第四章蛋白質(zhì)與酶的化學(xué)修飾

1、第四章 蛋白質(zhì)與酶的化學(xué)修飾4.14.1、概述、概述4.24.2、化學(xué)修飾的設(shè)計、化學(xué)修飾的設(shè)計4.34.3、化學(xué)修飾的種類、化學(xué)修飾的種類4.44.4、修飾酶的性質(zhì)及特點、修飾酶的性質(zhì)及特點4.54.5、化學(xué)修飾的應(yīng)用、化學(xué)修飾的應(yīng)用4.64.6、化學(xué)修飾的局限性、化學(xué)修飾的局限性4.14.1、概述、概述目前為止盡管人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種酶目前為止盡管人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種酶, ,但是真正具有商業(yè)價值即每年銷售額可超過但是真正具有商業(yè)價值即每年銷售額可超過10001000萬美元的酶不過數(shù)十萬美元的酶不過數(shù)十種種, ,為什么？為什么？一、限制酶的應(yīng)用的原因一、限制酶的應(yīng)用的原因 1 1、穩(wěn)定性不夠

2、，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)的需、穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)的需要。要。2 2、作用的最適條件不符。、作用的最適條件不符。3 3、酶的專一性、酶的專一性4 4、米式常數(shù)過大、米式常數(shù)過大5 5、臨床應(yīng)用的特殊要求、臨床應(yīng)用的特殊要求6 6、酶活性不夠高、酶活性不夠高二、改變酶特性有兩種主要的方法二、改變酶特性有兩種主要的方法1)1)通過化學(xué)修飾的方法來改變已分離出來通過化學(xué)修飾的方法來改變已分離出來的天然酶的活性。的天然酶的活性。 2)2)通過基因工程方法改變編碼酶分子的通過基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達到改造酶的目的?；蚨_到改造酶的目的。三、酶化學(xué)修飾的概念三、酶化學(xué)修飾的概念酶的化學(xué)修飾

3、（酶的化學(xué)修飾（chemical modificationchemical modification）：）： 通過化學(xué)基團的引入或除去，使蛋白質(zhì)共價通過化學(xué)基團的引入或除去，使蛋白質(zhì)共價結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。酶選擇性化學(xué)修飾：酶選擇性化學(xué)修飾： 描述肽鏈側(cè)鏈基團被化學(xué)試劑專一性地修飾。描述肽鏈側(cè)鏈基團被化學(xué)試劑專一性地修飾。四、酶化學(xué)修飾的目的四、酶化學(xué)修飾的目的1. 1. 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。（5050年代末）年代末）2. 2. 人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴大酶的應(yīng)用人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴大酶的應(yīng)用 范圍。范圍。（7070年代末之后）年代末之后）1

4、 1）提高酶的生物活性（酶活力）。）提高酶的生物活性（酶活力）。2 2）增強酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）。）增強酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）。3 3）消除抗原性（針對特異性反應(yīng)降低生物識別能）消除抗原性（針對特異性反應(yīng)降低生物識別能力）。力）。4 4）產(chǎn)生新的催化能力。）產(chǎn)生新的催化能力。 五、酶五、酶化學(xué)修飾化學(xué)修飾的原理的原理1、如何增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性修飾劑分子存在多個反應(yīng)基團，可與酶形成多點交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。2、如何保護酶活性部位與抗抑制劑大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。3、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)

5、的完整性與抗蛋白水解酶酶化學(xué)修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶： A 大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子。“遮蓋”酶分子上敏感鍵免遭破壞。B 酶分子上許多敏感基團交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。4、如何消除酶的抗原性酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價鍵。 破壞了抗原決定簇抗原性降低乃至消除；“遮蓋”了抗原決定簇阻礙抗原、抗體結(jié)合。5、酶微環(huán)境穩(wěn)定的維持pH值改變時： 破壞了酶分子上靜電形成的化學(xué)鍵，氫鍵等維持天然構(gòu)象的平衡力改變了酶分子上氨基酸殘基的離解狀態(tài)和它們之間的相互結(jié)合及作用方式許多大分子修飾劑本身就是多聚電解質(zhì)，能在酶分子表面或微環(huán)境區(qū)域形成一

6、 層“緩沖外殼”。4.2、化學(xué)修飾的設(shè)計一、酶性質(zhì)的了解一、酶性質(zhì)的了解 （1）酶的穩(wěn)定性）酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等抑制劑等（2）酶活性中心的狀況）酶活性中心的狀況活性中心基團、輔因子等。其他如分子大活性中心基團、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等小、性狀、亞基數(shù)等（3）酶側(cè)鏈基團的性質(zhì)及其反應(yīng)性）酶側(cè)鏈基團的性質(zhì)及其反應(yīng)性巰基、氨基、羧基、咪唑基、羥基、酚基、巰基、氨基、羧基、咪唑基、羥基、酚基、胍基、吲哚基、二硫鍵、硫醚基等胍基、吲哚基、二硫鍵、硫醚基等 二、修飾劑的要求 1、修飾劑的分子量、修飾劑鏈的長度對蛋白質(zhì)的吸附

7、性2、修飾劑上反應(yīng)基團的數(shù)目及位置3、修飾劑上反應(yīng)基團的活化方法與條件一般要求較大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有較多反應(yīng)活性基團； 試劑的選擇要根據(jù)修飾目的選擇例如對氨基修飾可有幾種情況 修飾所有氨基而不修飾其它基團； 僅修飾-氨基； 修飾暴露的或反應(yīng)性高的氨基；修飾具有催化活性的氨基； 例：如果修飾目的是希望改變蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)或溶解性，則必須選擇能引入 最大電荷量的試劑。 用于修飾酶的氨基酸殘基的試劑應(yīng)具備： 選擇性地與一個氨基酸殘基反應(yīng)； 反應(yīng)在酶蛋白不變性條件下進行； 所標記的殘基在肽鏈中穩(wěn)定以易于分離鑒定； 修飾反應(yīng)的程度能簡單測定； 三、反應(yīng)條件的選擇三、反應(yīng)條件的選

8、擇 修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進行，并盡量修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團，使修飾率高，同時不破壞酶活性功能的必需基團，使修飾率高，同時酶的活力回收高。酶的活力回收高。（1）pH與離子強度與離子強度pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團的解離狀態(tài)。決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。（2）修飾反應(yīng)的溫度與時間）修飾反應(yīng)的溫度與時間嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。非專一性的修飾反應(yīng)。 （3）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例）反應(yīng)體

9、系中酶與修飾劑的比例四、四、化學(xué)修飾化學(xué)修飾的影響因素的影響因素有有的情況下化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變并不影響蛋白質(zhì)的的情況下化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變并不影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)生物學(xué)活性活性(稱稱非必需部分的修飾非必需部分的修飾); 但大多情但大多情況下將導(dǎo)致生物活性的改變況下將導(dǎo)致生物活性的改變(如下降以至完全喪如下降以至完全喪失失)。影響蛋白質(zhì)化學(xué)修飾反應(yīng)進程的因素：影響蛋白質(zhì)化學(xué)修飾反應(yīng)進程的因素： 1.蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)性；蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)性；2.修飾劑的反應(yīng)性。修飾劑的反應(yīng)性。一）、蛋白質(zhì)功能基反應(yīng)性的影響因素一）、蛋白質(zhì)功能基反應(yīng)性的影響因素蛋白質(zhì)的修飾反應(yīng)都是親核反應(yīng)。被蛋白質(zhì)的修飾反應(yīng)都是親核反應(yīng)。被

