內(nèi)分泌干擾物質(zhì)(環(huán)境荷爾蒙)生物檢測(cè)方法

1、內(nèi)分泌干擾物質(zhì)(環(huán)境荷爾蒙)生物檢測(cè)方法美國(guó)環(huán)保署成立內(nèi)分泌干擾物質(zhì)篩選及測(cè)定方法諮詢委員會(huì)(Endocrine Disruptor Screening and Testing Advisory Committee, EDSTAC)，欲針對(duì)環(huán)境中可能干擾內(nèi)分泌干擾系統(tǒng)的化學(xué)物質(zhì)，建立完善的評(píng)估模式。這個(gè)委員會(huì)於1998年8月報(bào)告中提出分級(jí)或分層方式篩選及測(cè)試具內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，其步驟包括剛開(kāi)始的分類(lèi)(Initial Sorting)、優(yōu)先順位的設(shè)定(Priority Setting)、第一階段篩選(Tier One Screening)及第二階段篩選(Tier Two Screening)。內(nèi)分

2、泌干擾物質(zhì)篩選及測(cè)定方法諮詢委員會(huì)一開(kāi)始目標(biāo)設(shè)定為化學(xué)物質(zhì)對(duì)雌性激素、雄性激素及甲狀腺素的影響，因?yàn)榇巳N荷爾蒙掌控主要的生殖、發(fā)育及生長(zhǎng)等生理作用，爾後對(duì)此三種荷爾蒙研究所累積的資料，再推估其他荷爾蒙可能受到的影響，到那時(shí)候，美國(guó)環(huán)保署將再評(píng)估擴(kuò)大研究範(fàn)圍至其他荷爾蒙。 首先進(jìn)行分類(lèi)工作；美國(guó)目前使用近87000種化學(xué)物質(zhì)，其中包括900種為農(nóng)藥成份中的主成分(pesticide active ingredients)，2500種為農(nóng)藥的其它常明白告知的成份，75500種為工業(yè)化學(xué)物質(zhì)，8000種為化妝品、食品添加及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。內(nèi)分泌干擾物質(zhì)篩選及測(cè)定方法諮詢委員會(huì)將其分為四類(lèi)(如圖一)，作

3、為執(zhí)行篩選程序：(一)第一類(lèi)包括一些無(wú)機(jī)酸或鹼、氨基酸、醣類(lèi)及一些平均分子量(number average molecular weight, NAMW)高於1000的聚合物等，這些物質(zhì)似乎不能表現(xiàn)出荷爾蒙活性故不須進(jìn)行篩選，平均分子量高於1000的聚合物很難通過(guò)細(xì)胞膜更別提有任何生物作用或內(nèi)分泌干擾影響，所以對(duì)此類(lèi)物質(zhì)先持保留(Hold)態(tài)度。 (二) 第二類(lèi)化學(xué)物質(zhì)則包括一些未具充份資料顯示其對(duì)內(nèi)分泌干擾的潛力，這些物質(zhì)將經(jīng)過(guò)優(yōu)先順位設(shè)定後進(jìn)行第一階段篩選。若有篩選出具有干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的潛力，則進(jìn)入第二階段測(cè)試試驗(yàn)，若無(wú)則歸類(lèi)至第一類(lèi)保留。 (三) 第三類(lèi)物質(zhì)則有充份資料顯示，可免去第一階

4、段篩選過(guò)程，逕行進(jìn)入第二階段測(cè)試評(píng)估；或已經(jīng)過(guò)第一階段篩選，其結(jié)果疑似對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)具干擾作用的化學(xué)物質(zhì)。(四) 第四類(lèi)化學(xué)物質(zhì)則具有足夠的資料顯示其對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)造成影響，可以逕行提報(bào)給政府及決策單位評(píng)估其危害程度。 美國(guó)環(huán)保署估算第三或四類(lèi)化學(xué)物質(zhì)各不超出1000種。 優(yōu)先順位的設(shè)定主要是針對(duì)上述第二類(lèi)化學(xué)物質(zhì)，因?yàn)榈诙?lèi)化學(xué)物質(zhì)就有62000種，所以須經(jīng)優(yōu)先順位設(shè)定以加速後續(xù)篩選進(jìn)行。農(nóng)藥中其他其份(非主成分以外的成份)及日常用品中的化學(xué)物質(zhì)，因缺乏足夠的資料，均歸類(lèi)為第二類(lèi)化學(xué)物質(zhì)。由於此類(lèi)物質(zhì)太多，彼此之間的化學(xué)特性又不盡相同，美國(guó)環(huán)保署成立內(nèi)分泌干擾物質(zhì)優(yōu)先順位設(shè)定資料庫(kù)(Endocr

