HPLC培訓(xùn)(峰與色譜條件)

1、HPLC高效液相高效液相色譜色譜 基本原理基本原理 加樣加樣 流動(dòng)相流動(dòng)相 流動(dòng)相流動(dòng)相 A C B B C A 固定相固定相 柱內(nèi)填料，柱內(nèi)填料，流動(dòng)相流動(dòng)相 洗脫劑。洗脫劑。 HPLC是利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)的不同，進(jìn)行連續(xù)的無數(shù)次的交換和分配而達(dá)到分離的過程。基本操作 1.打開泵電源，待自檢完成后打開“Purge”閥進(jìn)行排液以除去泵頭之前的氣泡，排氣完成后關(guān)閉“Purge”閥。按“Pump”鍵開啟泵，然后按“func”及數(shù)字鍵以0.2ml/min的速度慢慢將流速調(diào)1.0ml/min （其中測(cè)甘油果糖氯化鈉注射液時(shí)應(yīng)以0.1ml/min的速度慢慢將流速調(diào)0.5ml/m

2、in ）。 2.一般柱平衡時(shí)間為30min左右（測(cè)甘油果糖氯化鈉注射液時(shí)平衡時(shí)間會(huì)更長(zhǎng)些），此時(shí)依次打開檢測(cè)器、工作站電源，打開計(jì)算機(jī)中工作站，待儀器自檢連接完成后查看基線，如基線平穩(wěn)即可進(jìn)樣采集數(shù)據(jù)。 3.檢測(cè)完成后，關(guān)閉計(jì)算機(jī)中工作站、檢測(cè)器、工作站電源，將泵的流速慢慢降至0.2ml/min，按“Pump”鍵關(guān)閉泵，將流動(dòng)相換至10%甲醇水或乙腈水，再以1.0ml/min流速?zèng)_洗色譜柱30-60min。 4.最后將色譜柱充滿純甲醇保存。 5.手動(dòng)進(jìn)樣器使用后，用適當(dāng)溶劑沖洗進(jìn)樣閥，除去殘留的樣品，溶劑，緩沖鹽等，蓋好封蓋防止灰塵顆粒。流動(dòng)相的配制流動(dòng)相的配制 配制用水最好用蒸餾水（注射水）

3、配制用水最好用蒸餾水（注射水） 稱量、量取、調(diào)稱量、量取、調(diào)pH時(shí)盡可能精確時(shí)盡可能精確 流動(dòng)相必須用流動(dòng)相必須用0.45um濾膜過濾，注意區(qū)分有機(jī)膜、無機(jī)膜濾膜過濾，注意區(qū)分有機(jī)膜、無機(jī)膜 加入甲醇或乙腈后要混合充分加入甲醇或乙腈后要混合充分 流動(dòng)相必須經(jīng)過脫氣（常用方法是超聲脫氣）流動(dòng)相必須經(jīng)過脫氣（常用方法是超聲脫氣） 配制所用的試劑盡可能用色譜純，如沒有色譜純可用分析純代替配制所用的試劑盡可能用色譜純，如沒有色譜純可用分析純代替 流動(dòng)相應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配制，染菌的流動(dòng)相禁止使用流動(dòng)相應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配制，染菌的流動(dòng)相禁止使用 配制過程中應(yīng)注意自我保護(hù)配制過程中應(yīng)注意自我保護(hù)流動(dòng)相使用前為什么要脫氣？

4、流動(dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣處理流動(dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過），以防止在洗脫過程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)增加基線的噪音，程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。常用的脫氣方法比較：常用的脫氣方法比較： 氦氣脫氣法氦氣脫氣法加熱回流法：效果

5、較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。 抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。 超聲脫氣法：流動(dòng)相放在超聲波容器中用超聲波振蕩，超聲過程中觀察無氣泡生成即可。超聲脫氣法：流動(dòng)相放在超聲波容器中用超聲波振蕩，超聲過程中觀察無氣泡生成即可。 在線真空脫氣法：真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)在線脫氣，無需額外操作，成本低，脫氣效在線真空脫氣法：真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)在線脫氣，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。色譜柱的良好使用規(guī)范溶劑使用前必須過濾運(yùn)輸中變干了

