偽狂犬病檢測方法參考模板

1、十一、偽狂犬病檢測方法偽狂犬病病毒分離鑒定1 材料準備 DMEM培養(yǎng)基、BHK-21細胞、新生犢牛血清、青霉素、鏈霉素溶液、0.22ul微孔濾膜、細胞培養(yǎng)瓶、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡。溶液配制見附錄A(標準的附錄)2 操作步驟2.1 病料的采集 對于剛死亡或活體送檢并處死的動物，無菌采取肝、脾、肺、腎及其腦組織，尤其是三叉神經節(jié)、嗅球， 4送實驗室檢測。2.2 樣品處理 待檢組織在滅菌乳缽內剪碎，加入滅菌玻璃砂研磨，用滅菌生理鹽水或DME培養(yǎng)基制成1：5乳劑，70反復凍融后，經3000rpm離心30分鐘后，取上清液經0.22m微孔濾膜過濾后，加入青鏈霉素溶液至最終濃度為100U/mL，70保存

2、作為接種材料。2.3 病料接種 將病料濾液接種已長成單層的BHK-21細胞，接種量為培養(yǎng)基量的10%，37恒溫箱中吸附1小時后，加入含10%新生犢牛血清（經過56水浴滅活30分鐘，過濾除菌，無支原體）的DMEM培養(yǎng)基，置37溫箱中培養(yǎng)。2.4 觀察結果 接種后2448小時，BHK-21細胞應出現(xiàn)典型的細胞病變效應（Cyto pathogenic effect, CPE），表現(xiàn)為細胞變圓，脫落。如第一次接種不出現(xiàn)CPE，應將細胞培養(yǎng)物凍融后盲傳三代，如仍無CPE，則判為偽狂犬病病毒陰性。2.5 病毒的鑒定 將出現(xiàn)CPE的細胞培養(yǎng)物反復凍融后，用聚合酶鏈式反應、熒光抗體試驗等兩種方法中任一方法作進

3、一步鑒定。偽狂犬病聚合酶鏈式反應1 材料準備:待檢組織、組織勻漿器、蛋白酶K，十二烷基磺酸鈉（SDS），苯酚、氯仿，異戊醇（分析純）、TEN緩沖液。溶液配制見附錄C(標準的附錄)引物：擴增偽狂犬病病毒基因中434651bp之間217bp基因片段，由上海生物工程公司合成。序列為，上游引物P1：5-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3，下游引物P2：5-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3 儀器設備有：凝膠電泳紫外線檢測儀， PCR擴增儀，電泳儀2操作步驟：21 樣品的采集：對于病死或撲殺動物，取腦組織；對于待檢活豬，用已滅菌的棉簽，伸入豬鼻腔中，采取鼻粘液，即為鼻拭子，冷藏條

4、件送實驗室檢測。2.2 樣品處理 所采病料經組織研磨器充分研磨，按1:5用TEN緩沖液懸浮收集于離心管內，-70反復凍融3次，7000r/min離心5min，如樣品為鼻試子，則加入2ml TEN緩沖液，充分擠壓，取出棉簽，7000rpm，離心5分鐘，取上清液。取上清液472.5l,加入25l 10SDS和2.5l的20mg/ml 蛋白酶K，50水浴搖床上放置2h后加入等量的飽和酚500l，渦旋20s。離心取上清液，加等量的酚：氯仿：異戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：異戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20l雙蒸水溶解，-20貯存?zhèn)溆谩?.3. PCR的操作程序

5、先將制備的模板DNA置100水浴10分鐘作變性處理，然后立即放于冰浴中。PCR反應體系為：總體積25l，含有50m mol/L KCl,10m mol/L Tris-HCl（pH 9.0），0.1Triton X-100，100mol/L dNTPs，0.35mol/L引物，2 m mol/L MgCl2，及0.5U Taq酶，1l模板DNA。常用的反應體系組成如下 10×緩沖液 2.5 l 15mM MgCl2 2.5 l dNTPs 2.0 l 引物 各2.0l Taq聚合酶 1.0l DNA模板 2.0l 滅菌去離子水 11.0l 礦物油 約 20l 擴増條件為:94變性3分鐘