5、ine Disruptor Priority Setting Data Base)，將此類(lèi)化學(xué)物質(zhì)依其釋放於環(huán)境中的劑量、生物體中接受器的鍵結(jié)位置、環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的頻度及含量等資料加以收集整理，具類(lèi)似的資料再細(xì)分為一小類(lèi)，例如歸類(lèi)為食物與飲用水中的化學(xué)物質(zhì)，悠關(guān)直接對(duì)人體的影響，將先進(jìn)行第一階段篩選。內(nèi)分泌干擾物質(zhì)篩選及測(cè)定方法諮詢委員會(huì)正發(fā)展一套適合做為例行性優(yōu)先順位設(shè)定的篩選檢測(cè)方法快速前篩選(High Throughput Pre-screening, HTPS)，檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)對(duì)雌性素與雄性素接受器交互作用，所有過(guò)程除少數(shù)須前處理操作外，包括樣品秤重、溶於適當(dāng)溶劑、取使當(dāng)量至反應(yīng)盤(pán)上、篩選及

6、讀取篩選結(jié)果全自動(dòng)化，所有流程能連續(xù)不斷進(jìn)行，在檢測(cè)大量樣品時(shí)，相對(duì)下縮短每個(gè)樣品花費(fèi)的時(shí)間。 但快速前篩選結(jié)果並不能取代第一階段的篩選，只是在設(shè)定哪些物質(zhì)須優(yōu)先進(jìn)入第一篩選階段，美國(guó)環(huán)保署仍認(rèn)為此檢測(cè)方法須再多加其他方法來(lái)輔助其篩選功能，如量化的結(jié)構(gòu)活性關(guān)係(Quantitative Structure-Activity Relationship)，電腦模擬化學(xué)分子結(jié)構(gòu)模式對(duì)生物內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響，這是利用模擬化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)來(lái)預(yù)測(cè)此化合物與雌性素及雄性素接受器結(jié)合的能力，通常以天然荷爾蒙鍵結(jié)親合力做相對(duì)比較，但是須注意的是此方法只做與接受器鍵結(jié)的親合力，而化學(xué)物質(zhì)干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)還有許多不同的可

7、能途徑。第一階段篩選試驗(yàn)工作，分為三項(xiàng)活體外(in vitro)及五項(xiàng)活體內(nèi)(in vivo)試驗(yàn)，因?yàn)椴煌飳?duì)外來(lái)物質(zhì)可能透過(guò)不同代謝途徑，所以透過(guò)不同生物篩選之?；铙w外試驗(yàn)靈敏度高及偵測(cè)誤差低且可縮短篩選時(shí)間，但是直接以細(xì)胞株進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)於如何進(jìn)入生物體內(nèi)，透過(guò)其新陳代謝及轉(zhuǎn)化可能的變化，則無(wú)法深究瞭解。 故經(jīng)過(guò)第一階段篩選後，若無(wú)干擾作用產(chǎn)生，則歸類(lèi)至保留類(lèi)(Hold)；反之，進(jìn)入第二階段測(cè)試做更進(jìn)一步測(cè)試工作。第一階段篩選試驗(yàn)工作，分為三項(xiàng)活體外(in vitro)及五項(xiàng)活體內(nèi)(in vivo)試驗(yàn)，因?yàn)椴煌飳?duì)外來(lái)物質(zhì)可能透過(guò)不同代謝途徑，所以透過(guò)不同生物篩選之?；铙w外試驗(yàn)靈敏度