10、修飾蛋修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團的親核性與其白質(zhì)側(cè)鏈基團的親核性與其pKpK值相關(guān)值相關(guān)。影響蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團影響蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團pKpK值的因素有值的因素有 1 1、微環(huán)境：微區(qū)極性、基團間的氫鍵、靜電相互作、微環(huán)境：微區(qū)極性、基團間的氫鍵、靜電相互作用用2 2、基團之間的障礙（位阻效應(yīng)）、基團之間的障礙（位阻效應(yīng)）3 3、其它因素：電荷轉(zhuǎn)移、共價鍵形成、金屬螯合、其它因素：電荷轉(zhuǎn)移、共價鍵形成、金屬螯合、旋轉(zhuǎn)自由度等旋轉(zhuǎn)自由度等二）、蛋白質(zhì)二）、蛋白質(zhì)功能基的超反應(yīng)性功能基的超反應(yīng)性超反應(yīng)性超反應(yīng)性：指蛋白質(zhì)的某個側(cè)鏈基團與個別試劑：指蛋白質(zhì)的某個側(cè)鏈基團與個別試劑能發(fā)生非常迅速的反應(yīng)。能發(fā)生非常迅速

11、的反應(yīng)。酶的催化活性基團通常對修飾劑是有反應(yīng)的，但酶的催化活性基團通常對修飾劑是有反應(yīng)的，但酶的超反應(yīng)基團不一定是酶活性部位上的基團，酶的超反應(yīng)基團不一定是酶活性部位上的基團，可能與酶的功能或構(gòu)象沒有明顯聯(lián)系?？赡芘c酶的功能或構(gòu)象沒有明顯聯(lián)系。三）、修飾三）、修飾劑反應(yīng)性的決定因素劑反應(yīng)性的決定因素1. 選擇性吸附選擇性吸附：化學(xué)修飾前，修飾劑根據(jù)各自的：化學(xué)修飾前，修飾劑根據(jù)各自的特點，選擇性地吸附于低或高極性區(qū)的，有時特點，選擇性地吸附于低或高極性區(qū)的，有時可以根據(jù)對速度的飽和效應(yīng)，檢測出蛋白質(zhì)可以根據(jù)對速度的飽和效應(yīng)，檢測出蛋白質(zhì) - 修飾劑復(fù)合物的形成，類似酶修飾劑復(fù)合物的形成，類似酶

12、-底物復(fù)合物。底物復(fù)合物。2. 靜電相互作用靜電相互作用：帶電的修飾劑能選擇性地吸引：帶電的修飾劑能選擇性地吸引到蛋白質(zhì)表面帶相反電荷的部位。該作用可使到蛋白質(zhì)表面帶相反電荷的部位。該作用可使修飾劑向多功能部位中的一個殘基定位，或向修飾劑向多功能部位中的一個殘基定位，或向雙功能基一側(cè)定位。此外，靜電排斥力能抑制雙功能基一側(cè)定位。此外，靜電排斥力能抑制修飾作用。修飾作用。3. 位阻因素位阻因素：蛋白質(zhì)表面的位阻因素，或底物、：蛋白質(zhì)表面的位阻因素，或底物、輔因子、抑制劑所產(chǎn)生的位阻因素都能阻止修輔因子、抑制劑所產(chǎn)生的位阻因素都能阻止修飾劑與功能基的正常反應(yīng)。但修飾的結(jié)果卻能飾劑與功能基的正常反應(yīng)

13、。但修飾的結(jié)果卻能提供蛋白質(zhì)表面的有用信息。提供蛋白質(zhì)表面的有用信息。4. 催化因素催化因素：修飾部位附近的其它功能基，若起：修飾部位附近的其它功能基，若起一般的酸堿催化作用，也能影響修飾反應(yīng)。一般的酸堿催化作用，也能影響修飾反應(yīng)。5. 局部環(huán)境的極性局部環(huán)境的極性：許多有機反應(yīng)的速度與溶劑：許多有機反應(yīng)的速度與溶劑的極性有關(guān)，而有些反應(yīng)則與極性無關(guān)；疏水的極性有關(guān)，而有些反應(yīng)則與極性無關(guān)；疏水環(huán)境能阻止產(chǎn)物中電荷分離的反應(yīng)。環(huán)境能阻止產(chǎn)物中電荷分離的反應(yīng)。4.34.3、化學(xué)修飾的種類、化學(xué)修飾的種類一一表面修飾表面修飾二二內(nèi)部修飾內(nèi)部修飾三三與輔因子相關(guān)的修飾與輔因子相關(guān)的修飾四四物理修飾物

14、理修飾 五五親和修飾親和修飾一、一、表面修飾表面修飾1.化學(xué)固定化化學(xué)固定化2.小分子修飾小分子修飾3.大分子修飾大分子修飾4.肽鏈的交聯(lián)肽鏈的交聯(lián)1、化學(xué)固定化通過酶表面的酸性或堿性氨基酸殘基將酶共價連接到惰性載體上，從而改變酶所處的環(huán)境，酶的性質(zhì)也相應(yīng)發(fā)生改變。例如：酶固定到電荷載體上，由于介質(zhì)中的質(zhì)子靠近載體，并與載體上的電荷 發(fā)生作用，使酶的最適pH發(fā)生偏移。糖化酶固定到陰離子載體上，最適pH4.5升到6.5，與D-木糖異構(gòu)酶的最適pH7.5 靠近，可簡化高果糖漿生產(chǎn)工藝。 載體與底物帶相同電荷，固定化后反應(yīng)系統(tǒng)Km增加，反之，Km降低。 增加酶分子構(gòu)象穩(wěn)定性。2.小分子修飾 （酶蛋白

15、側(cè)鏈基團修飾）定義：定義：通過選擇性的試劑或親和標記試劑與酶分子側(cè)通過選擇性的試劑或親和標記試劑與酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。鏈上特定的功能基團發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。側(cè)鏈基團：側(cè)鏈基團：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團。主要組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。側(cè)鏈基團修飾劑：側(cè)鏈基團修飾劑：采用各種小分子化合物。采用各種小分子化合物。 2020種不同氨基酸的側(cè)鏈基團中只有極性氨基酸的種不同氨基酸的側(cè)鏈基團中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。幾種重要的修飾反應(yīng)：

