生物化學實驗1-生物化學實驗1ppt課件

1、實驗四實驗四 血清蛋白的醋酸纖維素薄膜電泳血清蛋白的醋酸纖維素薄膜電泳 實驗目的實驗目的1.1.掌握電泳法分離蛋白質(zhì)的原理、操作方法。掌握電泳法分離蛋白質(zhì)的原理、操作方法。 2.2.了解電泳法分離蛋白質(zhì)的臨床意義。了解電泳法分離蛋白質(zhì)的臨床意義。 醋酸纖維素薄膜：醋酸纖維素薄膜： 醋酸纖維素二乙酸纖維素薄膜具有勻一的泡沫醋酸纖維素二乙酸纖維素薄膜具有勻一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，滲透性強，對分子移動無阻力，用它作區(qū)帶狀結(jié)構(gòu)，滲透性強，對分子移動無阻力，用它作區(qū)帶電泳的支持物，具有用樣量少，分離清晰，無吸附作電泳的支持物，具有用樣量少，分離清晰，無吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分用。目前

2、可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分離和免疫電泳等方面。離和免疫電泳等方面。醋酸纖維素薄膜經(jīng)醋酸纖維素薄膜經(jīng)1,4二氧六環(huán)、透明液或液二氧六環(huán)、透明液或液體石蠟處理即透明，因而可得背景為無色的電泳圖譜。體石蠟處理即透明，因而可得背景為無色的電泳圖譜。實驗原理實驗原理n電泳電泳: :帶電質(zhì)點在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)帶電質(zhì)點在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。在一定象。在一定pHpH條件下，不同的質(zhì)點由于等電點不同而帶不同性條件下，不同的質(zhì)點由于等電點不同而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也質(zhì)的電荷，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也

3、不同，即它們的電泳遷移率不同，因此可使它們分離。不同，即它們的電泳遷移率不同，因此可使它們分離。n 影響電泳遷移率的外界因素：電場強度、溶液的影響電泳遷移率的外界因素：電場強度、溶液的pHpH值、溶液值、溶液的離子強度和電滲現(xiàn)象。的離子強度和電滲現(xiàn)象。n影響電泳遷移率的內(nèi)在因素：質(zhì)點所帶凈電荷的量、質(zhì)點的影響電泳遷移率的內(nèi)在因素：質(zhì)點所帶凈電荷的量、質(zhì)點的大小和形狀。大小和形狀。n醋酸纖維素薄膜電泳具有微量、快速、簡便、分辨力高，對醋酸纖維素薄膜電泳具有微量、快速、簡便、分辨力高，對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點。樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點。n采用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法稱為醋酸纖維素薄采

4、用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法稱為醋酸纖維素薄膜電泳。醋酸纖維素是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋膜電泳。醋酸纖維素是纖維素的羥基乙酰化所形成的纖維素醋酸酯，將它溶于有機溶劑如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酸酯，將它溶于有機溶劑如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具酯等后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為120m，有很強的通透性，有很強的通透性，對分子移動阻力很小。對分子移動阻力很小。n本實驗以醋酸纖維素為電泳支持物，分離各種血清蛋白。血本實驗以醋酸纖維素為電泳支持物，分離各

5、種血清蛋白。血清中含有清蛋白、清中含有清蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白和各種脂蛋球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組成、分子量、等電點及形狀不白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組成、分子量、等電點及形狀不同，在電場中的遷移速度不同。以醋酸纖維素薄膜為支持物，同，在電場中的遷移速度不同。以醋酸纖維素薄膜為支持物，正常人血清在正常人血清在pH8.6的緩沖體系中電泳，染色后可顯示的緩沖體系中電泳，染色后可顯示5條區(qū)帶。條區(qū)帶。其中清蛋白的泳動速度最快，其余依次為其中清蛋白的泳動速度最快，其余依次為1-、2-、-及及-球球蛋白蛋白蛋白質(zhì)名稱蛋白質(zhì)名稱等電點等電點pIpI）相對分子質(zhì)

6、量相對分子質(zhì)量/Mr/Mr白蛋白白蛋白11球蛋白球蛋白22球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白4.805.065.065.126.857.56900020000030000090000150000156000300000血清蛋白血清蛋白實驗器材及試劑實驗器材及試劑一、器材：一、器材：醋酸纖維素薄膜醋酸纖維素薄膜2cm8cm）、培養(yǎng)皿、濾紙、）、培養(yǎng)皿、濾紙、無齒鑷、剪子、加樣器可用蓋玻片或無齒鑷、剪子、加樣器可用蓋玻片或X膠片或微膠片或微量加樣器）、直尺、鉛筆、玻璃板量加樣器）、直尺、鉛筆、玻璃板8cm12cm）、）、燒杯、試管、試管架、吸管、電泳儀、電泳槽。燒杯、試管、試管架、吸管、電泳儀、