6、的色譜柱要完全浸濕（預(yù)處理）如果樣品中含有無需考慮而保留強(qiáng)的組分時(shí),必須進(jìn)行前處理清楚了解色譜柱填料適用的pH范圍(3-7)，溫度(1.2色譜柱故障診斷- 峰形問題可能的原因可能的原因1.小峰在大峰前流出2.柱床塌陷3.樣品溶劑不合適4.柱過濾片部分堵塞5.柱過載，偶爾發(fā)生NormalFronting伸舌峰（前延峰）伸舌峰（前延峰）對(duì)稱系數(shù)對(duì)稱系數(shù)0.9手動(dòng)進(jìn)樣器的使用、維護(hù)手動(dòng)進(jìn)樣器的使用、維護(hù)樣品溶液進(jìn)樣前必須用0.45um濾膜過濾，以減少微粒對(duì)進(jìn)樣閥的磨損轉(zhuǎn)動(dòng)切換時(shí)不能太慢，更不能停留在中間 位置，否則流動(dòng)相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增， 甚至超過泵的最大壓力避免使用針頭彎曲，毛刺，變鈍的進(jìn)樣針

7、 使用后，用適當(dāng)溶劑沖洗進(jìn)樣閥，除去殘 留的樣品，溶劑，緩沖鹽等，蓋好封蓋防 止灰塵顆粒 必要時(shí)更換轉(zhuǎn)子密封墊必要時(shí)更換轉(zhuǎn)子密封墊系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 1.色譜柱的理論板數(shù) * 2.分離度 * 3.重復(fù)性 4.拖尾因子色譜柱的理論塔板數(shù)（n）用于評(píng)價(jià)色譜柱的分離效能。n=16(tR/w)2 或n=5.54(tR/wh/2)2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。保留時(shí)間tR峰寬w半高峰寬wh/2分離度（R）用于評(píng)價(jià)待測(cè)組分與相鄰共存物或難分離物質(zhì)之間的分離程序，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標(biāo)。除另有規(guī)定外，待測(cè)組分與相鄰共存物之間的分離度應(yīng)大于1.5。計(jì)算公式 或重復(fù)性用于評(píng)價(jià)連續(xù)進(jìn)樣中，色譜系統(tǒng)響應(yīng)值的重復(fù)性能。采

8、用外標(biāo)法時(shí)，通常取各品種項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD采用內(nèi)標(biāo)法時(shí)，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。拖尾因子（T）用于評(píng)價(jià)色譜柱的對(duì)稱性。為保證分離效果和測(cè)量精度，應(yīng)檢查待測(cè)峰的拖尾因子是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定。拖尾因子計(jì)算公式為 。 除另有規(guī)定外，峰高法定量時(shí)T應(yīng)在0.95 1.05之間。峰面積法測(cè)定時(shí)，若拖尾嚴(yán)重，將影響峰面積的準(zhǔn)確測(cè)量。系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)1.理論塔板數(shù) n2.分離度 （R 1.5）3.重復(fù)性 RSD=0.1%4.拖尾因子 T=1.04min012345678mAU 05010015

9、0200250300 VWD1 A, 波長(zhǎng)=310 nm (D:質(zhì)檢-成品替硝唑注射液1 2010-02-17 10-55-42SIG000001.D) 7.548min012345678mAU 050100150200250300 VWD1 A, 波長(zhǎng)=310 nm (D:質(zhì)檢-成品替硝唑注射液1 2010-02-17 10-55-42SIG000002.D) 7.537min012345678mAU 050100150200250300 VWD1 A, 波長(zhǎng)=310 nm (D:質(zhì)檢-成品替硝唑注射液1 2010-02-17 10-55-42SIG000003.D) 7.531min012

