HPLC實(shí)驗(yàn)步驟和方法開發(fā)

1、 在無機(jī)離子分析中應(yīng)用在無機(jī)離子分析中應(yīng)用飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽離子分析飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽離子分析 Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 26:1NS通用檢測器通用檢測器 RI ELSDMS靈敏度ugngpg線性范圍104否103流速敏感是否是溫度敏感是否否破壞性否是是選擇性檢測器選擇性檢測器 ABSFLEC Cond MS靈敏度ngpg

2、fgpgpg線性范圍105103106105103流速敏感否否是是是溫度敏感否否是是是破壞性否否是否是大多數(shù)有機(jī)化合物有一定程度的吸光度，可以測大多數(shù)有機(jī)化合物有一定程度的吸光度，可以測定大多數(shù)的化合物，是目前實(shí)驗(yàn)室中使用最多的定大多數(shù)的化合物，是目前實(shí)驗(yàn)室中使用最多的檢測器檢測器 -多數(shù)公司售出的檢測器中多數(shù)公司售出的檢測器中75%以上是吸以上是吸光度檢測器（其中光度檢測器（其中50%以上是紫外以上是紫外/可見檢可見檢測器，測器，25%是是PDA）實(shí)際濃度濃度理想10吸光度吸光度210光電二極管矩陣檢測器光電二極管矩陣檢測器（ PDA ）的特點(diǎn)和用途）的特點(diǎn)和用途 一種一種三維水平的吸光度檢

3、測器三維水平的吸光度檢測器-采集三維譜圖采集三維譜圖 兼顧紫外檢測器及可見分光光度計(jì)的信息兼顧紫外檢測器及可見分光光度計(jì)的信息在收集色譜圖的同時(shí)，得到光譜圖在收集色譜圖的同時(shí)，得到光譜圖 提供許多有用的功能提供許多有用的功能 -色譜峰的純度鑒定，色譜峰的確認(rèn)色譜峰的純度鑒定，色譜峰的確認(rèn) -可以發(fā)現(xiàn)單波長檢測時(shí)未測到的峰可以發(fā)現(xiàn)單波長檢測時(shí)未測到的峰 -任意波長的色譜再處理任意波長的色譜再處理 -光譜信息光譜信息-光譜庫的建立檢索和擬合光譜庫的建立檢索和擬合 氨基甲酸酯類殺蟲劑OOOOOOCH3黃曲霉毒素多環(huán)芳烴（PAH）OHCH3CH3CH3CH3CH3維生素OOONHCH3CH3CH3返回

4、請(qǐng)請(qǐng)記記住住 每每次次改改變變一一個(gè)個(gè)參參數(shù)數(shù)60/4050/5040/60譜圖62:38 / 42:58 / 72:28 / 2322OHCNCHOHMeOHOHTHFCHOOHOCH3COONaCHOCOOHOCH31234 抗組胺及減充血?jiǎng)┧幬锏姆治隹菇M胺及減充血?jiǎng)┧幬锏姆治鯪CONH2NH3CHOCH2OHCH2OHNNNNH3CH3COOCH2CHCHCHHOHOHOCH2OHNNH3CNH2CH2NSCH2CH2OHCH3 Cl-+1. Niacinamide 煙酰胺2. Pyridoxine 吡哆素， VB63. Riboflavin 核黃素， VB24. Thiamine 硫胺

5、素，VB1長度=內(nèi)徑，L=DL)(DL)(DLoad=進(jìn)樣量(Load)初始2初始現(xiàn)在2現(xiàn)在初始內(nèi)徑=D)(D)(DF=流速(F)2初始2現(xiàn)在初始溶劑 A溶劑 B泵 A泵 B混合器A 高壓梯度溶劑 A泵溶劑 B比例閥（溶劑混合點(diǎn)）混合器B 低壓梯度（溶劑混合點(diǎn)）死體積/譜帶展寬體積(無色譜柱時(shí))滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測器進(jìn)樣器色譜柱色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意注意 滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼 器、混合器及其管路器、混合器及其管路比例閥檢測器進(jìn)樣器ABCD色譜柱色譜柱溶劑輸送系統(tǒng)(泵)低壓梯度 阻尼器 混合器梯度百分比保留時(shí)間

