血紅蛋白的提取和分離教案

1、課題5.3 血紅蛋白的提取和分離教學目標：1、嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白2、了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理教學重點：凝膠色譜法的原理和方法教學難點：樣品的預處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填教材分析：教學過程：（一）引入蛋白質(zhì)是生命活動的主要承擔者，是細胞內(nèi)含量最高的有機化合物。對蛋白質(zhì)的研究有助于人們對生命過程的認識和理解。所以需要從細胞中提取蛋白質(zhì)進行研究。怎樣提取蛋白質(zhì)呢？（二）新課1基礎(chǔ)知識蛋白質(zhì)的相關(guān)知識回憶：蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別，由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。11凝膠色譜法（分配色譜法）：（1）原理：（見

2、課件圖） 分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流動慢。（2）凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。（3）分離過程： 混合物上柱洗脫大分子流動快、小分子流動慢收集大分子收集小分子洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。12凝膠電泳法：（1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。（2）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺經(jīng)膠電泳等。（3）分離過程：在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團帶上正電或負電；加入帶負電荷多的

3、SDS，形成“蛋白質(zhì)SDS復合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。13緩沖溶液（1）原理：由弱酸和相應(yīng)的強堿弱酸鹽組成（如H2CO3NaHCO3，HCNaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。（2）緩沖液作用：抵制外界酸、堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。2實驗設(shè)計2.1蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為哪些基本步驟？樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定。思考：是否所有種類的蛋白質(zhì)的提取和分離都是這樣的？為什么？不是。因為蛋白質(zhì)的來源和性質(zhì)不同，分離方法差別很大。2.2選擇實驗材料（1）你認為鳥類血液和哺乳動物血液中，最好哪種血液來提取血紅蛋白？為什么？哺乳

4、動物血液。因為該細胞中沒有細胞核，血紅蛋白含量高。（2）請閱讀投影資料，認識哺乳動物血液組成及血紅蛋白性質(zhì)。并思考回答下列問題：血液由 和 兩部分組成。血細胞中 細胞數(shù)量最多，細胞的含量最高的化合物是 。該化合物是由 和 構(gòu)成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結(jié)合的 基團。2.3從紅細胞中分離出血紅蛋白的過程為：洗滌紅細胞、釋放血紅蛋白、分離血紅蛋白、透析。洗滌紅細胞的目的是什么？除去血漿蛋白的雜蛋白，有利于后續(xù)步驟的分離純化。紅細胞的洗滌過程為血液檸檬酸鈉低速短時離心吸出上層血漿紅細胞5倍體積生理鹽水 緩慢攪拌10min低速短時離心吸出上清液反復洗滌直至上清液無黃色思考：加入檸檬酸

5、鈉有何目的？為什么要低速、短時離心？為什么要緩慢攪拌？防止血液凝固；防止白細胞沉淀；防止紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。思考：你有什么方法將紅細胞中的血紅蛋白釋放出來？加入蒸餾水，用玻璃棒快速攪拌一段時間。補充：加入蒸餾水后紅細胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。此時，紅細胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白，而且還含有細胞破碎物、脂質(zhì)、甲苯有機溶劑等。怎樣除去這些雜質(zhì)呢？由于它們的密度不同，科學家采取了離心分離的方法：紅細胞破碎混合液中速長時離心（2000c/min×10min）濾紙過濾除去脂質(zhì)分液漏斗分離出血紅蛋白思考：如何除無機鹽離子和小分子

6、有機物質(zhì)呢？。透析。半透膜的選擇透過性，大分子物質(zhì)不能通過半透膜，離子和小分子能夠通過半透膜。在透析過程中，血紅蛋白溶液中的離子和小分子不斷通過半透膜擴散進入到pH7的磷酸緩沖液中。思考：為何使用pH7的磷酸緩沖液？為什么緩沖液量遠多于血紅蛋白溶液量？維持血紅蛋白的正常特性。有利于雜質(zhì)分子充分地向外擴散?？偨Y(jié)：通過以上四個基本過程，紅細胞中的血紅蛋白就被提取出來。但其中還含有其他種類的蛋白質(zhì)分子（如呼吸酶等）。怎樣將雜蛋白與血紅蛋白分離開來呢？我們來研究蛋白質(zhì)提取和分離的第二個步驟粗分離（凝膠色譜操作）。2.5凝膠色譜分離蛋白質(zhì)包括：制作色譜柱、裝填色譜柱、樣品加入和洗脫。根據(jù)教材圖519，說

