GB∕T 19427-2022 蜂膠中12種酚類化合物含量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜法

?犐犆犛６５．１４０犆犆犛犅４７

中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準

犌犅／犜１９４２７—２０２

代替犌犅／犜１９４２７—２０３

蜂膠中１２種酚類化合物含量的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜法

犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳１２狆犺犲狀狅犾犻犮犮狅犿狆狅狌狀犱狊犻狀狆狉狅狆狅犾犻狊—犎犘犔犆犕犛／犕犛犿犲狋犺狅犱犪狀犱犎犘犔犆犿犲狋犺狅犱

２０２０３０９發(fā)布 ２０２１００１實施

發(fā)布

國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會

犌犅／犜１９４２７—２０２

前 言

本文件按照ＧＢ／Ｔ１．１—２０２０《標準化工作導則第１部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。

本文件代替ＧＢ／Ｔ１９４２７—２０３《蜂膠中蘆丁、楊梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松屬素、苛因、高良姜素含量的測定方法液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測法和液相色譜紫外檢測法》，與ＧＢ／Ｔ１９４２７—２０３相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性修改外，主要技術(shù)變化如下：

ａ）增加了咖啡酸、狆香豆酸、阿魏酸、短葉松素３乙酸酯、綠原酸、阿替匹林Ｃ檢測項目（見第１章、５．１、７．２）；

ｂ）刪除了蘆丁、楊梅酮檢測項目（見２０３年版的第１章，４．４、４．５、４．６、６．２）；

ｃ）更改了蜂膠樣品提取條件（見７．１，２０３年版的６．１）。本文件由中華全國供銷合作總社提出。

本文件由全國蜂產(chǎn)品標準化工作組（ＳＡＣ／ＳＷＧ２）歸口。

本文件起草單位：秦皇島海關(guān)技術(shù)中心、浙江大學、廈門思健生物科技有限公司。

本文件主要起草人：李學民、胡福良、崔宗巖、張翠平、李響、楊志偉、曹翠玲、劉曉茂、賈光群、張進杰、曹彥忠、顏鑒翔。

本文件所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：

——ＧＢ／Ｔ１９４２７—２０３。

Ⅰ

庫七七標準下載

蜂膠中１２種酚類化合物含量的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜法

１范圍

本文件描述了蜂膠中咖啡酸、狆香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松屬素、柯因、高良姜素、短葉松素３乙酸酯、綠原酸、阿替匹林Ｃ含量測定的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜法。

本文件適用于蜂膠中咖啡酸、狆香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松屬素、柯因、高良姜素、短葉松素３乙酸酯、綠原酸、阿替匹林Ｃ含量的測定。

２規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

ＧＢ／Ｔ６８２分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

３術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

４原理

蜂膠試樣用８５％乙醇水溶液提取，超聲、離心、過濾和定容后，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定或配有紫外檢測器的液相色譜儀測定，外標法定量。