8、高及偵測(cè)誤差低且可縮短篩選時(shí)間，但是直接以細(xì)胞株進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)於如何進(jìn)入生物體內(nèi)，透過(guò)其新陳代謝及轉(zhuǎn)化可能的變化，則無(wú)法深究瞭解。 故經(jīng)過(guò)第一階段篩選後，若無(wú)干擾作用產(chǎn)生，則歸類(lèi)至保留類(lèi)(Hold)；反之，進(jìn)入第二階段測(cè)試做更進(jìn)一步測(cè)試工作。體外試驗(yàn)提供快速、便宜的篩選方法，包括有 體外試驗(yàn)提供快速、便宜的篩選方法，包括有 (一) 雌性激素受體鍵結(jié)效應(yīng)及指標(biāo)性基因測(cè)試(an estrogen receptor binding or reporter gene assay) ；是以穩(wěn)定或短暫之基因轉(zhuǎn)染方法(stable or transient transfection)，將一指標(biāo)基因(repor

9、ter gene)，例如螢光酵素luciferase (Vit-Luc)的表現(xiàn)基因，殖入乳腺癌細(xì)胞(MCF-7或T47D)內(nèi)，若在雌性激素或雌性激素干擾物質(zhì)存在環(huán)境下，指標(biāo)基因之蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄機(jī)制因受雌激素所調(diào)控而被活化，轉(zhuǎn)錄之蛋白質(zhì)螢光酵素luciferase可加以定量；利用與人造荷爾蒙(DES)或雌性素(estradiol)測(cè)試的反應(yīng)，量化此物質(zhì)的雌性素活性。全部之測(cè)試時(shí)程約為2天。(二) 雄性激素受體鍵結(jié)效應(yīng)及指標(biāo)性基因測(cè)試(an androgen receptor binding or reporter gene assay) ，在4下將去勢(shì)的老鼠的生殖組織(如附睪、攝護(hù)腺等)中，分離出雄

10、性素接受器(androgen receptor)，將其以放射性同位素標(biāo)識(shí)，最後利用代測(cè)物與雄性接受器相對(duì)鍵結(jié)親合力(relative binding affinity, RBA)來(lái)推估其雄性素活性；另一種雄性素活性篩選方法則為雄性素轉(zhuǎn)錄活化分析研發(fā)中尚未普及。(三) 睪丸剁碎勻漿培養(yǎng)之類(lèi)固醇增生效應(yīng)(a steroidogenesis assay with minced testis)；此方法不僅可以評(píng)估哺乳類(lèi)，其他如魚(yú)類(lèi)、爬蟲(chóng)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)及兩棲類(lèi)均可。從睪丸組織中分離出萊狄氏細(xì)胞(一種間質(zhì)細(xì)胞，可合成睪固酮)進(jìn)行培養(yǎng)，物質(zhì)若具干擾活性，則經(jīng)由抑制P450酵素而影響固醇基因的表現(xiàn)?；铙w內(nèi)試驗(yàn)則包括

11、：(一) 為期三天之鼠體子宮增生試驗(yàn)(a rodent 3-day uterotrophic assay)；可篩選出具雌性素活性的化學(xué)物質(zhì)，它是由經(jīng)濟(jì)合作發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)與美國(guó)環(huán)保署共同建立，活體內(nèi)之雌鼠子宮增生測(cè)試，迄今最準(zhǔn)確之雌性激素篩檢測(cè)試法之一，它可檢測(cè)出化學(xué)物質(zhì)對(duì)鼠子宮反應(yīng)雌性素抑制或刺激的能力，篩選程序固定，此方法已進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室之間的驗(yàn)證步驟。實(shí)驗(yàn)方式是以未成熟的雌幼鼠或經(jīng)卵巢摘除之雌成鼠作為測(cè)試之實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，待測(cè)物以口服或注射方式進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)。實(shí)驗(yàn)之時(shí)程為 1 - 3