6、，進入循環(huán)，9460秒，6560秒，7260秒，40個循環(huán)后72延伸5分鐘。2.4 PCR產物的檢測 PCR擴增產物在1的瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，在紫外光下觀察結果。為進一步進行PCR擴增產物的特異性鑒定，可取PCR產物用SalI酶切，酶切產物在2瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外光下觀察并與標準分子量比較，可見產生的140bp和77bp兩個片段。偽狂犬病熒光抗體試驗1材料準備：碳酸鹽緩沖甘油、磷酸鹽緩沖液、丙酮（分析純），偽狂犬病熒光抗體、冰凍切片機，熒光顯微鏡。溶液配制見附錄D(標準的附錄)2操作步驟21樣品采集 撲殺可疑動物，取大腦、淋巴結、扁桃體迅速送檢實驗室，如不能及時送出，

7、必須凍結保存，避免腐敗、自溶。本法也可用于對疑似偽狂犬病病毒的培養(yǎng)物進行鑒定。22 切片制備 將樣品組織塊切成1cm×1cm的面，不經任何固定處理，直接貼于冰凍切片托上，進行切片，切片厚度要求57um，將切片展貼于0.8mm×1mm厚的潔凈載玻片上。23固定：將切片置純丙酮中固定15分鐘，取出立即放入0.01mol/L，pH7.2的磷酸鹽緩沖液中，輕輕漂洗34次，取出，自然干燥后盡快進行熒光抗體染色。24 染色 將偽狂犬病熒光抗體滴加于切片表面，置溫盒內于37作用30分鐘，取出后放入磷酸鹽緩沖液中充分漂洗，再用0.5moL/L，pH9.09.5碳酸鹽緩沖甘油封固蓋片（0.1

8、mm厚），染色后應盡快鏡檢，必要時可放置低溫待檢。25 觀察 將染色后的切片標本置激發(fā)光為藍紫光或紫外光的熒光顯微鏡下觀察。26判定：于熒光顯微鏡視野中，見細胞中出現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，判為偽狂犬病病毒感染陽性。偽狂犬病微量中和試驗（固定病毒，稀釋血清法）1 材料準備0. 25%胰酶（配制見附錄B）、BHK-21細胞,多道可調微量移液器, ,96孔細胞培養(yǎng)板,CO2培養(yǎng)箱, 倒置顯微鏡。2 操作步驟2.1 病毒半數(shù)組織細胞感染量（TCID50）的測定：2.1.1 病毒培養(yǎng)和收獲 將偽狂犬病毒接種于長成單層的BHK-21細胞，接種量為液體培養(yǎng)基量的10%,37培養(yǎng)，待出現(xiàn)病變后，凍融，收獲病毒。2

9、.1.2 病毒的滴定 用DMEM培養(yǎng)基將偽狂犬病病毒作連續(xù)10倍稀釋，即101、102每個稀釋度取100L加入96孔細胞培養(yǎng)板中，隨后加入經0.25%胰酶消化的BHK-21細胞100L（細胞含量以105/mL左右 為宜），每個稀釋度作8個重復，并設空白細胞培養(yǎng)對照。置37 5%CO2培養(yǎng)箱中。 2.1.3 TCID50計算 逐日觀察細胞病變，并記錄細胞病變孔數(shù)，直到對照細胞老化脫落為止。按照Reed-Muench法計算病毒的TCID50（具體的計算示例見附錄B）。2.2 中和試驗 將無菌采集的待檢豬血清置56水浴滅活30分鐘。用DMEM培養(yǎng)基作倍比稀釋，在細胞培養(yǎng)板各孔中加入50L培養(yǎng)基，隨后

10、在第一孔中加入經待檢豬血清50L混合后，用微量移液器取出50L，加到第二孔中，混勻后取出50L再加入第三孔中，依此類推。血清稀釋度即為1：2、1：4、1：8，每份待檢血清稀釋度作24個重復。將50L含200個TCID50的病毒液加入到不同稀釋度血清孔中，37作用1小時，每孔中再加入100L經胰酶消化分散的BHK-21細胞，同時設病毒對照、陽性血清、陰性血清，待檢血清、正常細胞對照。2.3計算抗體中和效價 逐日觀察，直至細胞對照出現(xiàn)老化脫落為止，按Reed-Muench兩氏法，計算抗體中和效價。如抗體效價為1：2及1：2以上，則判為偽狂犬病抗體陽性。偽狂犬病酶聯(lián)免疫吸附試驗（間接法）1材料準備：