16、幾種重要的修飾反應(yīng)：烷基化反應(yīng)烷基化反應(yīng)?；磻?yīng)?；磻?yīng)氧化還原反應(yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng) 1) 1) 烷基化反應(yīng)烷基化反應(yīng)試劑特點：試劑特點：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團（如的親核基團（如NHNH2 2，-SH-SH等）發(fā)生烷基化。等）發(fā)生烷基化?？勺饔没鶊F：可作用基團：氨基（氨基（LysLys，ArgArg），巰基（），巰基（CysCys），羧基（），羧基（AspAsp、GluGlu），甲硫基（），甲硫基（MetMet），咪唑基（），咪唑基（HisHis）。）。修飾劑：修飾劑：2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙二硝基氟苯、碘乙酸、

17、碘乙酰胺等。酰胺等。 烷基化反應(yīng) 2) 2) 酰基化反應(yīng)?；磻?yīng)試劑特點：試劑特點： 含有含有 結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團上的結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團上的親核基團，使之?；?。親核基團，使之酰基化。可作用基團：可作用基團： 氨基，巰基，醇羥基（氨基，巰基，醇羥基（SerSer、ThrThr），酚），酚羥基（羥基（TyrTyr）?；磻?yīng) 3) 3) 氧化和還原反應(yīng)氧化和還原反應(yīng)試劑特點：試劑特點：具有氧化性或還原性。具有氧化性或還原性。氧化劑：氧化劑：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亞胺溴代琥珀酰亞胺可被氧化的側(cè)鏈基團：可被氧化的側(cè)鏈基團：巰基，甲硫基，吲哚基（巰基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑）、咪唑基

18、，酚基等。基，酚基等。還原劑：還原劑：2巰基乙醇、巰基乙醇、DTT等。等?？杀贿€原的側(cè)鏈基團：可被還原的側(cè)鏈基團：二硫鍵。二硫鍵。連四硫酸鹽氧化巰基，連四硫酸鹽氧化巰基，DTTDTT還原逆回，用于保護巰基。還原逆回，用于保護巰基。 4) 4) 芳香環(huán)取代反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。 碘代：碘代： I2 + HI 硝化：硝化： (NO2)4C + +(NO2)3CH （四硝基甲烷）（四硝基甲烷） 特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾氨基修飾（氨基修飾（Lys）羧基修飾（羧基修飾（Asp、Glu）巰基修飾（巰基修飾（Cys）

19、胍基修飾（胍基修飾（Arg）羥基修飾（羥基修飾（Ser、Thr、Tyr）咪唑基修飾（咪唑基修飾（His）吲哚基修飾（吲哚基修飾（Trp）甲硫基修飾（甲硫基修飾（Met）二硫鍵修飾二硫鍵修飾親和修飾親和修飾 1）、）、 氨基（氨基（NH2）修飾）修飾 氨基在酶蛋白中主要是氨基在酶蛋白中主要是 和肽鏈末和肽鏈末端氨基端氨基的的 -NH2 親核反應(yīng)活性很高，易被選親核反應(yīng)活性很高，易被選擇性修飾擇性修飾一般情況下一般情況下 -NH2 的的 pKa = 10，其解離程度取，其解離程度取決于微環(huán)境決于微環(huán)境氨基的修飾反應(yīng)主要有氨基的修飾反應(yīng)主要有N-烷基化等烷基化等乙酸酐乙酸酐 2,4,6-三硝基苯磺酸

20、三硝基苯磺酸(TNBS)2,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)碘代乙酸碘代乙酸(IAA)還原還原烷基化烷基化醛醛丹磺酞氯丹磺酞氯(DNS)乙?；阴；姾上щ姾上Х蓟蓟姾上щ姾上Х蓟蓟姾上щ姾上榛榛胴撾姾梢胴撾姾煞蓟蓟姾上щ姾上б胝姾梢胝姾?2）、）、 修飾修飾羧基在酶蛋白中主要是羧基在酶蛋白中主要是 ，以及肽鏈的末端羧基，以及肽鏈的末端羧基在水溶液中，在水溶液中，COOH 通常解離成通常解離成，親核，親核性降低，對其修飾的方法有限，主要反應(yīng)為成酯、性降低，對其修飾的方法有限，主要反應(yīng)為成酯、成酰胺反應(yīng)成酰胺反應(yīng) 修飾反應(yīng)修飾反

21、應(yīng) R, R為烷基；為烷基；X為鹵素為鹵素碳二亞胺碳二亞胺 修飾反應(yīng)修飾反應(yīng) 羧基羧基酯化反應(yīng)酯化反應(yīng)硼氟化三甲洋鹽硼氟化三甲洋鹽甲醇甲醇胃蛋白酶與胃蛋白酶與14C硼氟硼氟化三甲洋鹽在化三甲洋鹽在pH 5時時酶完全酶完全失活，研究失活，研究表表明兩明兩-COOH為該酶必為該酶必需基團需基團 3）、）、修飾修飾 巰基在酶蛋白中的來源巰基在酶蛋白中的來源是是 巰基的巰基的，往往是酶分子中反應(yīng)活性，往往是酶分子中反應(yīng)活性最高的基團最高的基團巰基容易被氧化成巰基容易被氧化成 ，在維持蛋白亞基，在維持蛋白亞基之間的相互作用和酶催化過程中起重要作用之間的相互作用和酶催化過程中起重要作用巰基用烷基化試劑修飾

22、后一般能得到穩(wěn)定的巰基用烷基化試劑修飾后一般能得到穩(wěn)定的修飾產(chǎn)物修飾產(chǎn)物 修飾反應(yīng)修飾反應(yīng) 常用于定量測定蛋白質(zhì)分子常用于定量測定蛋白質(zhì)分子-SH數(shù)目、研究數(shù)目、研究-SH的改變程度和的改變程度和-SH所處的環(huán)境所處的環(huán)境。4,4-二硫二吡啶（二硫二吡啶（4-PDS）5,5-二硫二硫-2-硝基苯甲酸硝基苯甲酸(DTNB) 又稱又稱Ellman試劑試劑412 nm處處有有強強吸收吸收324 nm處處有吸收有吸收TNB 修飾反應(yīng)修飾反應(yīng) 對氯汞苯甲酸對氯汞苯甲酸(PMB) 2-氯汞氯汞-4-硝基苯酚硝基苯酚(MNP)250 nm處有處有最大光吸收最大光吸收可容許低濃度蛋白質(zhì)的光可容許低濃度蛋白質(zhì)的

23、光譜定量分析譜定量分析 修飾反應(yīng)修飾反應(yīng) N一乙基馬來酰亞胺一乙基馬來酰亞胺(NEM)碘代乙酸碘代乙酸(IAA)同時會使氨基乙?；瑫r會使氨基乙酰化300 nm處處有最大光有最大光吸收吸收 4） 胍基（胍基（N=C(NH2)2）修飾）修飾胍基存在于酶蛋白的胍基存在于酶蛋白的 側(cè)鏈上側(cè)鏈上在結(jié)合帶有陰離子底物的酶的活性部位中起在結(jié)合帶有陰離子底物的酶的活性部位中起重要作用重要作用胍基堿性強，難以和大多數(shù)試劑反應(yīng)，一般胍基堿性強，難以和大多數(shù)試劑反應(yīng)，一般采用具有采用具有兩個鄰位羰基兩個鄰位羰基的化合物，在中性或的化合物，在中性或弱堿性條件下反應(yīng)，一般是可逆反應(yīng)弱堿性條件下反應(yīng)，一般是可逆反應(yīng) 修