7、出制作色譜柱需要的材料。橡皮塞2個、打孔器、小刀、移液管、尼龍紗、尼龍網(wǎng)、玻璃管、尼龍管等。色譜柱的制作過程：準備材料加工橡皮塞安裝色譜柱下面進行第二步凝膠色譜柱的裝填。請閱讀教材：色譜柱的裝填過程。步驟操作要求操作要求色譜柱垂直固定在支架上計算稱量凝膠根據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量配制懸浮液凝膠顆粒蒸餾水充分溶脹凝膠顆粒洗脫液沸水浴裝填懸浮液一次性緩慢倒入；輕輕敲打緩沖液洗滌平衡立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h樣品加入和洗脫。其基本過程是：調(diào)節(jié)緩沖液面加入蛋白質(zhì)樣品調(diào)節(jié)緩沖液面洗脫收集分裝蛋白質(zhì)至此，血紅蛋白即可得到粗分離。在整個操作過程中，應(yīng)當注意以下事項：（1）紅細胞的洗滌：洗滌次數(shù)不能過少；

8、低速、短時離心。（2）凝膠的預處理：沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡（3）色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。（4）色譜柱成功標志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。（三）課堂總結(jié)、點評血紅蛋白的取和分離凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定血紅蛋白的提取和離蛋白質(zhì)分子的差異性蛋白質(zhì)分子的差異性凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用緩沖溶液組成作用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定（四）實例探究例1 利用凝膠色譜法，什么樣的蛋白

9、質(zhì)先洗脫出來（ ）A.相對分子質(zhì)量大的B.溶解度高的C.相對分子量小的D.所代電荷多的解析：凝集色譜法使根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)能進入凝膠內(nèi)部通道，路程較長，移動速度較慢；相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)，路程較短，移動速度較快，首先洗脫出來。答案：A例2 蛋白質(zhì)提取和分離分為哪幾步（ ）A.樣品處理、凝膠色譜操作、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳B.樣品處理、凝膠色譜操作、純化C.樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定D.樣品處理、純化、粗分離、純度鑒定解析：蛋白質(zhì)的提取和分離分為樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定四步。A中凝膠色譜操作及SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳為實驗操作過

10、程中的技術(shù)答案：C例3用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時，分子量大的蛋白質(zhì)（ ）A路程較長，移動速度較慢 B路程較長，移動速度較快C路程較短，移動速度較慢 D路程較短，移動速度較快解析：在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢；而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。答案：D（五）鞏固練習1. 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的依據(jù)是（ ） A. 對其他分子的親和力 B. 溶解度 C. 所帶電荷多少 D. 相對分子質(zhì)量的大小2. 凝膠色譜法中所用的凝膠化學本質(zhì)大多是

11、（ ） A. 糖類化合物 B. 脂質(zhì) C. 蛋白質(zhì) D. 核酸3. 選用紅細胞作為分離蛋白質(zhì)的實驗材料，有何好處（ ） A. 血紅蛋白是有色蛋白 B. 紅細胞無細胞核 C. 紅細胞蛋白質(zhì)含量高 D. 紅細胞DNA含量高4. 將攪拌好的混合液離心來分離血紅蛋白溶液時，第二層是（ ） A. 甲苯 B. 血紅蛋白水溶液 C. 脂溶性物質(zhì)的沉淀層 D. 其他雜質(zhì)的沉淀5. 血紅蛋白因含有（ ）而呈紅色 A. O2 B. CO C. CO2 D.血紅素6. 下列操作正確的是（ ） A. 分離紅細胞時采用低速長時間離心 B. 紅細胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水就可 C. 分離血紅蛋白溶液是低速短時間離心

12、 D. 透析時要用20mmol/l的磷酸緩沖液，透析12h7. 樣品的加入和洗脫的敘述正確的是（ ） A. 先加入1ml透析后的樣品 B. 加樣前要使緩沖液緩慢下降全部流出 C. 如果紅色帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功 D. 洗脫時可以用緩沖液也可以用清水8. 下列有關(guān)提取和分離血紅蛋白的程度敘述錯誤的是（ ） A. 樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液 B. 通過透析可以去除樣品中分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取 C. 可通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化 D. 可通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度9. 凝膠色譜法操作正確的是（ ） A. 將橡皮塞上部用刀切出鍋底狀的凹穴 B. 將橡皮塞下部切出凹穴 C. 插入的