11、抗原、酶標抗體，底物（OPDH2O2），酶聯(lián)免疫檢測儀；溶液配制見附錄F(標準的附錄)2 操作步驟：2.1 包被 將PRV抗原加入酶標板孔內，每孔100uL，37作用1h后置4冰箱過夜。2.2 洗滌 棄去孔內液體，用洗滌液洗3次，每次3min，用吸水紙拍干2.3 封閉 各孔加入封閉液100uL 37作用1h。按2.2步驟洗滌24 加入待檢血清 待檢血清經56oC30分鐘滅活將待檢血清用洗滌液稀釋，每孔100uL，37作用1h。重復2.2步驟。25 加入酶標抗體 用洗滌液將酶標抗體按工作濃度稀釋，每孔100uL，37作用1h。重復2.2步驟。26 加入底物（OPD-H22）：每孔100uL，室溫

12、避光顯色25分鐘。27 終止反應 每孔加入50uL終止液終止反應。28 測定OD值 在酶聯(lián)免疫檢測儀上490nm波長處讀數(shù)。29血清陰陽性判定標準的確定 取60份經中和試驗檢測為PRV抗體陰性的豬血清，按1:20稀釋后進行間接ELISA試驗，測定490nm波長處OD值，規(guī)定以60份血清的平均OD值加上3倍標準差作為判定陰陽性的臨界值。偽狂犬病乳膠凝集試驗1材料準備：偽狂犬病乳膠凝集抗原、偽狂犬病陽性血清、陰性血清、稀釋液，玻片，溶液配制見附錄E(標準的附錄)2操作步驟：21待檢血清不須經熱滅活或其它方式的滅活處理22將待檢血清用稀釋液作倍比稀釋后，各取15L與等量乳膠凝集抗原在潔凈干燥的玻片上

13、用竹簽攪拌充分混合，在35分鐘內觀察結果；可能出現(xiàn)以下幾種凝集結果，即： 100%凝集：混合液透亮，出現(xiàn)大的凝集塊 75%凝集：混合液幾乎透明，出現(xiàn)大的凝集塊 50%凝集：約50%乳膠凝集，凝集顆粒較細 25%凝集；混合液渾濁，有少量凝集顆粒 0%凝集：混合液渾濁，無凝集顆粒出現(xiàn) 如出現(xiàn)50%凝集程度以上的（含50%凝集程度），判為偽狂犬病抗體陽性，否則判為抗體陰性。如為陰性，可用微量中和試驗進一步檢測。偽狂犬病瓊脂擴散試驗1材料準備 瓊脂擴散抗原、陰性血清和陽性血清；優(yōu)質瓊脂粉、平皿2操作步驟21 0.8%瓊脂板的制作 將1克瓊脂粉溶于100毫升Tris鹽酸緩沖液(Tris 6.5克, Na

14、Cl 2.9克, NaN3 0.2克, 蒸餾水 1000毫升, 用HCl調pH值至7.2)中，趁熱傾倒于玻璃平皿上，厚度為23mm，待冷卻凝集后，打孔，中央一孔，周圍6孔，孔徑為2mm，周圍孔之間距離2mm，周圍孔與中央孔間距為4mm6mm，用酒精燈微熱封底。22加樣 將瓊脂擴散抗原加到中央孔中，周圍孔加經熱滅活的待檢血清，設陰性血清和陽性血清對照。置溫盒37作用，2448小時后觀察結果。23結果判定 在抗原孔與待檢血清孔之間出現(xiàn)白色沉淀線，抗體可判為陽性；如待檢血清抗體水平較低，可以觀察到與待檢血清相鄰的陽性血清沉淀線末端略向抗原抗彎曲。陰性血清與抗原孔之間則沒有沉淀線。偽狂犬病區(qū)分強弱毒感

