耐膽鹽革蘭陰性菌+(2)

1、耐膽鹽革蘭陰性菌定量試驗A:許子康B:高蔚員C:楊婉婷D:方少斌目錄目錄工作計劃表01相關(guān)資料02操作過程及注意事項03取樣指令及備料單04供試品05革蘭氏染色06序號序號日期日期內(nèi)容內(nèi)容負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)人完成時間完成時間備注備注1第一天下達(dá)工作指令吳久玲2016.9.282第二天制定計劃并安排任務(wù)C2016.9.293第三天討論方案制作pptABCD2016.9.304第四天備料和滅菌無菌室操作BDAC2016.10.8注意操作時操作標(biāo)準(zhǔn)5第五天細(xì)菌計數(shù)觀察培養(yǎng)結(jié)果并完成ABCD2016.10.11在藥物分析中經(jīng)常可以用到:定性試驗:指的是用適當(dāng)?shù)姆椒?化學(xué)分析或儀器分析等等)，來確定所測物質(zhì)是否

2、為已知的,你要鑒別的物質(zhì)定量試驗:指的是在確定為你要鑒定的物質(zhì)的基礎(chǔ)上,用適宜的方法(同上),來測定你要鑒定的物質(zhì)的量是多少.定性與定量的區(qū)別 微生物的定量在實際工作中應(yīng)用極廣,它不僅是微生物工作者常用手段之一,而且在各行業(yè)上應(yīng)用也十分廣泛。 微生物的定量是基礎(chǔ)微生物內(nèi)容之一。 需要菌體的微生物發(fā)酵大型生 產(chǎn),更需微生物的定量。和災(zāi)害微生物作斗爭中,了解不同環(huán)境微生物污染情況,例如,水的污染、空氣的污染定量實驗的定義中藥飲片廠與藥廠視頻藥片飲片廠從本質(zhì)上來說也屬于藥廠，只是屬于藥材加工這一方面，所以要求比較低。1.概述:培養(yǎng)基是微生物試驗的基礎(chǔ)，直接影響微生物試驗結(jié)果。適宜的培養(yǎng)基制備方法、貯

3、藏條件和質(zhì)量控制是提供優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基的保證。供試品微生物限度檢查中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。 2.驗證目的：本次驗證的目的是確認(rèn)耐膽鹽革蘭陰性菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查用的腸道菌增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的質(zhì)量，以及其制備程序、保存條件等是否滿足微生物限度檢查用要求。 3.驗證依據(jù)：中國藥典2015年版四部“1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物控制菌檢查”、“9203藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則”。 4.驗證項目：腸道菌增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的適用性檢查。 5.適用范圍：成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。定量試驗： 選

4、擇和分離培養(yǎng) 取相當(dāng)于0.1g 、O.Olg和O.OOlg(或0. 1ml、0. 01ml和0. OOlml) 供試品的預(yù)培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至適宜體積(經(jīng)方法適用性試驗確定）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，303 5C培養(yǎng)244 8小時。上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035*C培養(yǎng)182 4小時。備料單胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基1支（10ml支）腸道增菌液體培養(yǎng)基5支（10ml支）刻度吸管1ml56支緩沖液3支（9ml支）角勺、玻璃棒各1個；每2小組準(zhǔn)備研缽一套，消毒用品。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基10ml1g供試品取供試品，用胰酪大豆胨液體作為稀釋劑照“非無菌產(chǎn)品微生物限度

5、檢查 微生物計數(shù)法”（通則1105）制成1：10供試液 ，混勻在2025培養(yǎng) 培養(yǎng)時間應(yīng)使供試品中的細(xì)菌充分恢復(fù)但不增殖（約2小時）PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液9ml 緩沖液 9ml緩沖液9ml101102103腸道增菌液體培養(yǎng)基10ml腸道增菌液體培養(yǎng)基10ml腸道增菌液體培養(yǎng)基10ml腸道增菌液體培養(yǎng)基10ml陽性菌陽性菌液液陽性菌液腸道增菌液體培養(yǎng)基10ml 3035培養(yǎng)2448小時3035培養(yǎng)1824小時結(jié)果判斷：若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，則對應(yīng)培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。 根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，從MPN表查對1g或1ml供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的最大可能數(shù)。什