５試劑和材料

除另有說明外，所用試劑均為分析純，水為ＧＢ／Ｔ６８２規(guī)定的一級水。

５．１乙醇：無水乙醇。

５．２甲醇：色譜純。５．３甲酸：色譜純。５．４乙酸：色譜純。

５．５乙醇水溶液（８５＋１５）：準確移?。福担恚桃掖迹ǎ担保┲粒保埃恚倘萘科恐?，用水定容。

５．６甲醇水溶液（８０＋２０）：準確移?。福埃恚碳状迹ǎ担玻┲粒保埃恚倘萘科恐校盟ㄈ?。

５．７甲醇０．１％甲酸水溶液（５０＋５０）：準確移取５０ｍＬ甲醇（５．２）以及０．１ｍＬ甲酸（５．３）至１０ｍＬ容量瓶中，用水定容。

５．８０．１％甲酸水溶液：準確移?。保埃恚碳姿幔ǎ担常┲粒保埃埃恚倘萘科恐校盟ㄈ?。

５．９０．１％甲酸甲醇溶液：準確移取１．０ｍＬ甲酸（５．３）至１００ｍＬ容量瓶中，用甲醇（５．２）定容。

５．１０１．０％乙酸水溶液：準確移?。保埃恚桃宜幔ǎ担矗┲粒保埃埃恚倘萘科恐校盟ㄈ?。

１

犌犅／犜１９４２７—２０２

５．１標準物質(zhì)：綠原酸（ＣＡＳ號：３２７９７９）、咖啡酸（ＣＡＳ號：３１３９５）、狆香豆酸（ＣＡＳ號：５０１９８４）、阿魏酸（ＣＡＳ號：１３５２４６）、槲皮素（ＣＡＳ號：１７３９５）、莰菲醇（ＣＡＳ號：５２０１８３）、芹菜素（ＣＡＳ號：５２０３６５）、松屬素（ＣＡＳ號：４８０３９７）、短葉松素３乙酸酯（ＣＡＳ號：５２１７６９８）、柯因（ＣＡＳ號：４８０４００）、高良姜素（ＣＡＳ號：５４８８３４）和阿替匹林Ｃ（ＣＡＳ號：７２９４１９５），純度均不低于９８％。

５．１２標準儲備液：準確稱取適量的標準物質(zhì)（５．１），分別用甲醇（５．２）制備濃度為１．０ｍｇ／ｍＬ的標準

儲備液，該儲備液在－１８℃及以下溫度可穩(wěn)定保存６個月。

５．１３標準工作溶液：移取適量的標準儲備液（５．１２），用甲醇０．１％甲酸水溶液（５．７）稀釋成濃度為０．０２μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ的混合標準工作溶液，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測使用；移取適量的標準儲備液（５．１２），用甲醇水溶液（５．６）分別稀釋成濃度為１．０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬ、５．０μｇ／ｍＬ、１０．０μｇ／ｍＬ、２０．０μｇ／ｍＬ、５０．０μｇ／ｍＬ的混合標準工作溶液，供液相色譜紫外檢測法檢測使用。

６儀器和設(shè)備

６．１液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源。６．２液相色譜儀：配有紫外（或二極管陣列）檢測器。６．３分析天平：感量０．０１ｍｇ和０．０１ｇ。

６．４超聲波清洗儀。

６．５離心機：轉(zhuǎn)速不低于４００ｒ／ｍｉｎ。

６．６微量可調(diào)移液器：量程分別為１０μＬ～１０μＬ和０．１ｍＬ～１ｍＬ。

６．７微孔濾膜：０．２μｍ。

７分析步驟

７．１試樣的制備與處理

７．１．１試樣的制備

取混合均勻的代表性蜂膠樣品約１０ｇ，密封，并做標記。在樣品測定前，將被測樣品放入１０℃以下冰箱中保持２ｈ后，取出２０ｇ～３０ｇ，迅速用粉碎機粉碎，過孔徑約為２ｍｍ（１０目）的篩，冷藏保存于冰箱中作為待測試樣。

７．１．２試樣的處理

稱取０．５ｇ（精確至０．０１ｇ）試樣于５０ｍＬ塑料離心管中，加１５ｍＬ乙醇水溶液（５．５），在室溫超聲提?。玻埃恚椋睿冢矗埃埃颍恚椋钕码x心１０ｍｉｎ，上清液轉(zhuǎn)入５０ｍＬ容量瓶中，按照上述步驟重復提取離心２次，合并上清液，用乙醇水溶液（５．５）定容至５０ｍＬ，混勻。取上述樣品溶液用甲醇水溶液（５．６）適當稀釋并混勻后，取部分溶液過０．２μｍ微孔濾膜（６．７）至樣品瓶中，供液相色譜儀（６．２）測定；或取上述樣品溶液用甲醇０．１％甲酸水溶液（５．７）適當稀釋后，過０．２μｍ微孔濾膜（６．７）至樣品瓶中，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（６．１）測定。

７．２測定

７．２．１液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜參考條件

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀的液相色譜參考條件如下：

ａ）色譜柱：Ｃ１８，１０ｍｍ×２．１ｍｍ；１．７μｍ或相當者；

２

庫七七標準下載

犌犅／犜１９４２７—２０２

ｂ）流動相Ａ：０．１％甲酸水溶液（５．８）；

ｃ）流動相Ｂ：０．１％甲酸甲醇溶液（５．９），梯度洗脫條件參見附錄Ａ的表Ａ．１；ｄ）流速：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ；

ｅ）柱溫：３０℃；

ｆ）進樣體積：２μＬ。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀的質(zhì)譜參考條件如下：

ａ）掃描方式：正負離子掃描；

ｂ）檢測方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測（ＭＲＭ）；ｃ）電噴霧電壓：＋５５０Ｖ／－４５０Ｖ；ｄ）霧化氣體氣壓：０．３４５ＭＰａ；

