MDA 多重置換擴增技術(shù)

1、多重置換擴增（多重置換擴增（MDA）技術(shù)對單）技術(shù)對單細胞基因組測序技術(shù)研究進展細胞基因組測序技術(shù)研究進展北大腫瘤醫(yī)院病因?qū)W教研室（山東省千佛山醫(yī)院）田源基因測序技術(shù)基因測序技術(shù) 目前應用的快速序列測定技術(shù)可以總的概括為兩種：合成法和降解法?；赟anger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化學降解法這兩種基本思想。 傳統(tǒng)用于DNA測序的方法有毛細管微陣列電泳測序和焦磷酸測序等，這些方法往往技術(shù)要求高、成本貴，而且容易出錯。 截至2007年，第二代基因測序方法已經(jīng)普遍推廣應用，極大地降低了測序的成本和時間，實現(xiàn)了高通量測序。 2008年又提出了更快更好的第三

2、代測序方法-單分子測序（SMS）基因測序技術(shù)基因測序技術(shù) 基因測序需要一定量的DNA模板，所以測序前需對微生物進行分離和培養(yǎng)，但是環(huán)境中大多數(shù)的微生物是不可培養(yǎng)或?qū)ε囵B(yǎng)條件要求很高的，這無疑給測序增添了難度。 單細胞全基因組測序技術(shù)：單細胞全基因組測序技術(shù)：通過一種叫做全基因組擴增技術(shù)，不需要進行微生物培養(yǎng)，可以直接擴增放大單個細菌中的DNA獲得作為模板所需的微克DNA 。單細胞全基因組測序單細胞全基因組測序 單細胞全基因組測序技術(shù)：單細胞全基因組測序技術(shù)：是在單細胞水平對全基因組進行擴增與測序的一項新技術(shù)。 其原理是將分離的單個細胞的微量全基因組DNA進行擴增進行擴增，獲得高覆蓋率的完整的基

3、因組之后通過外顯子捕獲進而高通量測序用于揭示細胞群體差異和細胞進化關系。全基因組擴增技術(shù) 全基因組擴增技術(shù)主要分為兩種類型： 一是基于熱循環(huán)以PCR為基礎的擴增技術(shù)，如簡并寡核苷酸引物PCR (DOP-PCR)、連接反應介導的PCR (LM-PCR)、擴增前引物延伸反應 (PEP)等； 一是基于等溫反應不以PCR為基礎的擴增技術(shù)，如多重置換擴增 (MDA) 和基于引物酶的全基因組擴增 (pWGA)。 通過MDA擴增DNA多重置換擴增多重置換擴增(Multiple dilacement amplification，MDA)是1998年由耶魯大學Lizardi博士首次提出。這種恒溫擴增的方法依賴于

4、鏈置換擴增鏈置換擴增原理，利用噬菌體29DNA聚合酶，高度擴增DNA。該酶對于模板有很強的模板結(jié)合能力，能連續(xù)擴增100Kb 的DNA模板而不從模板上解離。同時這種酶具有3 -5外切酶活性，錯誤率僅為5 x 10-6，大約比Taq DNA聚合酶低100倍，因此可以保證擴增的高保真性。29DNA聚合酶強大的向前延伸活性和高保真度，使得通過MDA可從極少量的DNA樣本獲取大量高質(zhì)量的DNA，是到目前為止對整個基因組覆蓋最廣、各位點擴增偏倚最小的WGA方法。目前單細胞微生物可以通過對多重置換擴增反應多重置換擴增反應（ MDA）得到的擴增DNA進行測序。在細菌中幾個飛克 (10-15g)的DNA能擴增

5、得到微克(10-6g)的高分子量DNA，擴增得到的DNA 適合DNA文庫的構(gòu)建和Sanger測序。MDA生成的DNA也可直接作為模板供焦磷酸測序。單個細胞間基因序列的聯(lián)系也是一個功能強大的工具，它可用于對從環(huán)境DNA的提取物（宏基因組序列）得到的多重有機體通過鳥槍法測序來指導構(gòu)建基因芯片。多重置換擴增（多重置換擴增（MDA）的示意圖）的示意圖： 首先隨機六堿基引物在多個位點與模板DNA退火，接下來Phi 29 DNA 聚合酶在DNA的多個位點同時起始復制，它沿著DNA模板合成DNA,同時取代模板的互補鏈。被置換的互補鏈又成為新的模板來進行擴增，因此最終我們可以獲得大量高分子量的DNA.模板引物

6、引物多重置換擴增多重置換擴增 (MDA)MDA是目前公認的最好的單細胞基因組擴增技術(shù)，它能對全基因組進行高保真的均勻擴增，擴增出10100kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因組序列。但是MDA也有一些缺點，特別是顯著的非特異擴增，往往空白對照樣品也總是“無中生有”地產(chǎn)生大量的DNA，另外就是仍然存在序列偏差。盡管各種改進的策略正在逐步減少這些缺陷，高覆蓋率、高保真性及高特異性的擴增仍然是亟待解決的問題。另外，對測序得到 的大量數(shù)據(jù)結(jié)果的專業(yè)分析也是一個重大的挑戰(zhàn)。 單細胞全基因組測序正在從基礎研究走向臨床應用。多重置換擴增技術(shù)（MDA）多重置換擴增（多重置換擴增（multiple dis