10、345678mAU 050100150200250300 VWD1 A, 波長(zhǎng)=310 nm (D:質(zhì)檢-成品替硝唑注射液1 2010-02-17 10-55-42SIG000004.D) 7.490min012345678mAU 050100150200250300350 VWD1 A, 波長(zhǎng)=310 nm (D:質(zhì)檢-成品替硝唑注射液1 2010-02-17 10-55-42SIG000006.D) 7.379替硝唑含量替硝唑含量理論塔板數(shù)=15487對(duì)稱因子=1.05min012345678mAU 050100150200250300 VWD1 A, 波長(zhǎng)=310 nm (D:質(zhì)檢-成品

11、替硝唑注射液1 2010-01-05 14-48-56SIG000002.D) 7.826含量測(cè)定-內(nèi)標(biāo)法按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成規(guī)定用的對(duì)照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測(cè)量對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子：校正因子（f）ASCS/ARCR 式中： AS為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；AR為對(duì)照品的峰面積或峰高；CS為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度，CR為對(duì)照品的濃度。再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量供試品中待測(cè)成分（或其雜質(zhì)）和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量：含量（ cX ） fA

12、xC/S /As 式中： AX為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積或峰高；CX為供試品（或其雜質(zhì)）的濃度；A/S為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；C/S為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；f為校正因子。采用內(nèi)標(biāo)法，可避免因樣品前處理及進(jìn)樣體積誤差對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響。含量測(cè)定-外標(biāo)法按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和供試品，配制成溶液，分別精密量取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量對(duì)照品溶液和供試品溶液中待測(cè)組分的峰面積（或峰高），按下式計(jì)算含量：含量（CX）cR Ax /AR 式中各符號(hào)意義同上。由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測(cè)定供試品中成分或雜質(zhì)含量時(shí)，以定量環(huán)或自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣為好。替硝唑有關(guān)物質(zhì)替硝唑有

13、關(guān)物質(zhì)其中雜質(zhì)與2-甲基-5硝基咪唑的分離度為1.69min02468101214mAU 05001000150020002500 VWD1 A, 波長(zhǎng)=310 nm (D:質(zhì)檢-成品替硝唑注射液1 2009-10-06 14-53-17SIG000080.D) 5.008 5.303 7.510有關(guān)物質(zhì)1.加校正因子的主成分自身對(duì)照法加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，可采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法。在建立方法時(shí)，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質(zhì)對(duì)照品和待測(cè)組分對(duì)照品各適量，配制測(cè)定雜質(zhì)校正因子的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，按上述內(nèi)標(biāo)法計(jì)算雜質(zhì)的校正因子。此校正因子可直接載入各

14、品種項(xiàng)下，用于校正雜質(zhì)的實(shí)測(cè)峰面積。這些需作校正計(jì)算的雜質(zhì)，通常以主成分為參照，采用相對(duì)保留時(shí)間定位，其數(shù)值一并載入各品種項(xiàng)下。測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷?duì)照溶液，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度（以噪聲水平可接受為限）或進(jìn)樣量（以柱子不過載為限），使對(duì)照溶液的主成分色譜峰的峰高約達(dá)滿量程的10%25%或其峰面積能準(zhǔn)確積分通常含量低于0.5%的雜質(zhì)，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）應(yīng)小于10%；含量在0.5%2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于5%；含量大于2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于2.0%。然后，取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，分別進(jìn)樣，供試品溶液的記錄時(shí)間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時(shí)間的2倍，測(cè)量供試品溶液色譜峰上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，依法計(jì)算各雜質(zhì)含量。2.不加校正因子的主成分自身對(duì)照法不加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，若沒有雜質(zhì)對(duì)照品，也可采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法。同上述（3）法配制對(duì)照品溶液并調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度后，取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，分別進(jìn)樣，前者的記錄時(shí)間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時(shí)間的2倍，測(cè)量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積并與對(duì)照品溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算雜質(zhì)含量。若供試品所含的部分雜質(zhì)未與溶劑峰完全分離，則