DNA生物傳感器監(jiān)測(cè)環(huán)境問(wèn)題

1、細(xì)胞分子生物學(xué)課程論文年級(jí)、專(zhuān)業(yè)：環(huán)境科學(xué)與工程專(zhuān)業(yè)論文題目：DNA生物傳感器的應(yīng)用領(lǐng)域及其研究進(jìn)展授課教師：考試成績(jī)：摘要隨著生物傳感技術(shù)在的廣泛應(yīng)用，本文應(yīng)勢(shì)綜述了DNA生物傳感器的主要應(yīng)用領(lǐng)域及研究進(jìn)展。DNA傳感器用于受感染微生物的核酸序列分析、微量污染物的監(jiān)測(cè)以及研究污染物與DNA之間的相互作用，為污染物毒性作用的進(jìn)一步研究提供理論機(jī)理。由于核酸作為敏感元素固化到傳感器上作為感應(yīng)層具有穩(wěn)定性，易于合成和再生，故DNA生物傳感器中在環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域備受關(guān)注。此外，納米技術(shù)的日臻成熟為DNA生物傳感器指明了廣闊的發(fā)展道路。關(guān)鍵詞：DNA生物傳感器 納米技術(shù) 核酸序列分析1 引言隨著分子生物學(xué)

2、和生物技術(shù)的發(fā)展，人們開(kāi)發(fā)了以核酸探針為識(shí)別元件，基于核酸相互作用原理的DNA生物傳感器。20世紀(jì)60-70年代，也就是生物傳感器的起步階段，當(dāng)時(shí)生物傳感器主要以傳統(tǒng)的酶電極為主，隨著研究的不斷深入80年代到了生物傳感器發(fā)展的高潮階段并研制了介體酶電極，到90年代后，由于生物傳感器的優(yōu)勢(shì)得以在廣泛應(yīng)用，傳統(tǒng)的DNA檢測(cè)主要依靠膜上分子雜交和電泳，其技術(shù)要求高，時(shí)間長(zhǎng)，成本高，效率低。而DNA生物傳感器的出現(xiàn)使DNA得檢測(cè)大大簡(jiǎn)化。DNA序列分析為檢測(cè)環(huán)境微生物和病原菌提供了基礎(chǔ),這種傳感器可大幅度減少分析時(shí)間，簡(jiǎn)化分析手續(xù)，因此，多用來(lái)快速現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。核酸雜交生物傳感器的理論基礎(chǔ)是DNA堿基配對(duì)

3、原理。因高度專(zhuān)一性的DNA雜交反應(yīng)與高靈敏度的電化學(xué)檢測(cè)器相結(jié)合，在環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域、醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域等發(fā)揮著舉足輕重的作用。2 DNA生物傳感器的設(shè)計(jì)原理及分類(lèi)DNA生物傳感器是一種能將目標(biāo)DNA的存在轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓹z測(cè)電信號(hào)的傳感裝置。它由辨認(rèn)元件即DNA探針和換能器兩部分組成。通常是在換能器上固化一條單鏈DNA，經(jīng)過(guò)DNA分子雜交，對(duì)另一條含有互補(bǔ)序列的DNA進(jìn)行識(shí)別，構(gòu)成穩(wěn)定的雙鏈DNA，通過(guò)聲、光、電信號(hào)的轉(zhuǎn)換，對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行檢測(cè)。其設(shè)計(jì)原理是在電極上固定一條含有十幾到上千條核苷酸的單鏈DNA,通過(guò)DNA分子雜交,對(duì)另一條含有互補(bǔ)堿基序列的DNA進(jìn)行識(shí)別,結(jié)合成雙鏈DNA（高利波等，2002

4、）（王建龍，2000）。雜交反應(yīng)在敏感元件上直接完成,換能器能將雜交過(guò)程所產(chǎn)生的變化轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。根據(jù)雜交前后電信號(hào)的變化量,推斷出被檢測(cè)的DNA量。由于雜交后的雙鏈DNA穩(wěn)定性高,在傳感器上表現(xiàn)的物理信號(hào)(電、光、聲等)都較弱,因此,有的DNA傳感器還需在DNA分子之間加入嵌和劑,把分子雜交后的DNA分子含量通過(guò)換能器表達(dá)出來(lái)。因換能器和分子識(shí)別種類(lèi)不同,所以就可以構(gòu)成不同類(lèi)型的DNA生物傳感器。按換能器轉(zhuǎn)換信號(hào)可以分為電化學(xué)DNA傳感器、光學(xué)DNA傳感器、壓電晶體DNA生物傳感器三類(lèi)。3 DNA生物傳感器的應(yīng)用3.1 DNA生物傳感器在環(huán)境監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用DNA生物傳感器具有快速、靈敏、操作