7、placement amplification，MDA）的）的技術(shù)：技術(shù)： 不需要進行微生物培養(yǎng)，可以直接擴增放大單個細菌中的DNA獲得作為模板所需的微克DNA 。整個實驗包括： 環(huán)境樣品的準備、單細胞分離、MDA擴增DNA、DNA測序等。 環(huán)境樣品的處理環(huán)境樣品的處理 富集環(huán)境樣品中的微生物片段以利于分離單個細胞。分離單細胞前土壤先經(jīng)過密度梯度離心預處理。如果是水樣本，假如對生物體濃度有要求則要考慮附帶過濾。 離心、液體加壓沖擊法、過濾和靜電沉積法 。 液壓沖擊型空氣收集器可使細胞懸浮在用于分離單細胞的溶液中，可高效地捕獲液體基質(zhì)中1-10m的微粒。 分離單細胞根據(jù)所需要的生產(chǎn)量、環(huán)境以及靶

8、生物體等情況，可以通過采用稀釋法、熒光活性細胞篩選（FACS）、顯微操作和微流體分離到單個細胞用于MDA，采用FACS可以在一分鐘內(nèi)分離到上千個細胞。 單細胞分離結(jié)合熒光原位雜交（FISH）可以富集特異的菌屬，機械的顯微操作（基于體外受精的裝備）結(jié)合現(xiàn)代研究顯微鏡方法可以高效地分離到單細胞，如跟FISH結(jié)合從環(huán)境樣本中篩選出特異的種類用于MDA擴增單細胞DNA實驗。 流式細胞儀的測量對象流式細胞儀的測量對象大小 懸浮在溶液中的相互離散顆粒。 大小范圍：0.2uM-300uM。對象類型 細胞類型： （1） 高等真核細胞； （2）酵母； （3）細菌； （4）多細胞的聚集體，如胰島等。 非生命顆粒：

9、 細胞核、染色體、和其它細胞器以及乳化微球等。全基因組擴增(WGA)是一組對全部基因組序列進行非選擇性擴增的技術(shù)，其目的是在沒有序列傾向性的前提下大幅度增加DNA 的總量。該技術(shù)通過對微量組織樣本，甚至單個細胞的整個基因組DNA擴增，再將其擴增產(chǎn)物作為模板，進行后續(xù)分析，進而完成多位點、多基因以及全基因組DNA 組成的研究。WGA技術(shù)發(fā)展至今主要IRS-PCR(interspersed repeat sequence PCR )、LA-PCR(1inker adaptor PCR)、Alu PCR、T-PCR (tagged random primer PCRT-PCR)、擴增前引物延伸(pr

10、imer extension preamplification，PEP)和簡并寡核苷酸引物PCR (degenerate oligonucleotide primer-PCR，DOP-PCR)。但是，由于發(fā)生非特異性擴增，位點覆蓋不完全，DNA 產(chǎn)物片段小于1 kb等缺點，限制了這些方法的應用。初始模板量分別為：0.1ng,1ng,10ng,100ng，產(chǎn)量均為40g左右。 MDA 反應的產(chǎn)量受起始DNA濃度的影響較小，Dean等通過對不同量的模板DNA進行MDA反應，發(fā)現(xiàn)終產(chǎn)量較一致。這對于大范圍的遺傳學應用十分有利，因為不需要測量或平衡DNA濃度而直接進行擴增，而能產(chǎn)生同樣量的DNA。MD

11、A的應用 SNPs和STRs基因型檢測 基因拷貝數(shù)改變的檢測 DNA測序總的來說，MDA 由于其基因型的可靠性、高敏感性、高基因組覆蓋率以及較低的擴增偏向性等優(yōu)點，使得該方法成為目前最有優(yōu)勢的WGA方法。MDA 已經(jīng)廣泛的應用于包括定量PCR、SNP基因型分析、Southern印跡分析、染色體圖譜中?；诨贛DA的單細胞測序的單細胞測序主要研發(fā)人：深圳華大基因研究院技術(shù)看點：將多重置換擴增(MDA)和測序技術(shù)相結(jié)合。技術(shù)簡介：本技術(shù)基于多重置換擴增(MDA)，并對該方法的擴增均一性、靈敏度、特異性等方面進行了全面評估。這種將多重置換擴增和測序技術(shù)相結(jié)合的單細胞測序方法不僅具有更高的分辨率和基

