熒光和磷光分析法

1、4/26/2022 第九章 第一節(jié) 分子熒光與磷光分析法molecular fluorescence and phosphorescencemolecular fluorescence and phosphorescence4/26/2022光制發(fā)光的基本原理 當(dāng)物質(zhì)的分子吸收適當(dāng)?shù)牡妮椛?，從電子基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)后，會(huì)以輻射（發(fā)光）的形式釋放出部分能量回到基態(tài)，這種發(fā)光稱(chēng)為光制發(fā)光。最常見(jiàn)的兩種光制發(fā)光現(xiàn)象的是熒光和磷光。4/26/2022一、熒光與磷光的產(chǎn)生過(guò)程 luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence 由分

2、子結(jié)構(gòu)理論，主要討論熒光及磷光的產(chǎn)生機(jī)理。1. 1. 分子能級(jí)與躍遷分子能級(jí)與躍遷 分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜； 在每個(gè)電子能級(jí)上，都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)； 基態(tài)(S0)激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí))：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位； 激發(fā)態(tài)基態(tài)：多種途徑和方式(見(jiàn)能級(jí)圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)； 第一、第二、電子激發(fā)單重態(tài) S1 、S2 ； 第一、第二、電子激發(fā)三重態(tài) T1 、 T2 ；4/26/20222.電子激發(fā)態(tài)的多重度 電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1 S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)； 平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低；

3、 大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)； S0T1 禁阻躍遷；通過(guò)其他途徑進(jìn)入(見(jiàn)能級(jí)圖)；進(jìn)入的幾率??； 4/26/20222.激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑 電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過(guò)輻射電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過(guò)輻射躍遷躍遷(發(fā)光發(fā)光)和無(wú)輻射躍遷等方式失去能量；和無(wú)輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛預(yù)無(wú)輻射躍遷 激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大；熒光熒光：10-710 -9 s,第一激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)；磷光磷光：10-410s；第一激發(fā)三重態(tài)三重態(tài)的最低振動(dòng)能

4、級(jí)基態(tài)；4/26/2022S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外轉(zhuǎn)換l l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫4/26/2022非輻射能量傳遞過(guò)程 振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10 -12 s。 內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重度電子能級(jí)中,等能級(jí)間的無(wú)輻射能級(jí)交換。 通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。 外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷； 外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。系間跨越系間

5、跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。 改變電子自旋，禁阻躍遷，通過(guò)自旋軌道耦合進(jìn)行。4/26/2022輻射能量傳遞過(guò)程 熒光發(fā)射熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)（ 多為 S1 S0躍遷），發(fā)射波長(zhǎng)為 l 2的熒光； 10-710 -9 s 。 由圖可見(jiàn)，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長(zhǎng)長(zhǎng)； l 2 l 2 l 1 ； 磷光發(fā)射磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)（ T1 S0躍遷）； 電子由S0進(jìn)入T1的可能過(guò)程：（ S0 T1禁阻躍遷） S0 激發(fā)振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛豫 T1 發(fā)光速度很慢： 10-4100 s 。 光照停止后，可持續(xù)一

6、段時(shí)間。4/26/2022二、激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜 excitation spectrum and fluore-scence spectrum 熒光(磷光)：光致發(fā)光，照射光波長(zhǎng)如何選擇？1.1.熒光熒光( (磷光磷光) )的激發(fā)光譜曲線的激發(fā)光譜曲線 固定測(cè)量波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線 （圖中曲線I ） 。 激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大；4/26/20222.熒光光譜(或磷光光譜) 固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)), 化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。4/26/202

7、2200260320380440500560620熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜磷光光譜磷光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜4/26/20223.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系 a.Stokesa.Stokes位移位移 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。 b. .發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān) 電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量(如能級(jí)圖l 2 ,l 1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光(如l 2 )。 c

8、. . 鏡像規(guī)則鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱(chēng)關(guān)系。 4/26/2022鏡像規(guī)則的解釋 基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類(lèi)似； 基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的二振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。 4/26/2022200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜4/26/2022三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系 relation between fluorescence and molecular structure 1. 1.分子產(chǎn)生

9、熒光必須具備的條件分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。 熒光量子產(chǎn)率（）：吸收的光量子數(shù)發(fā)射的光量子數(shù) 熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過(guò)程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過(guò)程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射；4/26/20222.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光（1）躍遷類(lèi)型：* 的熒光效率高，系間跨越過(guò)程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒(méi)有。（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強(qiáng)。4/26/202

10、24/26/2022四、影響熒光強(qiáng)度的因素 relation between fluorescence and molecular structure 影響熒光強(qiáng)度的外部因素1、光源強(qiáng)度、光源強(qiáng)度 熒光光譜儀在工作一段時(shí)間后光源強(qiáng)度會(huì)逐漸減弱熒光光譜儀在工作一段時(shí)間后光源強(qiáng)度會(huì)逐漸減弱，使熒光強(qiáng)度下降，使熒光強(qiáng)度下降2 2、樣品濃度、樣品濃度 樣品濃度過(guò)大時(shí)，激發(fā)態(tài)分子發(fā)射的熒光被周?chē)鶓B(tài)樣品濃度過(guò)大時(shí)，激發(fā)態(tài)分子發(fā)射的熒光被周?chē)鶓B(tài)分子吸收，發(fā)生內(nèi)濾光效應(yīng)，濃度增加熒光強(qiáng)度反而下降。分子吸收，發(fā)生內(nèi)濾光效應(yīng)，濃度增加熒光強(qiáng)度反而下降。4/26/2022 3.3.溶劑的影響溶劑的影響 除一般溶

11、劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化； 4.4.溫度的影響溫度的影響 熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加。 5. 5. 溶液溶液pHpH 對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；4/26/20226.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象 自吸現(xiàn)象自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)端與其吸收光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。 內(nèi)濾光作用內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；4/26/20227.溶液熒光的猝滅 碰撞猝滅； 氧的熄滅作用等。4/26/2022測(cè)定步驟 （1） 繪制激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，根據(jù)光譜曲線確定最大激發(fā)波繪制激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，根據(jù)光譜曲線確定最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)作為工作波長(zhǎng)。如果溶液中有干擾物質(zhì)長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)作為工作波長(zhǎng)。如果溶液中有干擾物質(zhì)存在，則可以通過(guò)選擇合適的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)提高測(cè)定的存在，則可以通過(guò)選擇合適的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)提高測(cè)定的選擇性。選擇性。 （2 2） 確定適宜的分析條件：溶劑、試劑濃度、確定適宜的分析條件：溶劑、試劑濃度、PHPH、