7、電泳槽。二、試劑二、試劑實驗步驟實驗步驟1.1. 準備準備 將緩沖液加入電泳槽的兩槽內(nèi)，并使兩側(cè)的液面等高。將緩沖液加入電泳槽的兩槽內(nèi)，并使兩側(cè)的液面等高。裁剪尺寸合適的濾紙條，疊成四層貼在電泳槽的兩側(cè)支架上，裁剪尺寸合適的濾紙條，疊成四層貼在電泳槽的兩側(cè)支架上，一端與支架前沿對齊，另一端侵入電泳槽的緩沖液內(nèi)，使濾一端與支架前沿對齊，另一端侵入電泳槽的緩沖液內(nèi)，使濾紙全部濕潤，此即紙全部濕潤，此即 “濾紙橋濾紙橋” ” 。 1：濾紙橋：濾紙橋2：電極緩沖液：電極緩沖液3：醋酸纖維素薄膜：醋酸纖維素薄膜 將醋酸纖維素薄膜切成將醋酸纖維素薄膜切成2cm2cm8cm8cm大小，在無光澤面的一大小，在

8、無光澤面的一端約端約1.5cm1.5cm處，用鉛筆輕劃一直線，作為點樣位置。然后將處，用鉛筆輕劃一直線，作為點樣位置。然后將無光澤面向下，置于盛有巴比妥緩沖液的培養(yǎng)皿中浸泡，待無光澤面向下，置于盛有巴比妥緩沖液的培養(yǎng)皿中浸泡，待充分浸透約充分浸透約20min20min即無白色斑點后取出，用潔凈濾紙輕即無白色斑點后取出，用潔凈濾紙輕輕吸去表面的多余緩沖液。輕吸去表面的多余緩沖液。2. 2. 點樣點樣 用加樣器取少量血清用加樣器取少量血清( (約約2 23 3l)l)，加在點樣線上，待血清，加在點樣線上，待血清滲入膜內(nèi)，移開加樣器。點樣時應注意血清要適量，應形成均滲入膜內(nèi)，移開加樣器。點樣時應注意

9、血清要適量，應形成均勻的直線，并避免弄破薄膜勻的直線，并避免弄破薄膜. .3.3. 平衡與電泳平衡與電泳 將點樣后的薄膜有光面朝上，點樣的一端靠近負極，將點樣后的薄膜有光面朝上，點樣的一端靠近負極，平直地貼于電泳槽支架的濾紙上，平衡約平直地貼于電泳槽支架的濾紙上，平衡約5 5分鐘。蓋上電泳分鐘。蓋上電泳槽蓋，通電進行電泳。調(diào)節(jié)電壓為槽蓋，通電進行電泳。調(diào)節(jié)電壓為100100160160伏，電流伏，電流0.40.40.6mA/cm0.6mA/cm寬，夏季通電寬，夏季通電4545分鐘，冬季通電分鐘，冬季通電6060分鐘，分鐘，待電泳區(qū)帶展開待電泳區(qū)帶展開2.52.53.5cm3.5cm時斷電。時斷

10、電。4.4. 染色染色 用無齒鑷小心取出薄膜，浸于染色液中用無齒鑷小心取出薄膜，浸于染色液中1 13 3分鐘以分鐘以清蛋白帶染透為止）。染色過程中應輕輕晃動染色皿，使清蛋白帶染透為止）。染色過程中應輕輕晃動染色皿，使薄膜與染色液充分接觸，薄膜量較多時，應避免彼此緊貼薄膜與染色液充分接觸，薄膜量較多時，應避免彼此緊貼而影響染色效果。而影響染色效果。5.5. 漂洗漂洗 準備準備3 3個培養(yǎng)皿，裝入漂洗液。從染色液中取出薄膜，依個培養(yǎng)皿，裝入漂洗液。從染色液中取出薄膜，依次在漂洗液中連續(xù)浸洗數(shù)次，直至背景無色為止。將漂凈的次在漂洗液中連續(xù)浸洗數(shù)次，直至背景無色為止。將漂凈的薄膜用濾紙吸干，從正極端起