6、么是MPN?它的用途又是什么？微生物限度檢查與它有著怎樣的聯(lián)系？MPN最大或然數(shù)(most probable number，MPN)計數(shù)又稱稀釋培養(yǎng)計數(shù)，即最近似數(shù)法，也稱最大可能數(shù)法，是食品檢驗中常用的方法。 1915年McCrady首次發(fā)表了用MPN法來估算細(xì)菌濃度的方法，這是一種應(yīng)用概率理論來估算細(xì)菌濃度的方法。原理其特點是利用待測微生物的特殊生理功能的選擇性來擺脫其他微生物類群的干擾，并通過該生理功能的表現(xiàn)來判斷該類群微生物的存在和豐度。缺點是只適于進(jìn)行特殊生理類群的測定，結(jié)果也較粗放，只有在因某種原因不能使用平板計數(shù)時才采用。 MPN法優(yōu)點：操作簡便，靈敏度較高，時間短，可直接觀察試

7、管得出結(jié)論，若發(fā)酵培養(yǎng)基不產(chǎn)氣，24h即刻報告控制菌陰性，每個接種稀釋度均有重復(fù)，重復(fù)次數(shù)越多，誤差就會越小。缺點：要求樣品具有均一性，適合檢驗液體樣品，且只能用于檢驗在發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)氣的菌種。適用性：MPN法適用于具有特殊生理功能的微生物類群或者檢測帶有大量競爭菌的食品及其原料和未經(jīng)處理的含少量的金黃色葡萄球菌的食品(土壤，污水，牛奶等）耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)注：代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上有菌落生長；代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上無菌落生長。 若供試品量減少10倍（如0.01g或0.01ml，0.001g或0.001ml，0.0001g或0.0001ml），則每1g(或1mL)供試品中可

8、能的菌數(shù)（N）應(yīng)相應(yīng)增加10倍。局限性例如，MPN值為90時，有四種不同情況的陽性管數(shù)。陽性管數(shù)為“0-0-0”“0-1-2”對應(yīng)的最大概率（Pmax）極小，此時的MPN值 90 MPN/100 ml(g）無意義，所以在FDA細(xì)菌學(xué)手冊中，已刪除了這兩種情況。陽性管數(shù)為“0-3-0” 對應(yīng)的最大概率（Pmax）為0.00417%，而國標(biāo)中并沒有列出相應(yīng)的95%置信區(qū)間，是考慮到該置信區(qū)間過廣，已沒有很大的指導(dǎo)意義。而陽性管數(shù)為“2-0-0”的最大概率（Pmax) 為31.91613%，表明實際的菌落數(shù)在10360 cfu/100 ml(g）之間。所以，測定MPN值時，要考慮陽性管數(shù)。相同的MP

9、N值，代表的實際菌落數(shù)范圍卻有很大的差別。假如你的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)為100 MPN/100 g，實測值為90 MPN/100 g （陽性管數(shù)“0-3-0”），那么很難判定你的產(chǎn)品是否合格。MPN法與平板法衛(wèi)生學(xué)意義兩者都是檢測的活菌數(shù)，MPN是通過極大近似值然后估計，求出分布函數(shù)中的參數(shù)，置信區(qū)間，再估計；但是CFU(平板計數(shù)法)通過數(shù)據(jù)直接求平均值和方差。測定結(jié)果判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，一定程度反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對被檢樣品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評價。多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣注意事項1）在使用移液管時盡量靠近液體，使其充分融合2）在接種完后，在酒精燈上滅菌