24、飾反應(yīng)修飾反應(yīng) 胍基胍基（與鄰二酮的反應(yīng)）（與鄰二酮的反應(yīng)）丁二酮丁二酮硼酸鹽硼酸鹽1,2-環(huán)己二酮環(huán)己二酮硼酸鹽硼酸鹽苯乙二醛苯乙二醛需在黑暗中進行需在黑暗中進行, 因其可作為光因其可作為光敏劑破壞敏劑破壞TrpHisTyr等殘基等殘基 5）、酚基和羥基（）、酚基和羥基（OH）修飾）修飾酶蛋白中含羥基的氨基酸殘基有：酶蛋白中含羥基的氨基酸殘基有：Ser、Thr、Tyr羥基的羥基的，通常修飾劑能同，通常修飾劑能同時修飾羥基、氨基和巰基時修飾羥基、氨基和巰基相比于相比于 Ser 和和 Thr 的羥基要活潑的羥基要活潑一些，更容易發(fā)生修飾；酚基具有芳香性，一些，更容易發(fā)生修飾；酚基具有芳香性，能發(fā)

25、生親電取代反應(yīng)能發(fā)生親電取代反應(yīng) 修飾反應(yīng)修飾反應(yīng) 酚基和酚羥基酚基和酚羥基酚基親電取代反應(yīng)酚基親電取代反應(yīng)碘化反應(yīng)碘化反應(yīng)四硝基甲烷四硝基甲烷(TNM) 修飾反應(yīng)修飾反應(yīng) （酚）羥基（酚）羥基O-?；磻?yīng)?；磻?yīng)N-乙酰咪唑乙酰咪唑二異丙基氟磷酸二異丙基氟磷酸(DFP) 6）、）、 咪唑基修飾咪唑基修飾 咪唑基存在于酶蛋白的咪唑基存在于酶蛋白的 His 殘基殘基側(cè)鏈上側(cè)鏈上His 是多種酶的活性中心，是電荷中繼網(wǎng)中的是多種酶的活性中心，是電荷中繼網(wǎng)中的重要成員重要成員對對 His 咪唑基的修飾，一般是通過咪唑基的修飾，一般是通過 N-烷基化烷基化或或 C-親核取代來進行親核取代來進行對咪

26、唑進行修飾后，酶活性一般會受到顯著對咪唑進行修飾后，酶活性一般會受到顯著影響影響 修飾反應(yīng)修飾反應(yīng) 咪唑基咪唑基 N-取代反應(yīng)取代反應(yīng)焦碳酸二乙醋（焦碳酸二乙醋（DPC）碘乙酸碘乙酸DPC是最常用的是最常用的His殘基的殘基的修飾試劑修飾試劑,， 使使His殘基的咪殘基的咪唑基上唑基上1個個N羧乙基化羧乙基化, 并使并使得在得在240nm處的光吸收增加。處的光吸收增加。在堿性條件下該取代反應(yīng)是在堿性條件下該取代反應(yīng)是可逆的。可逆的。 修飾反應(yīng)修飾反應(yīng) 咪唑基咪唑基雜環(huán)上的親電取代反應(yīng)雜環(huán)上的親電取代反應(yīng)碘化反應(yīng)碘化反應(yīng) 7）、吲哚基修飾）、吲哚基修飾 吲哚基存在于酶蛋白的吲哚基存在于酶蛋白的

27、側(cè)鏈上側(cè)鏈上Trp 殘基疏水性較強，一般位于酶分子的內(nèi)部，殘基疏水性較強，一般位于酶分子的內(nèi)部，反應(yīng)活性比氨基和巰基差，因此對其修飾較反應(yīng)活性比氨基和巰基差，因此對其修飾較困難，很多能與吲哚基反應(yīng)的試劑，一般優(yōu)困難，很多能與吲哚基反應(yīng)的試劑，一般優(yōu)先與巰基或氨基反應(yīng)。先與巰基或氨基反應(yīng)。有時候有時候 Tyr 會對吲哚基的修飾產(chǎn)生干擾會對吲哚基的修飾產(chǎn)生干擾 修飾反應(yīng)修飾反應(yīng) 吲哚基吲哚基與與 Koshland 試劑的反應(yīng)試劑的反應(yīng)水溶性差水溶性差, 使修飾反應(yīng)較難進行使修飾反應(yīng)較難進行410nm有光吸收有光吸收,可測定修飾程度可測定修飾程度或或Trp殘基定量殘基定量2-羥基羥基-5-硝基芐基硝

28、基芐基或或Koshland試劑試劑(HNBB)4一硝基苯硫氯一硝基苯硫氯這些試劑也非常容易與巰基作用，因此修飾色氨酸殘基這些試劑也非常容易與巰基作用，因此修飾色氨酸殘基時需要對巰基進行保護。時需要對巰基進行保護。 8）、）、 甲硫基修飾甲硫基修飾 酶蛋白中酶蛋白中 中的硫以硫醚的形式存在中的硫以硫醚的形式存在硫醚中的硫原子雖然具有親核性，但反應(yīng)活硫醚中的硫原子雖然具有親核性，但反應(yīng)活性較差，在溫和的條件下一般不發(fā)生反應(yīng)性較差，在溫和的條件下一般不發(fā)生反應(yīng)硫醚的主要反應(yīng)主要是氧化反應(yīng)，產(chǎn)物為砜硫醚的主要反應(yīng)主要是氧化反應(yīng)，產(chǎn)物為砜和亞砜；另外，采用某些試劑也可以進行和亞砜；另外，采用某些試劑也可

29、以進行 S-烷基化反應(yīng)烷基化反應(yīng) 修飾反應(yīng)修飾反應(yīng) 甲硫基甲硫基 過氧化氫過氧化氫過甲酸過甲酸碘乙酰胺碘乙酰胺9 ）、二硫鍵的修飾）、二硫鍵的修飾同同-SH類似類似, -S-S-具有其特有的特性具有其特有的特性, 可用來進行特異可用來進行特異的修飾的修飾, 通常是通過還原的方法通常是通過還原的方法. 這些方法通常與某些這些方法通常與某些-SH修飾方法結(jié)合修飾方法結(jié)合,以阻止再氧化成以阻止再氧化成-S-S-或計算斷裂開的或計算斷裂開的-S-S-數(shù)目。數(shù)目。常用的有常用的有: 巰基乙醇巰基乙醇(具高度選擇性和長的半衰期具高度選擇性和長的半衰期. 但但要有變性劑要有變性劑, 且使用大大過量的巰基乙醇

