第四章 DNA復(fù)制損傷與修復(fù)

1、lDNADNA是由四種脫氧核糖核酸所組成的是由四種脫氧核糖核酸所組成的長鏈大分子，是遺傳信息的攜帶者。長鏈大分子，是遺傳信息的攜帶者。l生物體的遺傳信息就貯存在生物體的遺傳信息就貯存在DNADNA的四的四種脫氧核糖核酸的排列順序中。種脫氧核糖核酸的排列順序中。 lDNADNA通過復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子通過復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過轉(zhuǎn)錄和翻譯，將遺傳信息傳遞代；通過轉(zhuǎn)錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)分子，從而決定生物的表現(xiàn)型。給蛋白質(zhì)分子，從而決定生物的表現(xiàn)型。DNADNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程就構(gòu)成了的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程就構(gòu)成了遺遺傳學(xué)的中心法則傳學(xué)的中心法則。 l在在RNA

2、RNA病毒中，其遺傳信息貯存在病毒中，其遺傳信息貯存在RNARNA分分子中。因此，在這些生物體中，遺傳信子中。因此，在這些生物體中，遺傳信息的流向是息的流向是RNARNA通過復(fù)制，將遺傳信息由通過復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代，通過反轉(zhuǎn)錄將遺傳信親代傳遞給子代，通過反轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給息傳遞給DNADNA，再由，再由DNADNA通過轉(zhuǎn)錄和翻譯通過轉(zhuǎn)錄和翻譯傳遞給蛋白質(zhì)，這種遺傳信息的流向就傳遞給蛋白質(zhì)，這種遺傳信息的流向就豐富了豐富了中心法則的內(nèi)容中心法則的內(nèi)容。 DNA dependent DNA polymeraseDDDPDNA dependent RNA polymeraseDDR

3、PRNA dependent RNA polymeraseRDRPRNA dependent DNA polymeraseRDDP 復(fù)制（復(fù)制（DDDPDDDP） 轉(zhuǎn)錄（轉(zhuǎn)錄（DDRPDDRP） 翻譯翻譯 DNA RNA DNA RNA 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 反轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄（RDDPRDDP） RNA RNA 復(fù)制（復(fù)制（RDRPRDRP） lA gene is expressed in two stepsA gene is expressed in two stepsTranscription: RNA synthesisTranscription: RNA synthesisTranslation

4、: Protein synthesisTranslation: Protein synthesisDNADNA復(fù)制的基本過程：復(fù)制的基本過程：l復(fù)制的起始復(fù)制的起始 (initiation)lDNA鏈的延伸鏈的延伸 (elongation)l復(fù)制的終止復(fù)制的終止 (termination)一、一、DNADNA復(fù)制的半保留性復(fù)制的半保留性 lDNADNA在復(fù)制時(shí)，以親代在復(fù)制時(shí)，以親代DNADNA的每一股作模的每一股作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代DNADNA，每個(gè)子代每個(gè)子代DNADNA中都含有一股親代中都含有一股親代DNADNA鏈，鏈，這種現(xiàn)象稱為這種現(xiàn)象稱為

5、DNADNA的半保留復(fù)制的半保留復(fù)制(semi-(semi-conservative replication)conservative replication)。 l DNADNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在19581958年由年由M. M. Meselson Meselson 和和 F. Stahl F. Stahl 所完成的實(shí)驗(yàn)所證明。該實(shí)驗(yàn)所完成的實(shí)驗(yàn)所證明。該實(shí)驗(yàn)首先將大腸桿菌在含首先將大腸桿菌在含1515N N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其其DNADNA中的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)橹械膲A基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?515N N。將大腸桿菌移至只含。將大腸桿菌移