11、依次為清蛋白薄膜用濾紙吸干，從正極端起依次為清蛋白A A）、）、11、22、及及-球蛋白。球蛋白。6. 定量定量 （1洗脫法：取洗脫法：取6支試管，編號，分別為支試管，編號，分別為A、1、2、和空白管。于清蛋白管加入和空白管。于清蛋白管加入0.4mol/L NaOH溶液溶液4ml,其余其余5管管加加2ml。剪下各條蛋白區(qū)帶，另于空白部分剪一條與各蛋白。剪下各條蛋白區(qū)帶，另于空白部分剪一條與各蛋白區(qū)帶寬度近似的薄膜作為空白，分別浸入各管中，振搖數(shù)次，區(qū)帶寬度近似的薄膜作為空白，分別浸入各管中，振搖數(shù)次，置置37水浴水浴20分鐘，使色澤完全浸出。用分鐘，使色澤完全浸出。用620nm波長以空白波長以

12、空白管調(diào)零比色，讀取各管吸光度，按下式計算：管調(diào)零比色，讀取各管吸光度，按下式計算： T = A2 + 1 + 2 + + 清蛋白清蛋白% 清蛋白管吸光度清蛋白管吸光度2/T100 1-球蛋白球蛋白% 1-球蛋白管吸光度球蛋白管吸光度/T100 2-球蛋白球蛋白% 2-球蛋白管吸光度球蛋白管吸光度/T100 -球蛋白球蛋白% -球蛋白管吸光度球蛋白管吸光度/T100 -球蛋白球蛋白% -清蛋白管吸光度清蛋白管吸光度/T100 （2掃描法：掃描法： 待染色的醋酸纖維素薄膜待染色的醋酸纖維素薄膜完完 全干燥，置透明液中約全干燥，置透明液中約3分分鐘，取出貼于玻片上，薄膜完鐘，取出貼于玻片上，薄膜完

13、全透明。將已透明的薄膜放入全透明。將已透明的薄膜放入全自動光密度計中，對蛋白區(qū)全自動光密度計中，對蛋白區(qū)帶進行掃描，自動繪出電泳圖，帶進行掃描，自動繪出電泳圖，并直接打印出各區(qū)帶的百分含并直接打印出各區(qū)帶的百分含量。量。 正常參考值正常參考值百分比百分比%清蛋白清蛋白57.4571.731-球蛋白球蛋白1.764.482-球蛋白球蛋白4.048.28-球蛋白球蛋白6.7911.39-球蛋白球蛋白11.8522.97A/G1.242.36臨床意義：臨床意義： 急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭時，清蛋白降低，急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭時，清蛋白降低，1、2和和-球蛋白升高；球蛋白升高；慢

14、性活動性肝炎、肝硬化時，清蛋白降低，慢性活動性肝炎、肝硬化時，清蛋白降低，、-球蛋球蛋白升高；白升高；急性炎癥時，急性炎癥時，1、2-球蛋白升高；慢性炎癥時，清蛋球蛋白升高；慢性炎癥時，清蛋白降低，白降低，2、-球蛋白升高；球蛋白升高；紅斑狼瘡、類風濕關(guān)節(jié)炎時，清蛋白降低，紅斑狼瘡、類風濕關(guān)節(jié)炎時，清蛋白降低，-球蛋白顯球蛋白顯著升高；著升高；多發(fā)性骨髓瘤時，清蛋白降低，多發(fā)性骨髓瘤時，清蛋白降低，-球蛋白升高，于球蛋白升高，于和和-球蛋白區(qū)帶之間出現(xiàn)球蛋白區(qū)帶之間出現(xiàn)“M帶。帶。本卷須知本卷須知n市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤與選膜是電市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤與選膜

15、是電泳成敗的關(guān)鍵之一。若飄浮于液面的薄膜在泳成敗的關(guān)鍵之一。若飄浮于液面的薄膜在1530 s內(nèi)迅速內(nèi)迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳。潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳。n醋酸纖維素薄膜電泳常選用醋酸纖維素薄膜電泳常選用pH8.6巴比妥巴比妥-巴比妥鈉緩沖液，巴比妥鈉緩沖液，其濃度為其濃度為0.050.09 mol/L。緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動。緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動速度快速度快,區(qū)帶擴散變寬；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動速度區(qū)帶擴散變寬；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動速度慢，區(qū)帶分布過于集中，不易分辨。慢，區(qū)帶分布過于集中，不易分辨。n點樣時，應將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免引點樣時，應將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免引起樣品擴散起樣品擴散,但不宜太干，否則樣品不易進入膜內(nèi)，造成點樣但不宜太干，否則樣品不易進入膜內(nèi)，造成點樣起始點參差不起，影響分離效果。起始點參差不起，影響分離效果。n點樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或點樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。印出