10、3）如果陰性培養(yǎng)有長菌的話要注意分析操作過程是否規(guī)范品名枸杞批號_規(guī)格_數(shù)量20g取樣方法 執(zhí)行SOP取樣地點無菌室取樣量1g取樣設(shè)備取樣器指令下達(dá)日期2016年9月29指令下達(dá)人吳九齡執(zhí)行人第五小組 注 意 事項1.注意勿損壞產(chǎn)品內(nèi)包裝并及時復(fù)原。2.請在24小時內(nèi)取樣。3.取樣后3h內(nèi)接種檢驗。4.目的：控制菌檢查。取樣記錄 1.操作與指令有無偏差。2.偏差說明：備注取樣日期 2016.9.27取樣人第五小組品名枸杞批號_規(guī)格_數(shù)量20g取樣方法 執(zhí)行SOP取樣地點無菌室取樣量1g取樣設(shè)備取樣器指令下達(dá)日期2016年9月29指令下達(dá)人吳九齡 執(zhí)行人第五小組備注取樣日期 2016.9.27取

11、樣人第五小組枸杞藥用價值果實（中藥稱枸杞子）枸杞藥材藥用功能與寧夏枸杞同；根皮（中藥稱地骨皮），有解熱止咳之效用。中醫(yī)認(rèn)為，枸杞子具有補腎益精、養(yǎng)肝明目、潤肺止咳的功效?，F(xiàn)代研究表明，枸杞含有大 量胡蘿卜素、維生素、人體必需的蛋白質(zhì)、粗脂肪和磷、鐵等營養(yǎng)物質(zhì)。其中，維生素C的含量比橙子高。處理固體細(xì)粉原輔料取樣方法 物流置層流罩下，打開層流罩調(diào)節(jié)電壓 210V，打開紫外燈30min后，關(guān)閉紫外燈。開啟送風(fēng)系統(tǒng)，打開包裝封口，對應(yīng)取樣的每個樣件，用取樣器對角斜插各取樣一次。取樣點3個以上，其分布應(yīng)呈幾何對稱形。先以無菌手續(xù)取約30g于三角瓶內(nèi)，加塞包口，然后放入密實塑料袋內(nèi)。取完各樣件后將放有樣

12、品的密實袋充氣密封，反復(fù)顛倒數(shù)次，使樣品充分混勻，用臺秤稱取所需量，置于另一密實袋內(nèi)，密封。品牌：環(huán)凱生產(chǎn)批號：3104591供應(yīng)商：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司數(shù)量：1000保質(zhì)期：三年保存條件：陰涼干燥處規(guī)格：250g產(chǎn)品名稱：紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基022223PRODUCT NAME：Violet Red Bile Glucose Agar【紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基包裝規(guī)格】紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基【紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基產(chǎn)品用途】用于耐膽鹽革蘭氏陰性菌的選擇性分離培養(yǎng)。(2015版CP)紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配方成分成分 含量(g/L)酵母浸出粉3.0明膠胰酶水解物7.0葡萄糖10

13、.0中性紅0.03mg結(jié)晶紫0.002mg氯化鈉5.0脫氧膽酸鈉1.5瓊脂15.0蒸餾水 (干粉培養(yǎng)基不含此成分)1000最終 pH 5.60.2明膠胰酶消化物(進(jìn)口） ：培養(yǎng)基選擇與優(yōu)化技術(shù)對未來生物領(lǐng)域的發(fā)展有極其重要的影響，其涵蓋所有常檢細(xì)菌及其他細(xì)菌，涉及食品衛(wèi)生檢驗、醫(yī)藥、水質(zhì)、臨床、化妝品等各個領(lǐng)域。 酵母浸粉：富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽、核苷酸、B族維生素、生長因子、微量元素等營養(yǎng)成分，比例協(xié)調(diào)，為微生物發(fā)酵培養(yǎng)提供全面均衡的營養(yǎng)；脫氧膽酸鈉：配制細(xì)菌培養(yǎng)基，代替腦磷脂作膽固醇絮狀試驗，蛋白質(zhì)分析。裂解液中脫氧膽酸鈉和原礬酸鈉的作用前者是離子型去垢劑，后者是抑制酪氨酸磷酸酶活性的。