30、且使用大大過量的巰基乙醇)、 Cleland 試劑試劑包括二硫蘇糖醇包括二硫蘇糖醇(DTT)及其差向異構(gòu)體二硫赤蘚糖醇及其差向異構(gòu)體二硫赤蘚糖醇(DTE) (勿需過量還原劑勿需過量還原劑)。-S-S-經(jīng)還原成為經(jīng)還原成為-SH，一般情況下很容易自動氧化，一般情況下很容易自動氧化，故需經(jīng)過羧甲基處理防止重新氧化。故需經(jīng)過羧甲基處理防止重新氧化。氨基酸側(cè)鏈基團修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、乙酸酐、醛Asp、Glu羧基水溶性碳化二亞胺、硼氟化三甲洋鹽、甲醇Arg胍基苯乙二醛，1,2環(huán)己二酮、丁二酮Cys巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來酰亞胺二硫鍵巰基乙

31、醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羥基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺Met硫醚基碘乙酰胺 各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑 解釋修飾效果須十分小心，因為：解釋修飾效果須十分小心，因為：任何一種修飾劑任何一種修飾劑不是絕對專一不是絕對專一的。的。有些修飾劑有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化失失活，活， 不一定是活性中心基團被共價修飾。不一定是活性中心基團被共價修飾。不同部分的相同基團，修飾效果不同不同部分的相同基團，修飾效果不同，分子內(nèi)部的必需基團，不易被修飾。分子內(nèi)部的必需基團，不易被修飾。10 ）、親和修飾）、親和修飾親和修飾，酶的專一性

32、修飾親和修飾，酶的專一性修飾 用于酶化學(xué)修飾的試劑，即使對某一基團反應(yīng)是用于酶化學(xué)修飾的試劑，即使對某一基團反應(yīng)是專一的，也仍然有多個同類殘基與之反應(yīng)，因此專一的，也仍然有多個同類殘基與之反應(yīng)，因此對某個特定殘基的選擇性修飾比較困難，為了解對某個特定殘基的選擇性修飾比較困難，為了解決此問題，開發(fā)了親和標記試劑決此問題，開發(fā)了親和標記試劑 這類修飾劑也稱為位點專一性抑制劑，一般具有這類修飾劑也稱為位點專一性抑制劑，一般具有與底物相似的結(jié)構(gòu)，對酶活性部位具有高度的親與底物相似的結(jié)構(gòu)，對酶活性部位具有高度的親和性和性，可專一性標記于酶的活性中心上，使酶不，可專一性標記于酶的活性中心上，使酶不可逆失活

33、，因此也稱可逆失活，因此也稱專一性不可逆抑制劑專一性不可逆抑制劑 親和標記試劑的特點親和標記試劑的特點在使酶不可逆失活以前，要與酶形成在使酶不可逆失活以前，要與酶形成可逆復(fù)可逆復(fù)合物合物親和試劑的修飾程度是有限的親和試劑的修飾程度是有限的競爭性類似物的存在會降低修飾反應(yīng)速率競爭性類似物的存在會降低修飾反應(yīng)速率親和試劑體積不能太大，否則造成較大的空親和試劑體積不能太大，否則造成較大的空間位阻間位阻修飾產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定，應(yīng)便于表征和定量修飾產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定，應(yīng)便于表征和定量 KS 型（競爭性標記試劑）型（競爭性標記試劑）根據(jù)底物的結(jié)構(gòu)設(shè)計的，具有與底物根據(jù)底物的結(jié)構(gòu)設(shè)計的，具有與底物的的結(jié)結(jié)合基團，同時還

34、具有能與酶活性部位氨基酸側(cè)鏈反合基團，同時還具有能與酶活性部位氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)的活性基團應(yīng)的活性基團特點特點 底物、競爭性抑制劑及其他結(jié)構(gòu)類似物對修飾具有保底物、競爭性抑制劑及其他結(jié)構(gòu)類似物對修飾具有保護作用護作用 修飾反應(yīng)是定量定點進行的修飾反應(yīng)是定量定點進行的Kcat 型（自殺性標記試劑）型（自殺性標記試劑）根據(jù)酶催化過程設(shè)計，專一性很高根據(jù)酶催化過程設(shè)計，專一性很高具有酶的底物性質(zhì)，還有一個具有酶的底物性質(zhì)，還有一個的反應(yīng)基團在酶的反應(yīng)基團在酶催化下催化下，與酶活性部位氨基酸側(cè)鏈發(fā)生反應(yīng)，與酶活性部位氨基酸側(cè)鏈發(fā)生反應(yīng)，不可逆地結(jié)合不可逆地結(jié)合3.大分子修飾（大分子結(jié)合修飾） 是目前是目前

35、應(yīng)用最廣應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。的酶分子修飾方法。 （1 1）定義）定義：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細的改變，從而改變酶的特空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。性與功能的方法。（2 2）修飾劑：）修飾劑： 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）、右旋糖酐（）、右旋糖酐（dextrandextran）、肝素）、肝素（heparinheparin）、蔗糖聚合物（）、蔗糖聚合物（FicollFicoll）等。）等。 修飾方法：非共價修飾、共價修飾。修飾方法：非共價修飾、共價修飾。非共價修飾非共價修飾 使用一些能與酶使用一些能

36、與酶非共價非共價地相互作用而又地相互作用而又能有效地保護酶的一些能有效地保護酶的一些添加物添加物，如聚乙二醇、，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過右旋糖苷等，它們既能通過氫鍵氫鍵固定在酶分固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護酶的活力。從而保護酶的活力。 一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來 保護保護酶的活力。酶的活力。 另一類添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之另一類添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之間相互作用時，其表面區(qū)域內(nèi)排除了水分間相互

37、作用時，其表面區(qū)域內(nèi)排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加了。就增加了。共價修飾共價修飾 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過肝素等，通過共價鍵共價鍵連接于酶分子的表面，形連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。成一層覆蓋層。大分子修飾大分子修飾(共價共價)的過程的過程修飾劑的選擇修飾劑的選擇修飾劑的活化修飾劑的活化修飾蛋白質(zhì)修飾蛋白質(zhì)將修飾劑與蛋白分離將修飾劑與蛋白分離1）聚乙二醇及其修飾反應(yīng)）聚乙二醇及其修飾反應(yīng) 聚乙二醇的特點：聚乙二醇的特點： 線性線性分子分子(HO-CH2-CH2-O-C

38、H2)n-CH2-OH； 具有良好的具有良好的生物相容性和水溶性生物相容性和水溶性； 在體內(nèi)在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性無毒性、無殘留、無免疫原性； 末端活化后末端活化后可與酶產(chǎn)生交聯(lián)可與酶產(chǎn)生交聯(lián)； 覆蓋在酶分子表面形成疏松的覆蓋在酶分子表面形成疏松的親水外殼親水外殼，導(dǎo)致，導(dǎo)致流體動力學(xué)發(fā)生改變。流體動力學(xué)發(fā)生改變。聚乙二醇作為修飾劑應(yīng)注意的問題：聚乙二醇作為修飾劑應(yīng)注意的問題： PEG分子量為分子量為7505000的修飾效果較好，的修飾效果較好，用用甲氧基甲氧基PEG效果更好；效果更好； 修飾效果還與所用修飾效果還與所用活化劑與酶的配比活化劑與酶的配比有關(guān)，有關(guān)，PEG : E=15