5、方便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，為快速、自動(dòng)化檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。DNA生物傳感器監(jiān)測(cè)環(huán)境中的病原微生物時(shí)選擇被監(jiān)測(cè)對(duì)象的特異性DNA片段為探針，運(yùn)用電化學(xué)或熒光指示劑，檢測(cè)DNA的雜交信號(hào)。基因誘變劑主要是指能夠引起基因變異的芳香族有機(jī)化合物和離子型自由基等，他們可能誘發(fā)癌癥。Mascini課題組認(rèn)為芳香氨化合物與單鏈DNA發(fā)生插入作用后對(duì)鳥(niǎo)嘌呤氧化信號(hào)產(chǎn)生影響，電極表面鳥(niǎo)嘌呤的氧化峰電流降低，而對(duì)單鏈DNA修飾的電極作用后氧化峰電流則升高。該課題組還對(duì)單鏈DNA序列進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)芳香胺與長(zhǎng)鏈DAN修飾的電極作用后電化學(xué)信號(hào)變化顯著，對(duì)含3個(gè)苯環(huán)的芳香胺的靈敏性達(dá)到納摩爾級(jí)，兩個(gè)苯環(huán)的芳香胺的檢測(cè)限達(dá)到微

6、摩爾級(jí)(Pandey,1997)。同樣，Wang等利用污染物與DNA在核酸修飾碳電極表面的相互作用來(lái)檢測(cè)環(huán)境中的有毒物質(zhì)（WangJ.1996）。他們利用雙鏈DNA層與芳香胺之間的鍵合作用，設(shè)計(jì)了一種新型的親和電化學(xué)生物傳感器，用于檢測(cè)芳香類(lèi)化合物，檢測(cè)限達(dá)到納摩爾量級(jí)。通過(guò)對(duì)廢水的測(cè)試結(jié)果與典型的基因毒性測(cè)試相比，可得出該傳感器可用于實(shí)際廢水的監(jiān)測(cè)。Chicharro M 等研究出用于環(huán)境樣品的微生物檢測(cè)，此類(lèi)型傳感器的研究包括核酸探針固定化的優(yōu)化、雜交反應(yīng)條件、指示劑的結(jié)合與檢測(cè)等。但是，DNA分子中電荷的存在會(huì)影響雜交效率(Wang,1996)。Nielson 等為解決這一因素，研究了以

7、肽核酸作為探針的另一類(lèi)傳感器, 肽核酸是以肽為骨架的一種新型的DNA模擬物,具有與DNA和RNA結(jié)合的高度親和性,良好的穩(wěn)定性,并能方便地固相合成. (Nielson,1991)。環(huán)境污染物對(duì)生物體具有較強(qiáng)的“三致效應(yīng)”，其主要原因是污染物分子進(jìn)入生物體內(nèi)與DNA結(jié)合并對(duì)DNA造成不可修復(fù)的損傷。亦基于此，科研工作者采用DNA生物傳感器研究環(huán)境污染物與DNA的作用并實(shí)現(xiàn)對(duì)其的檢測(cè)（劉新會(huì)等，2013）。DNA內(nèi)在的響應(yīng)的變化還可用于檢測(cè)DNA的物理?yè)p傷。近年來(lái)，分析評(píng)價(jià)DNA輻射損傷逐漸引起學(xué)者關(guān)注，Palecek等研究利用滴汞電極的級(jí)化曲線來(lái)分析紫外線對(duì)DNA的損傷（劉萍等，2011）。DN

8、A生物傳感器除用于檢測(cè)外，還可用于研究污染物與DNA之間相互作用，解釋不同污染物的毒性作用機(jī)理（王建龍，2001）。例DNA傳感器可適時(shí)研究DNA與化學(xué)誘變劑之間反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，在污染物與DNA結(jié)合相對(duì)強(qiáng)度方面提供有用信息。3.2 DNA 生物傳感器在醫(yī)療衛(wèi)生方面的應(yīng)用DNA在疾病、病毒檢測(cè)方面也得到廣泛應(yīng)用。Syvanen等在DNA生物傳感器中，利用時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)檢測(cè)腺病毒DNA，檢測(cè)限達(dá)到0.3pg（Syvanen AC,1986）,Ogert等使用瞬波光纖傳感器對(duì)親和純化的多克隆體和單克隆抗體檢測(cè)肉毒毒素A的效果作了比較。將毒素A的抗體共價(jià)結(jié)合在石英光纖表面，然后分別浸到含有毒素A和熒