6、梯度曲線好的梯度滯后曲線保留時(shí)間梯度百分比不好的梯度滯后曲線固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)P680A LPG without pulse damperBack-pressure:60 bar, 85 bar and 105 barVariation: 2%Acclaim 120, C18, 5 m, 4.6 x 100 mm; 0.5 mL/min; 25C; 5 L injection volume; UV detection at 256 nm; Eluent (A) Water and (B) Acetonitril; Gradient: 30 % b to 100 %

7、B in 10 min; Methyl-, Ethyl-, Propyl- and Butylparabene, 10 mg/L eachn早流出峰的分離度差.n遲流出峰的峰寬增加而峰高降低.n由于k范圍寬，所以分析時(shí)間長.n強(qiáng)保留組分造成柱污染.等梯度洗脫等梯度洗脫 - 在洗脫樣品的整個(gè)過程中，流動(dòng)相的組成保持不變.優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 改善分離度 提高檢測性能 能夠分離復(fù)雜樣品 縮短分析時(shí)間 降低由于強(qiáng)保留組分而使色譜 柱性能變差的可能性其他應(yīng)用其他應(yīng)用 柱清洗 方法開發(fā)中的嘗試運(yùn)行 梯度洗脫梯度洗脫 - 在分離過程中改變流動(dòng)相組成.% Org02550751000102030Time (min)k增

8、加有機(jī)改性劑的含量增加有機(jī)改性劑的含量分配轉(zhuǎn)移到流動(dòng)相分配轉(zhuǎn)移到流動(dòng)相增加化合物的流速增加化合物的流速5%有機(jī)相100%有機(jī)相從嘗試運(yùn)行開始 - 一個(gè)平緩的梯度您必須確定: 有機(jī)溶劑 初始組成 梯度時(shí)間 梯度陡度 梯度形狀 流速 柱長 柱重新平衡時(shí)間010203040min.100% B100% B0% B0% BtG = 40tG = 20100% B100% B0% B0% BtG = 10tG = 5010陡陡平緩平緩%Btime線性步進(jìn)凹形凸形線性梯度線性梯度線性梯度選凹形梯度曲線選凹形梯度曲線用步進(jìn)梯度或流速梯度用步進(jìn)梯度或流速梯度選凸形梯度曲線選凸形梯度曲線10分鐘的梯度，6分鐘的

9、平衡時(shí)間色譜圖不重復(fù)平衡時(shí)間6分鐘平衡時(shí)間7分鐘平衡時(shí)間8分鐘平衡時(shí)間9分鐘 平衡時(shí)間從6到7分鐘，第一個(gè)峰的保留時(shí)間有明顯的變化，說明6到7分鐘的平衡時(shí)間不足，而8到9分鐘變化不大因而大于這個(gè)時(shí)間時(shí)，平衡充足。02468101214Time (min)5%/min1 ml/min- 5%/ml5%/min2.5 ml/min- 2%/ml011 01 0 001 02 03 04 05 0% O r gk0102030time (min)遷移距離10 cm開始25 cm保留時(shí)間 (min)柱長化合物 A化合物 B10 cm14.215.325 cm18.217.9 k 和有機(jī)改性劑百分含量之間的關(guān)系和有機(jī)改性劑百分含量之間的關(guān)系 - 等梯度條件等梯度條件(n.b. k為對(duì)數(shù)坐標(biāo)為對(duì)數(shù)坐標(biāo))梯度洗脫過程中的遷移梯度洗脫過程中的遷移Ghost Peaks0% MeOH100% 對(duì)于下列應(yīng)用，梯度洗脫可能不適合對(duì)