14、氯化鈉：氯化鈉是許多生物學(xué)反應(yīng)所必需的，如分子生物學(xué)試驗中多種溶液配方都含有氯化鈉，細(xì)菌培養(yǎng)基中大多含有氯化鈉。中性紅：中性紅(Neutral red)，學(xué)名“3-氨基-7-甲氨基-2-甲基吩嗪鹽酸鹽”，cas號：553-24-2，是細(xì)胞活體染色和酸堿性指示劑的一種堿性吩嗪染料。結(jié)晶紫藥理作用：甲紫屬于三苯甲烷類染料消毒劑，和微生物酶系統(tǒng)發(fā)生氫離子的競爭性對抗，使酶成為無活性的氧化狀態(tài)，從而發(fā)揮殺菌作用。主要對革蘭氏陽性菌如葡萄球菌、白喉桿菌，以及綠膿桿菌、白念珠菌、表皮癬菌有殺滅作用，對其他革蘭氏陰性菌和抗酸菌幾乎無作用。產(chǎn)品中文名：腸道菌增菌液體培養(yǎng)基PRODUCT NAME：ENTERO

15、BACTERIA ENRICHMENT BROTH-MOSSEL 【包裝規(guī)格】腸道菌增菌液體培養(yǎng)【產(chǎn)品用途】用于耐膽鹽革蘭氏陰性菌的選擇性分離培養(yǎng)。(2015版CP)【檢驗原理】明膠胰酶水解物提供蛋白質(zhì)、維生素和氨基酸;葡萄糖提供碳源;磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀為緩沖劑;牛膽鹽和亮綠為選擇性抑菌劑，抑制非腸桿菌科細(xì)菌的生長?！九浞匠煞帧砍煞趾?g/L)明膠胰酶水解物10.0二水合磷酸氫二鈉8.0牛膽鹽20.0亮綠0.015葡萄糖5.0磷酸二氫鉀2.0蒸餾水(干粉培養(yǎng)基不含此成分)1000最終 pH 7.20.2【使用方法】外觀方面：脫水干粉培養(yǎng)基：淡綠色粉末培養(yǎng)基溶解后：綠色液體，清晰無沉淀。中

16、藥飲片污染耐膽鹽革蘭陰性菌的考察：考察中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌的污染狀況。方法：依據(jù)2015年版中國藥典微生物限度檢查法草案中耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法對中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌進(jìn)行定性檢查，對陽性樣品進(jìn)行定量檢查，比較預(yù)培養(yǎng)2h和不預(yù)培養(yǎng)兩種方法對耐膽鹽革蘭陰性菌定量檢出的差異。結(jié)果：通過對17個品種174批中藥飲片的考察，結(jié)果顯示中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌污染比較嚴(yán)重，達(dá)81.0。按2015年版中國藥典中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌標(biāo)準(zhǔn)來判斷，16.1不合格，且預(yù)培養(yǎng)2 h和不預(yù)培養(yǎng)兩種方法檢驗結(jié)果沒有顯著差異（ P0.05）。結(jié)論：本研究可為2015年版中國藥典中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌限度標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。樣品涂片。首先在載玻片上滴一小滴蒸餾水，用灼燒過的接種針挑取少量細(xì)菌，置載玻片的水滴中與水混合并涂抹開，注意涂抹要均勻平坦，涂抹后直徑約為1 cm的薄層。固定。將載玻片在火焰上方快速來回通過一兩次，以載玻片的加熱面接觸手背皮膚，不覺過燙為佳，待冷卻后再在火焰上方來回通過一兩次，再冷卻，這樣重復(fù)操