39、50 : 1 40%活力保持?；盍Ρ３?。應(yīng)盡量選擇應(yīng)盡量選擇對酶活性影響小對酶活性影響小的修飾方法。的修飾方法。修飾反應(yīng)修飾反應(yīng)疊氮法疊氮法 將將PEG的末端的末端羥基轉(zhuǎn)化為疊氮基羥基轉(zhuǎn)化為疊氮基，然后與酶反應(yīng)。然后與酶反應(yīng)。琥珀酸酐法琥珀酸酐法 用二溴代琥珀酸酐在溫和堿性條件用二溴代琥珀酸酐在溫和堿性條件下將下將PEG活化，經(jīng)減壓濃縮得活化活化，經(jīng)減壓濃縮得活化PEG，可可與酶分子上氨基交聯(lián)與酶分子上氨基交聯(lián)。 三氯均嗪法三氯均嗪法 PEG經(jīng)三氯均嗪法活化后，用石油醚經(jīng)三氯均嗪法活化后，用石油醚抽提或減壓蒸餾，制得活化抽提或減壓蒸餾，制得活化PEG。羰二亞胺法羰二亞胺法 修飾酶分子上的羧基修

40、飾酶分子上的羧基重氮法重氮法 將將PEG末端羥基轉(zhuǎn)換成重氮基團，再末端羥基轉(zhuǎn)換成重氮基團，再在在弱堿性弱堿性條件下修飾酶分子中的酚基、條件下修飾酶分子中的酚基、咪唑基。咪唑基。2）糖類的修飾反應(yīng)）糖類的修飾反應(yīng) 溴化氰法溴化氰法 右旋糖苷經(jīng)溴化氰活化后，在堿性條右旋糖苷經(jīng)溴化氰活化后，在堿性條件下與酶的游離氨基共價連接，生成修飾件下與酶的游離氨基共價連接，生成修飾酶。酶。 高碘酸氧化法高碘酸氧化法 高碘酸將右旋糖苷上鄰雙羥基氧化成高碘酸將右旋糖苷上鄰雙羥基氧化成醛基，醛基再與酶分子上的氨基結(jié)合而生醛基，醛基再與酶分子上的氨基結(jié)合而生成修飾酶。成修飾酶。 4、肽鏈交聯(lián)、肽鏈交聯(lián)采用雙功能基團化合

41、物（雙功能試劑），在酶采用雙功能基團化合物（雙功能試劑），在酶分子中對分子中對空間距離較近空間距離較近 的兩個氨基酸殘基側(cè)鏈基團的兩個氨基酸殘基側(cè)鏈基團之間進行共價交聯(lián)之間進行共價交聯(lián)雙功能試劑：指具有兩個反應(yīng)活性部位，分為同型雙功能交聯(lián)劑和異型雙功能交聯(lián)劑，可在相隔較近的兩個氨基酸殘基間搭橋、形成多肽鏈內(nèi)、鏈間或蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)，而不引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的重大改變的試劑。雙功能試劑還可將一蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)到一個化學(xué)惰性的水不溶性的生物大分子上，形成固定化蛋白質(zhì)。表征交聯(lián)在一起的氨基酸殘基或蛋白質(zhì)，可提供許多關(guān)于蛋白質(zhì)構(gòu)象和蛋白質(zhì)間相互作用的信息。 側(cè)鏈基團修飾側(cè)鏈基團修飾分子內(nèi)交聯(lián)試劑分子內(nèi)交聯(lián)試

42、劑 同型、異型同型、異型 可裂解、不可裂解可裂解、不可裂解分子內(nèi)交聯(lián)分子內(nèi)交聯(lián) 增加酶分子表面交聯(lián)鍵的數(shù)目。增加酶分子表面交聯(lián)鍵的數(shù)目。 分子間交聯(lián)分子間交聯(lián) 用雙功能或多功能試劑使不同的酶交聯(lián)用雙功能或多功能試劑使不同的酶交聯(lián)起來產(chǎn)生雜合酶。起來產(chǎn)生雜合酶。 二、內(nèi)部二、內(nèi)部修飾修飾1.酶蛋白主鏈修飾酶蛋白主鏈修飾2.催化基團的修飾催化基團的修飾3.肽鏈伸展后的修飾肽鏈伸展后的修飾1、酶蛋白主鏈修飾、酶蛋白主鏈修飾酶法：酶原酶法：酶原酶酶 酶蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾）酶蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾） 利用酶分子利用酶分子主鏈的切斷和連接主鏈的切斷和連接，使酶分子，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及

43、其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。改變酶的特性和功能的方法。蛋白主鏈修飾采用酶法（蛋白主鏈修飾采用酶法（用專一性較強的蛋白用專一性較強的蛋白酶或肽酶為修飾劑酶或肽酶為修飾劑）。）。 酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：三種情況中的一種： 1 、引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。、引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2、 仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。3 、有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準確的催、有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準確的催化

44、部位，酶活力提高?；课?，酶活力提高。后兩種情況，后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵肽鏈的水解在限定的肽鍵上進行上進行，稱，稱肽鏈有限水解肽鏈有限水解。 2、催化基團的修飾、催化基團的修飾 定點突變：轉(zhuǎn)變氨基酸側(cè)鏈定點突變：轉(zhuǎn)變氨基酸側(cè)鏈 氨基酸的置換修飾可以采用化學(xué)修飾方法。氨基酸的置換修飾可以采用化學(xué)修飾方法。例如，例如，Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的桿菌蛋白酶活性中心的Ser轉(zhuǎn)換為轉(zhuǎn)換為Cys，修飾后，修飾后該酶失去對蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)該酶失去對蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性，因此可用了催

45、化硝基苯酯等底物水解的活性，因此可用于肽的合成。于肽的合成。缺點缺點：化學(xué)修飾法：化學(xué)修飾法 難度大，成本高，專一難度大，成本高，專一性差，而且要對酶分子逐個進行修飾，操性差，而且要對酶分子逐個進行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)作復(fù)雜，難以工業(yè) 化生產(chǎn)?；a(chǎn)。 3、肽鏈伸展后的修飾、肽鏈伸展后的修飾 先用變性劑對酶進行變性處理，再進行修飾，先用變性劑對酶進行變性處理，再進行修飾，然后重新折疊成某種活性的構(gòu)象。然后重新折疊成某種活性的構(gòu)象。Saraswothi等，先讓酶變性，然后加入競爭性等，先讓酶變性，然后加入競爭性抑制劑，待獲得所希望酶的構(gòu)象后，用戊二醛固定，抑制劑，待獲得所希望酶的構(gòu)象后，用戊