6、至只含1414N N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNADNA，作密度梯度離心，可得到下列結(jié)果：，作密度梯度離心，可得到下列結(jié)果： 二、復(fù)制起點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征二、復(fù)制起點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征lDNADNA在復(fù)制時(shí)，需在特定的位點(diǎn)起始，這在復(fù)制時(shí)，需在特定的位點(diǎn)起始，這是一些具有特定核苷酸排列順序的片段，是一些具有特定核苷酸排列順序的片段，即復(fù)制起始點(diǎn)（復(fù)制子）。即復(fù)制起始點(diǎn)（復(fù)制子）。3個(gè)連續(xù)的13bp序列，富含AT反向重復(fù)出現(xiàn)四次9bp序列酵母自主復(fù)制序列在原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)通常為一個(gè)，在原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)通常為一個(gè)，而在真核生物中則為多個(gè)

7、。而在真核生物中則為多個(gè)。 三、三、RNARNA引物引物 參與參與DNADNA復(fù)制的復(fù)制的DNADNA聚合酶，必須以一段具有聚合酶，必須以一段具有3 3端自由羥基（端自由羥基（3 3-OH-OH）的）的RNARNA作為引物作為引物(primer) (primer) ，才能開始聚合子代，才能開始聚合子代DNADNA鏈。鏈。RNARNA引物的大小，通常為引物的大小，通常為1 11010個(gè)核苷酸。個(gè)核苷酸。RNARNA引物的堿基順序，與其模板引物的堿基順序，與其模板DNADNA的堿基的堿基順序相配對。順序相配對。 四、雙向復(fù)制四、雙向復(fù)制 DNADNA復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始

8、點(diǎn)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制。但在低等生物中，兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制。但在低等生物中，也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。 五、五、DNADNA的半不連續(xù)復(fù)制的半不連續(xù)復(fù)制l由于由于DNADNA聚合酶只能以聚合酶只能以5353方向聚方向聚合合子代子代DNADNA鏈鏈，即，即模板模板DNADNA鏈鏈的方向必的方向必須為須為3535。因此，分別以兩條親代。因此，分別以兩條親代DNADNA鏈作為模板聚合子代鏈作為模板聚合子代DNADNA鏈時(shí)的方鏈時(shí)的方式是不同的。式是不同的。l以以3535方向的親代方向的親代DNADNA鏈作模板的子鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)行的，其

9、代鏈在復(fù)制時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)行的，其子代鏈的聚合方向?yàn)樽哟湹木酆戏较驗(yàn)?353，這一條，這一條鏈被稱為鏈被稱為前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈(leading strand)(leading strand)。而。而以以5353方向的親代方向的親代DNADNA鏈為模板的子鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)則是不連續(xù)的，其鏈的聚代鏈在復(fù)制時(shí)則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也是合方向也是5353，這條鏈被稱為，這條鏈被稱為滯滯后鏈后鏈(lagging strand)(lagging strand)。l由于親代由于親代DNADNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開的，雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開的，因此，滯后鏈的合成也是一段一段的。因此，滯后鏈的合成也

10、是一段一段的。DNADNA在復(fù)制時(shí)，由滯后鏈所形成的一些子在復(fù)制時(shí)，由滯后鏈所形成的一些子代代DNADNA短鏈稱為短鏈稱為岡崎片段岡崎片段(Okazaki (Okazaki fragment)fragment)。l岡崎片段的大小，在原核生物中約為岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000100020002000個(gè)核苷酸，而在真核生物中個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為約為100100個(gè)核苷酸。個(gè)核苷酸。 半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制 Semi-discontinuous replication 岡崎片段岡崎片段Okazaki fragmentLeading strandLagging strandRepl