9、光TRITC的溶液中，最終發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)與樣品中的毒素A成正比，因此，結(jié)合在石英光纖上的多克隆抗體取得較滿(mǎn)意的靈敏度，但是傳感器卻對(duì)破傷風(fēng)毒素沒(méi)有反應(yīng)，即使這兩種毒素基因序列有一定的同源性。由此說(shuō)明DNA生物傳感器在病毒方面的檢測(cè)具有較高的特異性。DNA生物傳感器因其快速、靈敏等優(yōu)勢(shì)在DNA基因分析方面也得到迅速發(fā)展。靶基因的痕量分析對(duì)于疾病診斷和治療都是很重要的，但DNA探針的靈敏度有限，因此高靈敏度檢測(cè)特定DNA序列可采取一系列措施，如選擇良好的雜交嵌合劑、采用修飾電極上非特性吸附等。4 DNA生物傳感器的優(yōu)缺點(diǎn)與傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)相比，DNA生物傳感器的優(yōu)點(diǎn)如下：1）可進(jìn)行液相雜交檢測(cè)，通過(guò)聲

10、、光、電等信號(hào)的變化，對(duì)靶物質(zhì)的DNA進(jìn)行定量檢測(cè)。2）可進(jìn)行DNA實(shí)時(shí)檢測(cè)：將DNA生物傳感技術(shù)與流動(dòng)注射技術(shù)相結(jié)合。3）可對(duì)活體內(nèi)核酸動(dòng)態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。4）DNA傳感技術(shù)與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)結(jié)合，可篩選出選擇性和活性更高的敏感元件，從而研制成多功能、智能的DNA傳感器。5）無(wú)污染，DNA傳感器不需要同位素標(biāo)記，避免了有害物質(zhì)的污染。但是DNA生物傳感器還存在很多不足：目前DNA生物傳感器的研究還處于初級(jí)階段，雖在某些方面有突破，但靈敏度與現(xiàn)行的PCR技術(shù)還有很大差距。同時(shí)也會(huì)受雜質(zhì)的干擾，而影響檢測(cè)預(yù)期。盡管DNA傳感器有不足，但隨著與相關(guān)的技術(shù)結(jié)合對(duì)技術(shù)方法進(jìn)行改造有很廣闊的應(yīng)用前景。從樂(lè)觀角

11、度來(lái)看，DNA生物傳感器對(duì)環(huán)境污染物進(jìn)行研究不僅可以實(shí)現(xiàn)環(huán)境體系中污染物含量的測(cè)定，同時(shí)也為污染物毒性評(píng)價(jià)及從分子水平揭示污染物的生物效應(yīng)提供新思路。5發(fā)展前景隨著納米材料的發(fā)展，納米科學(xué)技術(shù)同信息科學(xué)、材料科學(xué)、生命科學(xué)和環(huán)境科學(xué)等相互交叉將為這些領(lǐng)域的發(fā)展提供新的技術(shù)基礎(chǔ)。近來(lái)的研究表明，納米技術(shù)同生物醫(yī)學(xué)相結(jié)合，在基因分子診斷、免疫分析、疾病治療及分子生物學(xué)及生物工程方面將取得重要發(fā)展，而且是當(dāng)今的研究前沿和發(fā)展方面。傳感器是納米微粒最具有前途的應(yīng)用領(lǐng)域之一，納米微粒具有大的比表面積、高活性特異性、極微小性等于傳感器所要求的多功能化、微型化、高速化相對(duì)應(yīng)。尤其是金納米顆粒具有良好的光學(xué)和

12、電子學(xué)特性，能對(duì)諸多的電化學(xué)檢測(cè)有信號(hào)增強(qiáng)和放大作用，可作為熒光標(biāo)記物外，還能作為電化學(xué)標(biāo)記物，在發(fā)展DNA傳感器方面有很好的應(yīng)用前景。（楊云，聶立波.2006）。金顆粒可與氨基發(fā)生非共價(jià)的靜電吸附而牢固結(jié)合，巰基之間形成很強(qiáng)的Au2S共價(jià)鍵，使膠體金可與生物活性組分結(jié)合，形成的探針可用于生物體系的檢測(cè)中（胡瑞省，劉善堂，1999）。實(shí)驗(yàn)條件下，經(jīng)過(guò)納米顆粒修飾的金片對(duì)HS-DNA探針的吸附量比未經(jīng)修飾的金片可提高3-5倍，同時(shí)也提高了傳感器的靈敏度（楊婕，2007）。Wang等人利用電化學(xué)方法檢測(cè)納米金標(biāo)記的DNA（Wang,1997），將抗生蛋白鏈霉素固定于磁性納米粒子上用來(lái)固定生物素的納