ｅ）氣簾氣壓：０．１７２ＭＰａ；

ｆ）離子源溫度：５０℃；

ｇ）去簇電壓：＋１０Ｖ／－１０Ｖ；

ｈ）定量離子對、定性離子對和碰撞能量：參見表１。

７．２．２液相色譜參考條件

液相色譜儀（６．２）的參考條件如下：

ａ）色譜柱：Ｃ１８，１５０ｍｍ×４．６ｍｍ；３．０μｍ或相當者；ｂ）流動相Ａ：１．０％乙酸水溶液（５．１０）；

ｃ）流動相Ｂ：甲醇（５．２），梯度洗脫條件參見表Ａ．２；ｄ）流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；

ｅ）柱溫：３５℃；

ｆ）進樣體積：５μＬ；

ｇ）檢測波長：１２種酚類化合物的定量檢測波長參見表１。

表１犎犘犔犆犕犛／犕犛離子化模式、定量離子對、定性離子對、碰撞能量及犎犘犔犆犝犞檢測波長

化合物

離子化模式

定量離子對

（犿／狕）

定性離子對

（犿／狕）

碰撞能量／Ｖ

ＨＰＬＣＵＶ檢測波長／ｎｍ

綠原酸

負離子（－）

３５２．９／１９０．９

３５２．９／８５．０

２０／５２

３１０

咖啡酸

負離子（－）

１７８．８／１３４．９

１７８．８／１３．９

２０／３２

３１０

狆香豆酸

負離子（－）

１６２．８／１８．９

１６２．８／９２．９

２０／４０

３１０

阿魏酸

負離子（－）

１９２．８／１３．９

１９２．８／１７．９

２／１８

３１０

槲皮素

負離子（－）

３０．８／１５０．９

３０．８／１７８．８

２８／２４

３５０

莰菲醇

正離子（＋）

２８７．０／１５３．０

２８７．０／６８．９

４１／７９

３５０

芹菜素

負離子（－）

２６８．９／１６．９

２６８．９／１５０．９

３８／３２

３５０

松屬素

正離子（＋）

２５７．０／１５３．０

２５７．０／１３１．０

３５／４０

２８０

短葉松素３乙酸酯

負離子（－）

３１２．７／２５３．０

３１２．７／２７１．０

２８／２６

２８０

柯因

正離子（＋）

２５．０／１５３．０

２５．０／７．０

４５／８３

２８０

高良姜素

正離子（＋）

２７１．０／１５３．０

２７１．０／７．０

４１／７３

２８０

阿替匹林Ｃ

負離子（－）

２９．０／２５．０

２９．０／２０．０

２４／２８

３１５

３

庫七七標準下載

犌犅／犜１９４２７—２０２

７．２．３定性與定量測定

７．２．３．１液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

按７．２．１中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析條件，分別測定樣品溶液和混合標準工作溶液（５．１３）。如果樣品溶液與標準工作溶液在相同的保留時間有峰出現(xiàn)（保留時間偏差不超過±２．５％），且在扣除背景后的樣品譜圖中，所選擇離子全部出現(xiàn)，其離子的豐度與標準物質(zhì)對應(yīng)的離子豐度一致，相對離子豐度偏差不超過表２的規(guī)定范圍，可判定樣品中存在被測物。以標準工作溶液濃度為橫坐標，以１２種酚類化合物定量離子峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線。樣品溶液中１２種酚類化合物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器測定的線性范圍內(nèi)。１２種酚類化合物的多反應(yīng)監(jiān)測（ＭＲＭ）色譜圖和保留時間參見附錄Ｂ的圖Ｂ．１。

表２定性測定中相對離子豐度的最大允許偏差

相對離子豐度

＞５０％

＞２０％～５０％

＞１０％～２０％

≤１０％

允許相對偏差

±２０％

±２５％

±３０％

±５０％

７．２．３．２液相色譜法

按７．２．２中液相色譜分析條件，分別測定樣品溶液和混合標準工作溶液。如果樣品溶液與混合標準工作溶液在相同的保留時間有峰出現(xiàn)（保留時間偏差不超過±２．５％），可判定樣品中存在被測物。以標準工作溶液濃度為橫坐標，以定量檢測波長下１２種酚類化合物峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線。樣品溶液中１２種酚類化合物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器測定的線性范圍內(nèi)。１２種酚類化合物標準物質(zhì)的色譜圖和保留時間參見圖Ｂ．２。