12、天，最後一次餵飼或注射試驗(yàn)後於6至24小時(shí)解剖。雌性激素效應(yīng)可由測(cè)定控制組與實(shí)驗(yàn)組之子宮的脂肪、乾重或濕重確認(rèn)。待測(cè)化學(xué)物質(zhì)，可經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)代謝，確切評(píng)估對(duì)雌性激素合成酵素 (aromatase)的影響，而對(duì)其他內(nèi)分泌腺體 (例如hypothalamic-pituitary axis)之作用亦可被檢測(cè)出。實(shí)驗(yàn)所得之血液及其他器官，亦可作為其他活體外檢測(cè)雌性激素效應(yīng)方法之檢體。(二) 為期二十天之青春期雌鼠甲狀腺試驗(yàn)(a rodent 20-day pubertal female assay with enhanced thyroid endpoints)；以剛斷奶的21天小母鼠每天口服(強(qiáng)餵

13、飼)待測(cè)物質(zhì)，記錄其第一次發(fā)情期、動(dòng)情期週期及陰道開(kāi)始開(kāi)口(Vaginal opening)的年齡，最後解剖量測(cè)卵巢重量。(三) 鼠體Hershber分析試驗(yàn)(a rodent 5 to 7-day Hershberger assay)；去勢(shì)的雄老鼠其第二次性徵攝護(hù)腺及儲(chǔ)精囊，成長(zhǎng)或維持其大小，須靠用雄性素，睪固酮及dihydrotestosterone DHT。本方法以去勢(shì)的雄老鼠餵飼5-7天的睪固酮與待測(cè)物混合物，最後檢測(cè)其攝護(hù)腺及儲(chǔ)精囊的重量，以觀察待測(cè)物是否抑制雄性素(睪固酮) ，另一組試驗(yàn)則僅餵飼去勢(shì)雄老鼠待測(cè)物，最後檢測(cè)其攝護(hù)腺及儲(chǔ)精囊的重量，若增加或維持不變，則具雄性素活性。(四

14、) 青蛙成長(zhǎng)過(guò)程期間之型態(tài)變化測(cè)試(a frog metamorphosis assay) ；經(jīng)暴露於待測(cè)物超過(guò)14天的幼生(蝌蚪)期非洲青蛙(African clawed frog, Xenopus laevis) ，以電腦輔助的攝影器材，定量蝌蚪轉(zhuǎn)化為青蛙時(shí)，尾巴吸收的速度，若待測(cè)物具甲狀腺活性，加速尾巴吸收，反之，待測(cè)物抑制甲狀腺素。(五) 魚(yú)性腺再現(xiàn)分析(a fish gonadal reproductive screening assay)；魚(yú)類(lèi)的荷爾蒙結(jié)構(gòu)、雌性素接受器形狀及功能有別於哺乳類(lèi)(如哺乳類(lèi)的睪固酮testosterone，魚(yú)類(lèi)則為11-ketotestosterone)

15、，類(lèi)固醇接受器與肝臟分泌的卵黃前質(zhì)也僅產(chǎn)卵動(dòng)物所特有。故須針對(duì)魚(yú)類(lèi)作內(nèi)分泌干擾試驗(yàn)。此試驗(yàn)設(shè)計(jì)用來(lái)篩選待測(cè)物雄性素與雌性素活性。觀察成熟雌魚(yú)及雄魚(yú)不正常的存活率、生殖行為、第二性徵、生殖指數(shù)(gonadosomatic index, GSI) 、產(chǎn)卵數(shù)目、受精率、孵化率、子代存活率等。第二階段為進(jìn)階測(cè)試方法，評(píng)估內(nèi)分泌干擾物質(zhì)可能作用途徑及劑量反應(yīng)。為達(dá)完善評(píng)估。試驗(yàn)設(shè)計(jì)通常包含試驗(yàn)動(dòng)物生命週期的關(guān)鍵時(shí)刻及過(guò)程，也使用較廣泛劑量進(jìn)行測(cè)試，並且對(duì)於劑量(進(jìn)入體內(nèi)的量)與暴露(實(shí)驗(yàn)環(huán)境中所測(cè)試的量)作明顯區(qū)分，以提供健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估參考之依據(jù)。此階段測(cè)試須耗費(fèi)長(zhǎng)期時(shí)間觀察及人力，最後均須犧牲許多研究生