46、二醛固定，然后透析除去抑制劑。然后透析除去抑制劑。他們以丙酸作競爭性抑制劑，他們以丙酸作競爭性抑制劑，把核糖核酸酶制成一種把核糖核酸酶制成一種“酸性脂酶酸性脂酶”，從而改變了，從而改變了酶的底物專一性、創(chuàng)造了新的酶活力。酶的底物專一性、創(chuàng)造了新的酶活力。三、與輔因子相關(guān)的修飾三、與輔因子相關(guān)的修飾 1、對依賴輔因子的酶的修飾、對依賴輔因子的酶的修飾 1）、如果輔因子與酶是非共價結(jié)合，則可將輔因子）、如果輔因子與酶是非共價結(jié)合，則可將輔因子共價結(jié)合到酶分子上。共價結(jié)合到酶分子上。2）、引入新的具有強反應(yīng)的輔因子。迄今最成功的）、引入新的具有強反應(yīng)的輔因子。迄今最成功的例子是例子是Kaiser將黃

47、素共價結(jié)合在木瓜蛋白酶上，將黃素共價結(jié)合在木瓜蛋白酶上，利用黃素的溴酰衍生物與木瓜蛋白酶的共價結(jié)合利用黃素的溴酰衍生物與木瓜蛋白酶的共價結(jié)合成為黃素木瓜蛋白酶，從而將蛋白酶轉(zhuǎn)變成氧化成為黃素木瓜蛋白酶，從而將蛋白酶轉(zhuǎn)變成氧化還原酶。還原酶。3、金屬離子置換金屬離子置換修飾修飾Metal ion substitute modification2、金屬酶的金屬取代、金屬酶的金屬取代 可改變酶的專一性、穩(wěn)定性、抑制作用等?？筛淖兠傅膶Ｒ恍?、穩(wěn)定性、抑制作用等。 把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修

48、飾。性和功能發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。通過修飾了解各種金屬離子在酶催化過程中的作用，闡通過修飾了解各種金屬離子在酶催化過程中的作用，闡明催化機制明催化機制適用對象：適用對象：（metalloenzyme）一種結(jié)合金屬的酶，以一個或幾個金屬離子作為一種結(jié)合金屬的酶，以一個或幾個金屬離子作為 金屬離子或是直接參與催化作用，或是對保持酶的活性和構(gòu)金屬離子或是直接參與催化作用，或是對保持酶的活性和構(gòu)象起穩(wěn)定作用象起穩(wěn)定作用金屬酶純化時仍保留著金屬酶純化時仍保留著的功能金屬離子的功能金屬離子常見的金屬酶及其離子種類常見的金屬酶及其離子種類 -淀粉酶淀粉酶 Ca2+、Mg2+、Zn2+谷氨酸

49、脫氫酶谷氨酸脫氫酶 Zn2+過氧化氫酶過氧化氫酶 Fe2+酰基氨基酸酶?；被崦?Zn2+超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶 Cu2+、Zn2+細胞色素細胞色素 P450 單加氧酶單加氧酶 Fe2+固氮酶固氮酶 Fe(II)、Mo(IV)谷胱甘肽過氧化物酶谷胱甘肽過氧化物酶 Se(IV)主要的金屬離子主要的金屬離子Ca、Mg、Cu、Zn、Co、Fe、Mn 等等Cyt P450金屬離子置換修飾的方法金屬離子置換修飾的方法酶的提純酶的提純除去原有金屬離子除去原有金屬離子 加入加入金屬螯合劑金屬螯合劑，如，如 EDTA 等，讓酶分子中的金等，讓酶分子中的金屬離子與屬離子與 EDTA形成螯合物形成螯合物

50、透析、超濾或?qū)游龀ヲ衔锿肝觥⒊瑸V或?qū)游龀ヲ衔锛尤胫脫Q的離子加入置換的離子 加入含另一種金屬離子的溶液，酶蛋白與其結(jié)合加入含另一種金屬離子的溶液，酶蛋白與其結(jié)合 用透析或?qū)游龅确椒ǔノ唇Y(jié)合的離子用透析或?qū)游龅确椒ǔノ唇Y(jié)合的離子金屬離子置換修飾的作用金屬離子置換修飾的作用闡明金屬離子對酶催化作用的影響闡明金屬離子對酶催化作用的影響 一般在活性中心的金屬離子能與底物或輔酶一般在活性中心的金屬離子能與底物或輔酶 / 輔基可輔基可逆結(jié)合，從而起到催化作用逆結(jié)合，從而起到催化作用提高酶的催化效率提高酶的催化效率 將將 Zn 型型 -淀粉酶置換成淀粉酶置換成 Ca 型，活力可提高型，活力可提高

51、20%30%增強酶的穩(wěn)定性增強酶的穩(wěn)定性 Fe-SOD 置換成置換成 Mn-SOD 后穩(wěn)定性增強，對后穩(wěn)定性增強，對 NaN3 敏感敏感性降低性降低改變酶的動力學(xué)特性改變酶的動力學(xué)特性 ?；被崴饷富钚圆课坏孽；被崴饷富钚圆课坏?Zn 被被 Co 置換后，酶的置換后，酶的底物專一性（底物專一性（Km 值）和最適值）和最適 pH 都顯著改變都顯著改變四、物理修飾四、物理修飾 酶分子的物理修飾酶分子的物理修飾通過各種通過各種物理方法物理方法，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法法研究研究極端條件極

52、端條件下酶結(jié)構(gòu)和活性的變化下酶結(jié)構(gòu)和活性的變化物理修飾的特點物理修飾的特點 不改變酶的組成單位及其基團不改變酶的組成單位及其基團 酶分子中的共價鍵不發(fā)生改變酶分子中的共價鍵不發(fā)生改變 酶的一酶的一級結(jié)構(gòu)級結(jié)構(gòu)不變不變 副鍵發(fā)生某些改變和重排副鍵發(fā)生某些改變和重排 酶的酶的高級結(jié)構(gòu)發(fā)生高級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化變化物理修飾的效果物理修飾的效果改變底物特異性改變底物特異性 例：羧肽酶例：羧肽酶 經(jīng)高壓處理，其水解能力降低，而經(jīng)高壓處理，其水解能力降低，而有利于催化肽的合成反應(yīng)（逆反應(yīng)）有利于催化肽的合成反應(yīng)（逆反應(yīng)）改變酶催化的最適溫度改變酶催化的最適溫度 例：纖維素酶經(jīng)高壓處理，最適溫度下降，但在例：纖維

53、素酶經(jīng)高壓處理，最適溫度下降，但在 3040 oC 條件下，活力提高了條件下，活力提高了 10%提高酶的穩(wěn)定性提高酶的穩(wěn)定性 例：用鹽酸胍破壞胰蛋白酶的空間構(gòu)象，伸展肽例：用鹽酸胍破壞胰蛋白酶的空間構(gòu)象，伸展肽鏈，再透析除去鹽酸胍，在不同溫度下重新構(gòu)建鏈，再透析除去鹽酸胍，在不同溫度下重新構(gòu)建 / 恢復(fù)酶的構(gòu)象，恢復(fù)酶的構(gòu)象，50 oC 下重新構(gòu)建的酶穩(wěn)定性比天下重新構(gòu)建的酶穩(wěn)定性比天然酶提高然酶提高 5 倍倍4.4、修飾酶性質(zhì)的變化及原因修飾酶性質(zhì)的變化及原因修飾酶的酶學(xué)性質(zhì)變化修飾酶的酶學(xué)性質(zhì)變化最適最適pH值值熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性體內(nèi)抗原性體內(nèi)抗原性半衰期半衰期酶動力學(xué)性質(zhì)酶動力學(xué)性質(zhì)對組織