13、米金相結(jié)合（高梅.2006），經(jīng)處理后，對(duì)復(fù)合物上的納米金進(jìn)行溶解后用計(jì)時(shí)電位法進(jìn)行分析，進(jìn)而對(duì)待測(cè)DNA的量進(jìn)行檢測(cè)(李金花，胡勁波.2005)。另外，基因芯片（DNA芯片、DNA微陣列）是將半導(dǎo)體工業(yè)的微型制造技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，通過(guò)將大量的肽核酸或DNA固定在一塊面積極小的硅片、玻片或尼龍膜上等基片構(gòu)成。經(jīng)典芯片與銀染法結(jié)合提高檢測(cè)的靈敏度，納米金的獨(dú)特性質(zhì)為基因芯片的研究提供了一個(gè)方向，并取得一定進(jìn)展。未來(lái),生物傳感器在環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域中的發(fā)展趨勢(shì),將由單一功能向多功能發(fā)展,納米生物傳感器陣列或多種納米生物傳感器的集成,將是生物傳感器的一個(gè)重要發(fā)展方向;集成多種技術(shù),以提高監(jiān)測(cè)效

14、率,如碳納米管技術(shù)（張玉忠，2011）與酶生物傳感器的結(jié)合,提高了生物傳感器的靈敏度并且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于微型化、可批量生產(chǎn),顯示出了新型生物傳感器優(yōu)異的性能和巨大的生命力,進(jìn)一步拓寬了在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用;加速?gòu)脑囼?yàn)階段走向商品化,向微型化、集成化、智能化方向發(fā)展（焦奎等，2010）。參考文獻(xiàn)·焦奎，楊婕等.納米金在DNA生物傳感器和基因芯片研究中的應(yīng)用J.化學(xué)研究與應(yīng)用,2007,19(3):234.·劉萍等.DNA生物傳感器研究綜述 J.2011,25(2):·Pandey P, Weetall H. Detection of aromatic compounds

15、 based on DNA intercalation using an evanescent wave biosensor. Anal Chem, 1995 ,67(4): 787-792.·高利波，俞乃勝. DNA生物傳感器在疾病檢測(cè)中的研究進(jìn)展和應(yīng)用前景J. 2002,24(1):70-71.·王建龍，張悅等.DNA生物傳感器在疾病檢測(cè)中的研究進(jìn)展和應(yīng)用前景J.生物技術(shù)通報(bào)，2000，（3）:13-14.·王建龍.DNA生物傳感器在環(huán)境污染監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用J.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2001，28（1）：125-128.·WangJ, Chicharr

16、o M, Rivas G,et al.Narasalah Dontha Percio A M Farias and Haruki Shirashi Anal J .Anal.Chem,1996,68(13):2251-2254.·梁剛，劉新會(huì)等.電化學(xué)DNA生物傳感器在檢測(cè)環(huán)境有機(jī)污染物中的應(yīng)用J.環(huán)境化學(xué)，2013，32（7）：1388-1393.·Nielson P, Egholm M, Berg R,et al. Sequence-selectiverecognition of DNA by strand displacement with a thymine-sub

17、stituted polyamide. science,1991,254(8): 1497-1500·焦奎，周娜等.多壁碳納米管/納米Ag-TiO2膜DNA電化學(xué)生物傳感器R.2010,38(3):302-304.·李澤全，張懷等.基于碳納米管的生物傳感器研究進(jìn)展J.材料導(dǎo)報(bào)，2008，22（8）：101-103.·李妍等.基于環(huán)境污染的生物傳感器J.環(huán)境研究與監(jiān)測(cè)，2010，（4）：78-79.·Wang J.DNA electrochemical biosensor for enyironmental;menitoring.Anal.Chim.Acta.,1997,347:1.·胡瑞省,劉善堂.納米粒子通過(guò)形成Au2S鍵的組裝J.物理化學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 15(11): 12O15.·趙紅秋，林 琳，唐季安.利用納米金顆粒增強(qiáng)DNA 探針在傳感器上的固定程度和識(shí)別能力J.科學(xué)通報(bào),2001,46(4):294-296.·張玉忠，姜