12、因組覆蓋度，而且具有更好的敏感性和特異性。該方法從單核苷酸水平上為各種復雜疾病和生物學過程的研究開辟了新思路。技術(shù)論文：Single-Cell Exome Sequencing and Monoclonal Evolution of a JAK2-Negative Myeloproliferative NeoplasmSingle-Cell Exome Sequencing Reveals Single-Nucleotide Mutation Characteristics of a Kidney TumorMDA的應用MDA的應用2012年，華大基因首次利用以MDA為基礎的單細胞測序技術(shù)對原

13、發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythemia, ET)病人的單個骨髓細胞進行了測序并分析，篩查出在ET發(fā)病和進展中的驅(qū)動基因, 從而證實ET為單克隆來源的疾病1。同時，也將該方法與經(jīng)典方法進行比較，從而建立了具有高敏感性、高特異性、假陽性率低等特點的單細胞測序方法，為分析疾病的遺傳學結(jié)構(gòu)特征及克 隆進化過程提供了新的思路。同樣的方法也用于分析單個腎癌細胞的單核苷酸突變特征，從而在更高的分辨能力上為評價基因改變的復雜性提供了更為優(yōu)化的方法1Single-Cell Exome Sequencing and Monoclonal Evolution of a JAK2-Neg

14、ative Myeloproliferative Neoplasm近來對MDA 方法的改進：減少MDA的反應體積：通過減少污染的擴增DNA和非特異性的合成，如引物二聚體，本質(zhì)上就是通過消除不必要的反應體積增強特異性的擴增。通過使用60 nl微流控反應可提高擴增的特異性。在MDA中，分支的DNA 中間體的形成可導致在一些對初始模板DNA鏈的延長，然后被置換并對一個不同的模板延長，其結(jié)果是形成嵌合體。完整的MDA反應物和S1核酸酶處理后可以消除DNA的單鏈形式，這可使使嵌合體達到80的減少。對嵌合體形成酶路徑的了解目前正被用來減少嵌合體的發(fā)生。微流控芯片微流控芯片微流控芯片采用類似半導體的微機電加

15、工技術(shù)在芯片上構(gòu)建微流路系統(tǒng),將實驗與分析過程轉(zhuǎn)載到由彼此聯(lián)系的路徑和液相小室組成的芯片結(jié)構(gòu)上。加載生物樣品和反應液后,采用微機械泵、電水力泵和電滲流等方法驅(qū)動芯片中緩沖液的流動,形成微流路,于芯片上進行一種或連續(xù)多種的反應。激光誘導熒光、電化學和化學等多種檢測系統(tǒng)以及與質(zhì)譜等分析手段結(jié)合的很多檢測手段已經(jīng)被用在微流控芯片中,對樣品進行快速、準確和高通量分析。微流控芯片的最大特點是在一個芯片上可以形成多功能集成體系和數(shù)目眾多的復合體系的微全分析系統(tǒng)。微型反應器是芯片實驗室中常用的用于生物化學反應的結(jié)構(gòu),如毛細管電泳、聚合酶鏈反應、酶反應和DNA 雜交反應的微型反應器等。近日， Nature出版

16、集團旗下刊物Scientific Reports刊發(fā)南方科技大學副教授賀建奎賀建奎課題組最新研究成果單細胞基因組擴增法的定量評估及其在檢測單個海馬神經(jīng)元基因拷貝數(shù)變異的應用，從多個角度評估了三種最常用的單細胞基因組擴增方法。經(jīng)過細致比較發(fā)現(xiàn)，MALBAC和GenomePlex WGA4的方法在拷貝數(shù)變異檢測方面明顯優(yōu)于MDA方法。 (Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles,多重退火和多重退火和成環(huán)循環(huán)擴增技術(shù)成環(huán)循環(huán)擴增技術(shù))MALBAC:哈佛大學終身教授、美國科學院院士謝曉亮（Sunney Xie）教授研發(fā)。技術(shù)論文

17、：PMID: 23258894 Amplification of Break-pointsPacBio RS測序系統(tǒng)是基于單分子實時測序技術(shù)（SMRT）和納米微孔應用的第三代測序平臺。SMRT技術(shù)以單分子為單位，實時地傳導、記錄并分析帶熒光標記的測序反應；納米微孔技術(shù)保證了單一熒光信號強大的穩(wěn)定性和準確率。許多實體瘤和惡性血液病患者的癌癥基因組中都存在著腫瘤抑制基因缺失和其他染色體重組現(xiàn)象，而重組的斷點在個體間存在著很大差異，例如常見的CDKN2A基因缺失。結(jié)構(gòu)變異中斷裂位點的特征可以作為一種有用的腫瘤生物標記物1。1.Amplification and thrifty single-molecule sequencing of recurrent somatic structural variations Amplification of Break-points文章中提出了一種專門針對異質(zhì)性腫瘤和生殖細胞樣本中SV斷點的方法，稱為AmBre（Amplification of Break-points）。AmBre方法是通過PCR擴增SV（structure variation）斷裂