11、ication fork前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界是有在生物界是有普遍性的，因而稱之為普遍性的，因而稱之為DNA的半不連續(xù)復(fù)制的半不連續(xù)復(fù)制。（1）以原來的DNA母鏈為模板（template），復(fù)制產(chǎn)生新的子鏈。（2）作為模板的雙鏈DNA分子需要解鏈以暴露隱藏在雙螺旋結(jié)構(gòu)核心的堿基序列，然后才能作為模板。（3）復(fù)制的方式是半保留（semi-conservative）。（4）需要引物,一般是長度為615nt的短RNA，少數(shù)為蛋白質(zhì)。（5）復(fù)制的方向總是53（6）復(fù)制起始于特定的區(qū)域，但終止的位置通常不固定。原核生物和真核生物的DNA復(fù)制起始區(qū)

12、數(shù)目不同，前者只有一個(gè)，而后者則有多個(gè)（7）一般為雙向復(fù)制（8）半不連續(xù)性（9）具有高度的忠實(shí)性在細(xì)胞中，雙螺旋在細(xì)胞中，雙螺旋DNADNA復(fù)制是復(fù)制是DNADNA聚合聚合酶催化的酶促反應(yīng)過程。但酶催化的酶促反應(yīng)過程。但DNADNA聚合酶只聚合酶只能延長已有的能延長已有的DNADNA或或RNARNA引物鏈，不能從引物鏈，不能從頭起始頭起始DNADNA鏈的合成；而且在鏈的合成；而且在DNADNA復(fù)制中復(fù)制中形成特殊的復(fù)制叉（或生長叉）結(jié)構(gòu)區(qū)形成特殊的復(fù)制叉（或生長叉）結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)，內(nèi)，DNADNA雙螺旋中的兩條鏈纏繞在一起，雙螺旋中的兩條鏈纏繞在一起，要拷貝每一條鏈都必須將雙螺旋要拷貝每一條鏈都必須

13、將雙螺旋DNADNA解旋解旋（unwindingunwinding），并釋放或吸收由此產(chǎn)生），并釋放或吸收由此產(chǎn)生的扭力，這就要求雙螺旋和超螺旋的解的扭力，這就要求雙螺旋和超螺旋的解旋與重新形成，旋與重新形成，DNADNA聚合酶不能完成這一過聚合酶不能完成這一過程；在不連續(xù)合成中形成短的岡崎片段程；在不連續(xù)合成中形成短的岡崎片段（Okazaki fragmentOkazaki fragment）的連接也是）的連接也是DNADNA聚合聚合酶無法完成的。實(shí)際上，在復(fù)制叉處進(jìn)行酶無法完成的。實(shí)際上，在復(fù)制叉處進(jìn)行復(fù)雜的復(fù)雜的DNADNA復(fù)制過程中，需要許多相關(guān)的酶復(fù)制過程中，需要許多相關(guān)的酶和蛋白因

14、子參與。主要有：和蛋白因子參與。主要有： DNADNA聚合酶聚合酶； DNADNA解旋酶解旋酶； 使使DNADNA雙股鏈在復(fù)制叉雙股鏈在復(fù)制叉解開的解開的解鏈酶解鏈酶； 在在DNADNA復(fù)制前防止解開復(fù)制前防止解開的的DNADNA單鏈局部退火的單鏈局部退火的DNADNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白； 合合成成RNARNA引物的引物的引發(fā)酶引發(fā)酶； 除去除去RNARNA引物的酶；引物的酶； 使岡崎片段使岡崎片段共價(jià)連接的共價(jià)連接的DNADNA連接酶連接酶等重要的酶與等重要的酶與蛋白因子。蛋白因子。（一）（一） DNADNA聚合酶聚合酶種類和生理功能：種類和生理功能：l在原核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的在原核生物中，目

15、前發(fā)現(xiàn)的DNADNA聚合酶有聚合酶有五種，分別命名為五種，分別命名為DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol），），DNADNA聚合聚合酶酶（polpol），）， DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol）前三種酶）前三種酶都屬于具有多種酶活性的多功能酶。參都屬于具有多種酶活性的多功能酶。參與與DNADNA復(fù)制的主要是復(fù)制的主要是polpol和和polpol。 polpol最有可能參與DNA的修復(fù)。lpolpol為單一肽鏈的大分子蛋白質(zhì)為單一肽鏈的大分子蛋白質(zhì), ,可被可被特異的蛋白酶水解為兩個(gè)片段