７．３平行試驗

同一樣品應(yīng)按照７．１和７．２進行平行測試。

７．４空白試驗

不稱取試樣，其余均按照７．１和７．２進行。

８結(jié)果計算

某一種酚類化合物在試樣中的含量用色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)或用式（１）計算：

庫七七標準下載

犡＝犮×犞× １００

…………（１）

式中：

犿 １００×１００

犡——試樣中酚類化合物含量，單位為克每千克（ｇ／ｋｇ）；

犮——從標準工作曲線得到的試樣溶液中各目標物質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；

犞——試樣溶液定容體積，單位為毫升（ｍＬ）；

犿——最終試樣溶液所代表的試樣質(zhì)量，單位為克（ｇ）。

計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

９定量限

４本文件液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的定量限：綠原酸、咖啡酸、狆香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰菲醇、芹菜

犌犅／犜１９４２７—２０２

素、松屬素、短葉松素３乙酸酯、柯因、高良姜素和阿替匹林Ｃ均為０．０２μｇ／ｍＬ；按照１∶１０００稀釋倍數(shù)計算，方法對于實際樣品中綠原酸、咖啡酸、狆香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松屬素、短葉松素３乙酸酯、柯因、高良姜素、阿替匹林Ｃ定量限均為０．２０ｇ／ｋｇ。

本文件液相色譜法的定量限：綠原酸、咖啡酸、狆香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松屬素、短葉松素３乙酸酯、柯因、高良姜素、阿替匹林Ｃ均為１．０μｇ／ｍＬ；按照１∶１０稀釋倍數(shù)計算，方法對于實際樣品中綠原酸、咖啡酸、狆香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松屬素、短葉松素３乙酸酯、柯因、高良姜素、阿替匹林Ｃ定量限均為０．１０ｇ／ｋｇ。

１０精密度

平行試驗兩次測定的絕對差值不超過其算術(shù)平均值的１０％。

５

庫七七標準下載

犌犅／犜１９４２７—２０２

附 錄犃

（資料性）

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜紫外檢測法梯度洗脫條件

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜紫外檢測法的梯度洗脫條件分別見表Ａ．１和表Ａ．２。

表犃．１液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法梯度洗脫條件

時間／ｍｉｎ

流動相Ａ：０．１％甲酸水溶液／

％

流動相Ｂ：０．１％甲酸甲醇溶液／

％

１．０

８５

１５

１．５０

７０

３０

３．０

７０

３０

３．５０

６０

４０

５．０

６０

４０

５．５０

４０

６０

６．５０

４０

６０

７．０

３０

７０

８．０

２０

８０

８．５０

０

１０

１０．５０

０

１０

１．５０

８５

１５

１６．０

８５

１５

表犃．２液相色譜法梯度洗脫條件

時間／ｍｉｎ

流動相Ａ：１．０％乙酸水溶液／

％

流動相Ｂ：甲醇／

％

８．０

７０

３０

１２．０

５０

５０

２０．０

５０

５０

２５．０

４０

６０

３５．０

２５

７５

４５．０

０

１０

５０．０

７０

３０

６０．０

７０

３０

６

庫七七標準下載

犌犅／犜１９４２７—２０２

附 錄犅

（資料性）

１２種酚類化合物標準的多離子反應(yīng)監(jiān)測（犕犚犕）色譜圖和犎犘犔犞犝犞色譜圖

１２種酚類化合物標準的多離子反應(yīng)監(jiān)測（ＭＲＭ）色譜圖和ＨＰＬＶＵＶ色譜圖分別見圖Ｂ．１和圖Ｂ．２。

犪）綠原酸定量離子對色譜圖 犫）綠原酸定性離子對色譜圖

犮）咖啡酸定量離子對色譜圖 犱）咖啡酸定性離子對色譜圖

犲）狆香豆酸定量離子對色譜圖 犳）狆香豆酸定性離子對色譜圖

犵）阿魏酸定量離子對色譜圖 犺）阿魏酸定性離子對色譜圖

圖犅．１１２種酚類化合物