54、的對組織的分布能力變化分布能力變化1、增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性、增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性修飾劑與酶形成修飾劑與酶形成多點交聯(lián)多點交聯(lián)，一般能增強酶的，一般能增強酶的熱穩(wěn)定性，可能的原因是多點交聯(lián)產(chǎn)生固定熱穩(wěn)定性，可能的原因是多點交聯(lián)產(chǎn)生固定酶分子構(gòu)象的效應(yīng)酶分子構(gòu)象的效應(yīng) PEG 修飾酶在熱穩(wěn)定性上沒有明顯提高，可能由修飾酶在熱穩(wěn)定性上沒有明顯提高，可能由于于 PEG 和酶是單點交聯(lián)和酶是單點交聯(lián)酶分子內(nèi)基團間相互作用在受熱情況下發(fā)生酶分子內(nèi)基團間相互作用在受熱情況下發(fā)生了變化，向熱力學(xué)上熵增加的方向變化，即了變化，向熱力學(xué)上熵增加的方向變化，即從緊密有序趨于隨機松散。通過修飾后，

55、使從緊密有序趨于隨機松散。通過修飾后，使酶天然構(gòu)象產(chǎn)生酶天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性剛性”，不易伸展打開，不易伸展打開，減小熱振動，從而增強酶的熱穩(wěn)定性減小熱振動，從而增強酶的熱穩(wěn)定性 2、保護酶活性部位與抗抑制劑、保護酶活性部位與抗抑制劑大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮遮蓋蓋”了酶的活性部位。了酶的活性部位。3、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶白水解酶酶化學(xué)修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶化學(xué)修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶：酶： A 大分子修飾劑產(chǎn)生大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙

56、空間障礙阻擋蛋白阻擋蛋白水解酶接近酶分子。水解酶接近酶分子?！罢谏w遮蓋”酶分子上敏感鍵酶分子上敏感鍵免遭破壞。免遭破壞。B 酶分子上許多敏感基團酶分子上許多敏感基團交聯(lián)交聯(lián)上修飾劑上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。4、最適、最適 pH 值范圍擴大值范圍擴大一般情況下，修飾酶的最適一般情況下，修飾酶的最適 pH 范圍擴大范圍擴大 豬肝尿酸酶的最適豬肝尿酸酶的最適 pH 為為10.5，在，在pH 7.4 的生理環(huán)的生理環(huán)境中酶活僅剩境中酶活僅剩 510%，用白蛋白修飾后，最適，用白蛋白修飾后，最適 pH 范圍擴大，在范圍擴大，在pH 7.4 時仍保留時

57、仍保留 60% 酶活酶活 吲哚吲哚-3-鏈烷羥化酶修飾后，最適鏈烷羥化酶修飾后，最適 pH 從從 3.5 增加到增加到 5.5，在，在 pH 7左右時，修飾酶活力比天然酶增加左右時，修飾酶活力比天然酶增加 3 倍，在生理環(huán)境下抗腫瘤效果比天然酶大得多倍，在生理環(huán)境下抗腫瘤效果比天然酶大得多可能的原因可能的原因 修飾酶的微環(huán)境更穩(wěn)定修飾酶的微環(huán)境更穩(wěn)定 修飾酶被修飾酶被“固定固定”在一個更活潑的狀態(tài)在一個更活潑的狀態(tài)5、半衰期延長、半衰期延長酶經(jīng)修飾增強了抗蛋白水解、抗抑制劑和抗失活因酶經(jīng)修飾增強了抗蛋白水解、抗抑制劑和抗失活因子的能力及對熱穩(wěn)定性提高，半衰期一般都比天然子的能力及對熱穩(wěn)定性提高

58、，半衰期一般都比天然酶延長酶延長6、減弱或消除體內(nèi)抗原性、減弱或消除體內(nèi)抗原性有些修飾劑在消除酶抗原性上并無作用，如有些修飾劑在消除酶抗原性上并無作用，如 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）修飾酶；糖類物質(zhì)也不容易消（聚乙烯吡咯烷酮）修飾酶；糖類物質(zhì)也不容易消除酶的抗原性除酶的抗原性現(xiàn)在比較公認的是現(xiàn)在比較公認的是 PEG 和人血清蛋白在消除酶抗原和人血清蛋白在消除酶抗原性上效果明顯，原因可能是修飾劑破壞（共價結(jié)合）性上效果明顯，原因可能是修飾劑破壞（共價結(jié)合）或或“遮蓋遮蓋”了抗原決定簇，使之抗原性減弱或消除了抗原決定簇，使之抗原性減弱或消除7、酶動力學(xué)性質(zhì)、酶動力學(xué)性質(zhì)絕大多數(shù)酶經(jīng)修飾后最大反應(yīng)速度

59、絕大多數(shù)酶經(jīng)修飾后最大反應(yīng)速度 Vmax 沒有變沒有變化化有些酶在修飾后，米氏常數(shù)有些酶在修飾后，米氏常數(shù) Km 通常會增大，這通常會增大，這可能是交聯(lián)于酶上的大分子所產(chǎn)生的空間障礙可能是交聯(lián)于酶上的大分子所產(chǎn)生的空間障礙影響了底物對酶的接近和結(jié)合影響了底物對酶的接近和結(jié)合修飾酶抵抗各種失活因子的能力增強和體內(nèi)半修飾酶抵抗各種失活因子的能力增強和體內(nèi)半衰期的延長，能夠彌補衰期的延長，能夠彌補 Km 增大的缺陷增大的缺陷8、對組織的分布能力變化、對組織的分布能力變化某些酶經(jīng)化學(xué)修飾后，所帶電荷情況發(fā)生變某些酶經(jīng)化學(xué)修飾后，所帶電荷情況發(fā)生變化，改變其靜電吸附能力，或修飾酶的分子化，改變其靜電吸附

60、能力，或修飾酶的分子本身具有靶向性，因此使修飾酶對組織的分本身具有靶向性，因此使修飾酶對組織的分布能力有所改變，能在血液中被一些器官選布能力有所改變，能在血液中被一些器官選擇性地吸收。擇性地吸收。4.54.5、化學(xué)修飾的應(yīng)用、化學(xué)修飾的應(yīng)用一一理論研究方面理論研究方面二二醫(yī)藥領(lǐng)域醫(yī)藥領(lǐng)域三三工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用四四其他方面應(yīng)用其他方面應(yīng)用一、理論研究方面一、理論研究方面 可用于以下研究：可用于以下研究：氨基酸數(shù)量與順序測定；氨基酸數(shù)量與順序測定；氨基酸殘基的存在狀態(tài)；氨基酸殘基的存在狀態(tài)；確定酶活性部位與作用機制；確定酶活性部位與作用機制；酶中特定基團之間距離等。酶中特定基團之間距