16、，其中的特異的蛋白酶水解為兩個(gè)片段，其中的大片段稱為大片段稱為Klenow fragmentKlenow fragment，具有，具有5353聚合酶聚合酶活性和活性和3535外切酶外切酶的活的活性。性。 lpol pol 由十種亞基組成，其中由十種亞基組成，其中亞基具亞基具有有5353聚合聚合DNADNA的酶活性，因而具有的酶活性，因而具有復(fù)制復(fù)制DNADNA的功能；而的功能；而亞基具有亞基具有3535外切酶的活性，因而與外切酶的活性，因而與DNADNA復(fù)制的校正功復(fù)制的校正功能有關(guān)。能有關(guān)。 lDNA聚合酶和是在1999年才被發(fā)現(xiàn)的，它涉及DNA的錯(cuò)誤傾向修復(fù)(errorprone repa

17、ir)。當(dāng)DNA受到較嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，即可誘導(dǎo)產(chǎn)生這兩個(gè)酶，使修復(fù)缺乏準(zhǔn)確性（accuracy)，因而出現(xiàn)高突變率。高突變率雖會(huì)殺死許多細(xì)胞，但至少可以克服復(fù)制障礙，使少數(shù)突變的細(xì)胞得以存活。 原核生物中的三種原核生物中的三種DNADNA聚合酶聚合酶 pol pol pol pol pol pol 5 533聚合酶活性聚合酶活性 + + + + + + 5 533外切酶活性外切酶活性 + + - - - - 3 355外切酶活性外切酶活性 + + + + + + 生理功能生理功能 去除引物去除引物, ,填補(bǔ)缺口填補(bǔ)缺口 未知未知 DNA DNA 復(fù)制復(fù)制 修復(fù)損傷修復(fù)損傷 校正錯(cuò)誤校正錯(cuò)誤 校正錯(cuò)

18、誤校正錯(cuò)誤 l在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)1515種種DNADNA聚合酶，聚合酶，但最重要的是最早發(fā)現(xiàn)的五種，分別命但最重要的是最早發(fā)現(xiàn)的五種，分別命名為名為DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚合聚合酶酶（polpol），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol），），DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol）。）。l其中，參與染色體其中，參與染色體DNADNA復(fù)制的是復(fù)制的是polpol（延長滯后鏈）和（延長滯后鏈）和polpol（延長前導(dǎo)鏈），（延長前導(dǎo)鏈），參與線粒體參與線粒體DNADNA復(fù)制的

19、是復(fù)制的是polpol，polpol與與DNADNA損傷修復(fù)、校讀和填補(bǔ)缺口有關(guān)，損傷修復(fù)、校讀和填補(bǔ)缺口有關(guān)，polpol只在其他聚合酶無活性時(shí)才發(fā)揮作只在其他聚合酶無活性時(shí)才發(fā)揮作用。用。 性質(zhì)DNApolDNApolDNApolDNApolDNApol亞細(xì)胞定位細(xì)胞核細(xì)胞核線粒體基質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞核引發(fā)酶活性有無無無無亞基數(shù)目414354內(nèi)在的進(jìn)行性中等低高低高在PCNA存在時(shí)的進(jìn)行性中等低高高高3-外切酶活性無無有有有5-外切酶活性無無無無無生物功能細(xì)胞核DNA復(fù)制細(xì)胞核DNA修復(fù)線粒體DNA復(fù)制細(xì)胞核DNA復(fù)制細(xì)胞核DNA復(fù)制和修復(fù)分裂細(xì)胞核抗原（proliferating cell n

