2019生物競賽-生物化學-07核酸的性質(zhì)及研究方法-楊榮武《生物化學原理（一）》(21張)ppt課件

1、生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武提要提要一、核酸的理化性質(zhì)一、核酸的理化性質(zhì)二、核酸研討的技術(shù)和方法二、核酸研討的技術(shù)和方法 核酸的化學合成核酸的化學合成 核酸的分別、純化和定量核酸的分別、純化和定量 三、核酸一級構(gòu)造的測定三、核酸一級構(gòu)造的測定DNADNA一級構(gòu)造的測定一級構(gòu)造的測定RNARNA一級構(gòu)造的測定一級構(gòu)造的測定 生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武核酸的理化性質(zhì)核酸的理化性質(zhì)n紫外吸收n酸堿解離n變性n復性和雜交DNA的變性和復性的變

2、性和復性生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武變性變性定義：是指核酸遭到加熱、極端的pH或離子強度降低等要素或特殊的化學試劑的作用，其雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈的過程。其中并不涉及共價鍵斷裂。表征：核酸在變性時，紫外吸收和浮力密度升高，黏度降低，生物活性主要是RNA不變、降低或喪失，其中紫外吸收添加的景象稱為增色效應。Tm：雙鏈DNA熱變性是在很窄的溫度內(nèi)發(fā)生的，與晶體在熔點時忽然熔化的情形類似，因此DNA也具有“熔點，用Tm表示。Tm實踐是DNA的雙螺旋有一半發(fā)生熱變性時相應的溫度。DNA的Tm值遭到DNA的均一性、G-C含量、離子強度和特殊的化學試劑的影響。生物競賽-生物

3、化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武GC含量對含量對DNA Tm的影響的影響生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武DNA分子中的分子中的GC含量與含量與DNA Tm之間的關系曲線之間的關系曲線生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武核酸變性在一定條件下也是可逆的。當各種變性要素不復存在的時候，變性時解開的互補單鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋構(gòu)造的景象稱為復性。熱變性DNA 普通經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，此過程被稱為退火。伴隨著DNA復性的是其浮力密度和紫外吸收的減少、粘度的添加和生物活性的恢復，其中紫外吸收減少的景象被稱為減色效應。影響DNA復性的要素有溫度、離子強

4、度、DNA濃度和DNA序列的復雜度等。復性復性生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武DNA的復性歷程的復性歷程生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武不同不同DNA的復性動力學曲線的復性動力學曲線生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武核酸的水解核酸的水解1 1酸水解酸水解 核酸分子內(nèi)的糖苷鍵和磷酸二酯鍵對酸的敏感性不核酸分子內(nèi)的糖苷鍵和磷酸二酯鍵對酸的敏感性不同：糖苷鍵磷酸酯鍵；而嘌呤糖苷鍵嘧啶糖苷同：糖苷鍵磷酸酯鍵；而嘌呤糖苷鍵嘧啶糖苷鍵鍵2 2堿水解堿水解 RNA RNA的磷酸二酯鍵對堿異常敏感，得到的磷酸二酯鍵對堿異常敏感，得到2-2-或或3

5、-3-核苷酸的混合物；核苷酸的混合物；DNADNA對堿的作用并不敏感，其對堿的作用并不敏感，其抗堿水解的生理意義在于作為遺傳物質(zhì)的抗堿水解的生理意義在于作為遺傳物質(zhì)的DNADNA應更穩(wěn)應更穩(wěn)定，不易水解。而定，不易水解。而RNARNA主要是主要是mRNAmRNA是是DNADNA的信使的信使，完成義務后應該迅速降解。，完成義務后應該迅速降解。3 3酶促水解酶促水解生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武不同性質(zhì)的核酸酶不同性質(zhì)的核酸酶Pu表示嘌呤，表示嘌呤，Py表示嘧啶表示嘧啶 生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武核酸的分別、純化和定量核酸的分別、純化和定量 核酸

6、的抽取 兩種核蛋白的分別 蛋白質(zhì)的去除 核酸的沉淀 電泳 離心 層析 核酸的純度的檢測和定量 生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武DNA一級構(gòu)造的測定一級構(gòu)造的測定nSanger發(fā)明的末端終止法或雙脫氧法nMaxam和Gilbert 發(fā)明的化學斷裂法n焦磷酸測序與深度測序生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武末端終止法末端終止法原理：ddNTP參入可導致DNA復制的末端終止步驟：進展四組平行反響每一組反響混合物含有四種ddNTP每一組反響含有一種少量的ddNTP在多數(shù)情況下，聚合酶運用正常的核苷酸，DNA合成正常延伸有時，聚合酶運用ddNTP，而導致末端終止每

7、一組反響中ddNTP的隨機插入留下一系列長度不等的以該雙脫氧核苷酸結(jié)尾的DNA鏈。對每一組反響混合物走凝膠電泳片段越短，走的越快，就越接近凝膠的底部從凝膠的底部向上讀出序列將讀出的序列轉(zhuǎn)化成互補鏈的序列生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武末端終止法圖解末端終止法圖解DNA自動分析儀的組成自動分析儀的組成生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武原理：是用特殊的化學試劑，處置待測的具有末端放射性同位素32P標志的單鏈DNA或者只需一條鏈的末端被放射性同位素標志的雙鏈DNA片段，呵斥特定堿基的修飾、零落和戊糖-磷酸骨架被特異性切割，從而產(chǎn)生一組長度不同的DNA鏈降解產(chǎn)

8、物，經(jīng)聚丙烯凝膠電泳分別和放射自顯影之后，可直接讀出待測DNA片段的核苷酸序列。步驟：進展四組平行的反響G特異性剪切 在堿性條件下，先用硫酸二甲酯 DMS 處置，然后再運用哌啶處置。嘌呤堿基特異性剪切DNA先進展酸處置，然后再加DMS。嘧啶堿基特異性剪切先用肼處置，然后用哌啶處置。C特異性剪切在高鹽下，先用肼處置，然后用哌啶處置。進展聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影。比較G、AG、CT和C各個泳道，自下而上從自顯影片上就可讀出DNA序列?；瘜W斷裂法化學斷裂法生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武化學斷裂法測定化學斷裂法測定DNA一級構(gòu)造的原理一級構(gòu)造的原理 生物競賽-生物化學原理

9、（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武焦磷酸測序焦磷酸測序焦磷酸測序需求在同一反響體系中發(fā)生由4種特異性酶催化的級聯(lián)化學發(fā)光反響，在每一輪測序反響中，只參與一種dNTP，假設該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈的3端并釋放出等量PPi。PPi可轉(zhuǎn)化為可見光信號，并最終轉(zhuǎn)化為一個峰值。每個峰值的高度與反響中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。第一輪反響終了后，再參與下一種dNTP，繼續(xù)下一輪DNA鏈的合成。生物競賽-生物化學原理（結(jié)構(gòu)生物化學）-南京大學楊榮武深度測序深度測序 除了焦磷酸測序法，近幾年來，科學家還發(fā)明了一些新的測序方法，例如單分子測序法single-molecule sequencing。建立在這些新的測序方法根底之上的高通量測序技術(shù)堪稱測序技術(shù)開展歷程的一個里程碑，該技術(shù)可以對數(shù)百萬個DNA分子同時進展測序，操作極為簡便，大大節(jié)約了本錢和時間。這使得對一個物種基因組和轉(zhuǎn)錄組進展細致全面的分析成為能夠，因此也稱其為深度測序deep sequencin