15、染鑒別乳膠凝集試驗1豬偽狂犬病gG鑒別診斷乳膠凝集試驗偽狂犬病gG鑒別診斷乳膠凝集試驗是用偽狂犬病毒gG基因的基因工程表達產物致敏乳膠抗原來檢測動物血清、全血或乳汁中抗gG蛋白的抗體。用于偽狂犬病毒感染豬與gG基因缺失疫苗注苗豬的免疫學鑒別診斷。11材料準備：偽狂犬病毒gG蛋白致敏乳膠抗原、偽狂犬病毒致敏乳膠抗原、偽狂犬病毒陽性血清和注射gG基因缺失疫苗血清、玻片、吸頭等。12操作步驟121對照試驗 檢測之前應做對照試驗，出現(xiàn)如下結果試驗方可成立，否則應重試，如重試仍不出現(xiàn)如下結果則停止使用：偽狂犬病毒陽性血清加gG蛋白致敏乳膠抗原呈陽性凝集；注射gG基因缺失疫苗血清加gG蛋白致敏乳膠抗原呈陰

16、性凝集；偽狂犬病毒陽性血清與注射gG基因缺失疫苗血清加偽狂犬病毒致敏乳膠抗原均呈陽性凝集。122檢測試驗1221待檢血清不須經熱滅活或其它方式的滅活處理1222待檢血清一滴，置于玻片上。加gG蛋白致敏乳膠抗原一滴，用牙簽混勻，攪拌并搖動1-2分鐘，于3-5分鐘內觀察結果(注：gG蛋白致敏乳膠抗原與血清反應的凝集顆粒較細)；可能出現(xiàn)以下幾種凝集結果，即： “+”全部乳膠凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明； “+”大部分乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍混濁； “+”約一半乳膠凝集，但顆粒較細，液體較混濁； “+”有少許凝集，液體呈混濁； “”液滴呈原有的均勻乳狀。以出現(xiàn)“+”以上凝集者判為陽性凝集。2

17、豬偽狂犬病gE鑒別診斷乳膠凝集試驗偽狂犬病gE鑒別診斷乳膠凝集試驗是用偽狂犬病毒gE基因的基因工程表達產物致敏乳膠抗原來檢測動物血清、全血或乳汁中抗gE蛋白的抗體。用于偽狂犬病毒感染豬與gE基因缺失疫苗注苗豬的免疫學鑒別診斷。11材料準備：偽狂犬病毒gE蛋白致敏乳膠抗原、偽狂犬病毒致敏乳膠抗原、偽狂犬病毒陽性血清和注射gG基因缺失疫苗血清、玻片、吸頭等。12操作步驟121對照試驗 檢測之前應做對照試驗，出現(xiàn)如下結果試驗方可成立，否則應重試，如重試仍不出現(xiàn)如下結果則停止使用：偽狂犬病毒陽性血清加gE蛋白致敏乳膠抗原呈陽性凝集；注射gE基因缺失疫苗血清加gE蛋白致敏乳膠抗原呈陰性凝集；偽狂犬病毒陽

18、性血清與注射gE基因缺失疫苗血清加偽狂犬病毒致敏乳膠抗原均呈陽性凝集。122檢測試驗1221待檢血清不須經熱滅活或其它方式的滅活處理1222待檢血清一滴，置于玻片上。加gE蛋白致敏乳膠抗原一滴，用牙簽混勻，攪拌并搖動1-2分鐘，于3-5分鐘內觀察結果(注：gE蛋白致敏乳膠抗原與血清反應的凝集顆粒較細)；可能出現(xiàn)以下幾種凝集結果，即： “+”全部乳膠凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明； “+”大部分乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍混濁； “+”約一半乳膠凝集，但顆粒較細，液體較混濁； “+”有少許凝集，液體呈混濁； “”液滴呈原有的均勻乳狀。以出現(xiàn)“+”以上凝集者判為陽性凝集。偽狂犬病區(qū)分強弱毒感染

19、鑒別ELISA1偽狂犬病gG-ELISA鑒別診斷（間接法）偽狂犬病gG-ELISA鑒別診斷是用偽狂犬病毒gG基因的基因工程表達產物包被的ELISA板用來檢測動物血清中抗gG蛋白的抗體。用于偽狂犬病毒感染豬與gG基因缺失疫苗注苗豬的免疫學鑒別診斷。11材料準備：gG蛋白包被的ELISA板、酶標抗體，底物（OPDH2O2），酶聯(lián)免疫檢測儀；溶液配制見附錄F(標準的附錄)12 操作步驟：12.1加入待檢血清 待檢血清經56oC30分鐘滅活后用保溫液作40倍稀釋，每孔加入，37作用30min。12.2 洗滌 棄去孔內液體，每孔用200uL洗滌液洗3次，每次3min，用吸水紙拍干。12.3 加入酶標抗體

