 在提高植物耐逆性

41、方面， DREB1A/CBF3 基因還可通過其他調(diào)控機制來發(fā)揮作用。 Gilmour等43在 2002 年對低溫下轉(zhuǎn)CBF3(同DREB1A的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的研究中發(fā)現(xiàn)，超表達CBF3 不僅調(diào)控下游脅迫相關(guān)靶 基因的表達，還影響到脯氨酸和糖的代謝，使轉(zhuǎn)基因植株中兩者含量均有提高。而脯氨酸和可溶性糖作為 滲透調(diào)節(jié)劑，其在提高細胞滲透壓、保護細胞膜及增強植物的耐逆性方面的作用已經(jīng)得到廣泛認可。 轉(zhuǎn)入DREBs類轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因植株在抗逆性提高的同時，由于外源基因的引入，某些情況下會影響 到植株在正常條件下的生長發(fā)育，表現(xiàn)為生長的延遲及植株的矮化 5 。 2004 年 Maruyama 等 44

42、對 35S ： AtDREB1A 轉(zhuǎn) 基 因 植 株 生 長 遲 緩 的 原 因 進 行 研 究 ， 發(fā) 現(xiàn) 組 成 型 過 量 表 達 AtDREB1A 能 夠 使 諸 如 STZ 和 At5g04340的轉(zhuǎn)錄因子表達量上調(diào)，而這些轉(zhuǎn)錄因子的表達會抑制轉(zhuǎn)基因植物的光合作用和碳代謝，因此通 常使用 Rd29A 誘導(dǎo)型啟動子以避免 AtDREB1A 過量表達引起的生長遲緩； 35S ： GmDREB2 和 Rd29A ： GmDREB2 轉(zhuǎn)基因植株與對照相比并沒有明顯的表型變化，而且 35S ： GmDREB2 轉(zhuǎn)基因植株比 Rd29A ： GmDREB2轉(zhuǎn)基因植株的成活率高，故推測GmDREB

43、2過量表達不會激活抑制植物生長的基因表達，因此不 會影響植物的生長39。 6 展望 自Yamaguchi-Shinozakiaib等從擬南芥的核提取物首次檢測到了能夠與DRE順式作用元件相互作用的 蛋白質(zhì)到現(xiàn)在，僅僅十幾年的時間，已經(jīng)從油菜、小麥、山菠菜、水稻、大豆等多種植物中分離得到DREBs 類轉(zhuǎn)錄因子。作為該類轉(zhuǎn)錄因子的主要成員，DREB1A/B/C和DREB2類轉(zhuǎn)錄因子分別參與到不依賴于ABA 的低溫、 干旱或高鹽等脅迫應(yīng)答途徑中； 而DREB1D/CBF4則參與到依賴ABA的干旱或高鹽等應(yīng)答途徑中45。 這些結(jié)果表明，植物在非生物逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)中存在著復(fù)雜的信號傳導(dǎo)途徑，這些途經(jīng)即

44、相對獨立又通 過某些共同的組份有所交叉，緊密聯(lián)系在一起構(gòu)成一個復(fù)雜的信號傳遞網(wǎng)絡(luò)。就目前的研究狀況來看，對 于諸如細胞如何感知外界逆境信號、如何進一步將逆境信號傳導(dǎo)給轉(zhuǎn)錄因子以及轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)控其下游 基因等問題仍缺乏足夠的信息和證據(jù)來描述一個相對完整和清晰的植物轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答脅迫的信號通路。在 以后的研究中，利用不斷發(fā)展和完善的基因工程技術(shù)，如微陣列、蛋白互作、相關(guān)突變體分析等，有望對 植物轉(zhuǎn)錄因子在非生物逆境抗性中的作用機理進行深入的研究，為利用轉(zhuǎn)錄因子進行植物抗逆基因工程改 良提供理論依據(jù)。 參考文獻（References） ： 1 Xiong L, Wang RG, Mao G, Koc

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