16、物的生命，才能完成測(cè)試評(píng)估。本階段試驗(yàn)許包括多種生物，哺乳類(lèi)及其他生物試驗(yàn)以求完善評(píng)估：哺乳類(lèi)動(dòng)物試驗(yàn)：哺乳類(lèi)二代間生育繁殖系統(tǒng)毒性測(cè)試(two-generation mannalian reproductive toxicity study)；此方法透過(guò)觀察老鼠親代與子代之間，評(píng)估待測(cè)物對(duì)親代老鼠生殖功能、動(dòng)情期的週期、求偶行為、受精率、懷孕至分娩，而子代哺乳、斷奶及最後能存活至成鼠且具生殖功能的影響。 其他生物多代試驗(yàn)(一) 鳥(niǎo)類(lèi)生育繁衍影響測(cè)試(鵪鶉與野鴨) (avian reproductuvion with bobwhite quail and mallard)；以鳥(niǎo)類(lèi)作為觀察對(duì)象，

17、而鵪鶉與北方野鴨為此方法常用的研究對(duì)象。由成鳥(niǎo)開(kāi)始暴露於具待測(cè)物的環(huán)境中，經(jīng)產(chǎn)卵、孵化、子代的出生，爾後子代繼續(xù)暴露，成長(zhǎng)，最後又成熟產(chǎn)卵。在這二代之間除詳實(shí)記錄內(nèi)分泌干擾活性相關(guān)資料如產(chǎn)卵量、破壞卵量、卵殼厚度、胚胎存活率及小鳥(niǎo)14天存活率外，攸關(guān)其它荷爾蒙觀察指標(biāo)如重要器官(包括腦)重量、腺體重、骨骼發(fā)育、腳及翅膀長(zhǎng)度、各器官與骨的比值、骨骼的X-光片、病理、功能測(cè)試及子代生育能力等資料均須一併記錄。(二) 魚(yú)類(lèi)生命周期測(cè)試(鰷魚(yú)) (fish life cycle, fathead minnow) ；在演化過(guò)程中，魚(yú)類(lèi)在脊椎動(dòng)物中與哺乳類(lèi)關(guān)係最遠(yuǎn)，生殖策略上從卵生、卵胎生至胎生都有，內(nèi)分

18、泌干擾物質(zhì)對(duì)不同科別的魚(yú)可能就有很大差異，還有地理因素須考慮。淡水魚(yú)-鰷魚(yú)(fathead minnow, Pimephales promelas)從受精、發(fā)育、成熟、生殖至子代發(fā)育須約花300天的暴露評(píng)估。至於海水魚(yú)的評(píng)估試驗(yàn)有些科學(xué)家朝向以鮭魚(yú)(salmon)作試驗(yàn)對(duì)象發(fā)展。鰷魚(yú)試驗(yàn)一開(kāi)始，須使用200個(gè)受精卵，分置於8個(gè)培養(yǎng)缸中進(jìn)行暴露，至孵化、幼魚(yú)、成熟後，將一隻雄魚(yú)與二隻雌魚(yú)各別圈養(yǎng)，當(dāng)受精產(chǎn)卵後移走成魚(yú)，完成待測(cè)物的單一濃度試驗(yàn)。但此試驗(yàn)除須有控制組的考量下，每一種待測(cè)物須進(jìn)行五種濃度測(cè)試。(三) 糠蝦生活史(Americamysis) (Msyid life cycle, Americamysis) ；無(wú)脊椎動(dòng)物(特別是節(jié)肢動(dòng)物如昆蟲(chóng)、蝦、蟹等)佔(zhàn)全球生物極大部份，相反地，卻很相當(dāng)少的無(wú)脊椎動(dòng)物作為例行性檢測(cè)的試驗(yàn)材料。兩種比較常用來(lái)進(jìn)行毒性測(cè)試的無(wú)脊椎動(dòng)物，均為甲殼類(lèi)；海水方面以糠蝦(Mysidacea目)，淡水則用水蚤(Daphnia megma or Daphnia pulex) ，前者雌雄異體，後者生活史中以孤雌生殖為主。雖然水蚤也有有性生殖，但一般標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試僅限孤雌生殖的水蚤進(jìn)行。這兩種甲殼類(lèi)雖採(cǎi)不同的生殖策略，但有共同的生理，如蛻殼素是主要調(diào)控生