20、 用洗滌液將酶標抗體按工作濃度稀釋，每孔100uL，37作用30min,重復2.2步驟。 124 加入底物（OPD-H2O2）：每孔100uL，室溫避光顯色25分鐘。125 終止反應 每孔加入50uL終止液終止反應。 126 測定OD值 在酶聯(lián)免疫檢測儀上490nm波長處讀數(shù)。測定490nm波長處OD值，記為P值，陰性對照OD值記為N值，N值如小于0.1時，按0.1計算，大于0.1時為實際值。當陽性對照孔OD值陰性對照OD值大于0.25時，試驗成立。127結果判定：P/N2.1判為gG抗體陽性P/N1.9判為gG抗體陰性,1.9<P<N2.1,判為可疑2偽狂犬病gE-ELISA鑒別

21、診斷（間接法）偽狂犬病gE-ELISA鑒別診斷是用偽狂犬病毒gE基因的基因工程表達產物包被的ELISA板用來檢測動物血清中抗gE蛋白的抗體。用于偽狂犬病毒感染豬與gE基因缺失疫苗注苗豬的免疫學鑒別診斷。21材料準備：gE蛋白包被的ELISA板、酶標抗體，底物（OPDH2O2），酶聯(lián)免疫檢測儀；溶液配制見附錄F(標準的附錄)22 操作步驟：22.1加入待檢血清 待檢血清經56oC30分鐘滅活后用保溫液作40倍稀釋，每孔加入，37作用30min。22.2 洗滌 棄去孔內液體，每孔用200uL洗滌液洗3次，每次3min，用吸水紙拍干。22.3 加入酶標抗體 用洗滌液將酶標抗體按工作濃度稀釋，每孔10

22、0uL，37作用30min,重復2.2步驟。 224 加入底物（OPD-H2O2）：每孔100uL，室溫避光顯色25分鐘。225 終止反應 每孔加入50uL終止液終止反應。 226 測定OD值 在酶聯(lián)免疫檢測儀上490nm波長處讀數(shù)。測定490nm波長處OD值，記為P值，陰性對照OD值記為N值，N值如小于0.1時，按0.1計算，大于0.1時為實際值。當陽性對照孔OD值陰性對照OD值大于0.25時，試驗成立。227結果判定：P/N2.1判為gE抗體陽性P/N1.9判為gE抗體陰性1.9<P<N2.1,判為可疑偽狂犬病病毒血凝（HA）與血凝抑制（HI）試驗方法 （一）紅血球的制備：將小

23、白鼠尾尖剪斷，插入盛有滅菌的阿氏液的離心管的抽氣瓶中，負壓抽吸，采血完畢后，將離心管取出，用PBS洗滌3次，每次1 500轉/分鐘離心10分鐘，使用時加PBS配成0.1%的紅血球懸液。 （二）待測血清的預處理：取待測血清0.1毫升加PBS 0.3毫升，56滅活30分鐘，加入0.4毫升 25%白陶土25振蕩1小時，離心取上清液加入0.1毫升配好的0.1%紅血球懸液37作用1小時,離心除去紅血球,上清液作為1:8稀釋的血清用于HI試驗. （三） HA試驗操作:選用96孔V型板每孔加入PBS 50微升,在第一排孔的前6孔內加入50微升 PrV病毒液,后兩孔作為空白對照,用微量加樣器作倍比稀釋,從1:

24、2至1:1024,即將第一排孔病毒液混勻后吸出50微升至第二排孔均勻混合,再從第二排孔吸出50微升至第三排孔,依次類推至最后一排孔取50微升棄掉,每孔加入50微升 0.1%的紅血球，在振蕩器較微振蕩混合均勻，以一定的溫度作用2小時，觀察結果，以完全凝集紅血球的最大稀釋倍數(shù)作為一個血凝單位。 （四）HI試驗操作：在96孔V型板中每孔加入50微升 PBS液，然后在第一排孔的前6孔內加入50微升已處理的血清作為對照，用微量加樣器將血清倍比稀釋從1：2至1：1 024，然后各孔加入50微升用PBS稀釋好的4個血凝單位的病毒液，每孔分別加入50微升 0.1%紅血球懸液，混合均勻后室溫放置2小時，觀察結果

25、。(吳 斌 何啟蓋)進口偽狂犬病抗體檢測試劑盒（用于普查）一、 試劑 貯存在2-71 PRV包被酶標板 5塊2 抗豬辣根過氧化物酶（HRP）連結物（酶標抗體） 60ml3 PRV陽性對照血清 4ml4 PRV陰性對照血清 4ml5 樣品稀釋液 175ml6 洗滌液（10×） 250ml7 TMB底物 60ml8終止液 60ml二、樣品的準備用樣品稀釋液按1：20稀釋待檢血清。（如20ul樣品加380ul樣品稀釋液）。注意：陰、陽性對照不稀釋。每一樣品必須更換吸嘴，并記錄樣品在板上的位置，在樣品加到酶標孔內之前必須混合均勻。三、洗滌液的準備濃縮洗滌液（10×）應置室溫并搖動使

26、沉淀的鹽能充分溶解。在用之前，濃縮洗滌液（10×）應用蒸餾水或去離子水接1：10稀釋（如30ml濃縮洗滌液加 270ml蒸餾水或去離子水即可用于一塊板的洗滌）。四、試驗過程在使用之前所有試劑必須置室溫并輕輕搖動或渦旋。1取出酶標板并記錄樣品在板上的位置。2在A1、A2、A3孔內各加未稀釋的陰性對照100ul。3在A4、A5、A6孔內各加未稀釋的陽性對照100ul。4加100ul已稀釋的樣品（1：20）到相應的孔內，每一樣品應同時做2孔。5室溫作用30分鐘。6傾去孔內液體到廢液缸內。7每孔用近300ul的洗滌液洗3-5次，每次洗后傾去孔內的液體。在加酶標抗體之前應避免孔內干燥，最后一次

27、洗滌后應在吸水材料上拍干酶標板。8 在每一孔內加入100ul抗豬的酶標抗體。9 室溫作用30分鐘。10重復步驟6和7。11 在每一孔內加入TMB底物溶液100ul。12 室溫顯色15分鐘。13 每一孔內加入100ul終止劑以終止反應。14 空氣調零。15 在650nm測量并記錄樣品和對照的吸收值。16 計算結果。五、結果 陽性對照的平均值（PCX）與陰性對照的平均值（NCX）之差（P-N）大于或等于0.15時試驗方成立。而且陰性對照平均值（NCX）必須小于或等于0.15。如果試驗不成立，可能操作有誤，試驗應在熟悉產品說明書后重試。每一樣品內針對PRV抗體的有無是由樣品與陽性對照的比率（S/P）

28、來確定。陽性對照已標準化且有很高水平的PRV抗體。六、 結果的說明1 S/P比值小于0.4的樣品確定為PRV抗體陰性。2 S/P比值大于或等于0.4的樣品確定為PRV抗體陽性。在該試驗中定為陽性的樣品應再用“偽狂犬病抗體確認試劑盒”來進一步證明其陽性的真假。七、計算1 陰性對照平均值（NCX）的計算 A1A（650）+A2A（650）+A3A（650） 0.06+0.063+0.069NCX= 例如：=0.064 3 3 2 陽性對照平均值（PCX）的計算 A4A（650）+A5A（650）+A6A（650） 0.313+0.299+0.33NCX= 例如：=0.314 3 3 3 S/P比值

29、的計算 例如：某樣品平均值=0.350 Sample A（650）NCX 0.350-64 0.286S/P= S/P= = =1.14 PCXNCX 0.314-0.064 0.250（華中農大覃雅麗、唐勇譯）偽狂犬病gE抗體試劑盒（進口）一、試劑 貯存在2-71. PRV包被酶標板 6塊2. 抗 PRV-gE辣根過氧化物酶（HRP）連結物（酶標抗體） 60ml3. 陰性豬血清對照-不與PRV-gE 反應的豬血清 5ml4. 陽性對照血清-抗PRV-gE 5ml5. 樣品稀釋液 120ml6. 洗滌液（10×） 235ml7. TMB底物 60ml8. 8終止液 60ml二、樣品的準備用樣品稀釋液按1：2 的比例稀釋待檢血清。每一樣品必須更換吸嘴，樣品加到酶標孔內