20、uclear antigen，PCNA）為聚合酶的輔助蛋白，可提高聚合酶的進(jìn)行性（二）（二）DNADNA復(fù)制的保真性：復(fù)制的保真性：l為了保證遺傳的穩(wěn)定，為了保證遺傳的穩(wěn)定，DNADNA的復(fù)制必須具的復(fù)制必須具有高保真性。有高保真性。DNADNA復(fù)制時(shí)的保真性主要與復(fù)制時(shí)的保真性主要與下列因素有關(guān)：下列因素有關(guān)： 1 1遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律； 2 2DNADNA聚合酶在復(fù)制時(shí)對堿基的正確選擇；聚合酶在復(fù)制時(shí)對堿基的正確選擇； 3 3對復(fù)制過程中出現(xiàn)的錯(cuò)誤及時(shí)進(jìn)行校對復(fù)制過程中出現(xiàn)的錯(cuò)誤及時(shí)進(jìn)行校正。正。 天然DNA的負(fù)超螺旋雖然有利于DNA的解旋，但隨著復(fù)制的進(jìn)行，復(fù)

21、制叉前方親代DNA中仍積累巨大的張力，因此復(fù)制中需要DNA解旋酶去除解鏈酶的解鏈產(chǎn)生的扭曲張力。 大腸桿菌中的DNA解旋酶（gyrase）又稱拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase ），由四個(gè)亞基組成四聚體22，而真核的呈二聚體。DNA解旋酶的作用機(jī)制如圖所示。Topoisomerase rapidly remove the positive supercoils accumulate in front of the replication fork.DNA解旋酶每作用一次產(chǎn)生兩個(gè)負(fù)超螺旋，因此可以消除復(fù)制叉向前移動(dòng)所產(chǎn)生的正超螺旋，并且復(fù)制完的兩個(gè)子代DNA雙鏈的分離也需要DNA解旋酶的催化

22、功能。當(dāng)加入DNA解旋酶的抑制劑如香豆霉素（Coumermycin），新生霉素（novobiocin），萘啶酮酸（nalidixic acid）等時(shí)均能抑制細(xì)菌DNA的合成。可見DNA解旋酶是DNA復(fù)制所必不可少的。DNA解旋酶對真核細(xì)胞有絲分裂也是非常重要，如果不解開纏繞，在任何細(xì)胞周期中姐妹染色體都將無法分離。此外，DNA解旋酶在轉(zhuǎn)錄、同源重組及可移動(dòng)元件的轉(zhuǎn)座中都起重要作用。 復(fù)制過程中，復(fù)制叉在不斷前進(jìn)，復(fù)制叉前方的親代DNA就需不斷解鏈，為使復(fù)制能夠順利進(jìn)行，就必須防止DNA單鏈的鏈間或鏈內(nèi)局部“退火”并保證其完整性與伸展性，使單鏈DNA處于穩(wěn)定的狀態(tài)。承擔(dān)上述任務(wù)是DNA解鏈酶（D

23、NA helicase）和單鏈DNA結(jié)合蛋白DNA解鏈酶作用模型解鏈酶作用模型（single-strand binding protein, SSB）。 DNA解鏈酶是利用ATP水解獲得的能量來打斷氫鍵，解開雙鏈DNA并在DNA分子上沿一定方向移動(dòng)的一類酶的總稱（又稱解螺旋酶）。原核生物大腸桿菌為DnaB和Rep蛋白，DnaB結(jié)合于滯后鏈模板DNADNA雙螺旋的解旋雙螺旋的解旋沿53方向前進(jìn)，Rep蛋白結(jié)合于前導(dǎo)鏈模板沿35方向移動(dòng)（見圖）。真核生物病毒中大T-抗原（T-antigen, T-ag）具解開雙鏈的功能。此外也在一些真核生物中分離純化出多種DNA解鏈酶，其功能還在鑒定證實(shí)中。 圖2

24、-7 DNA雙螺旋的解旋DNADNA雙螺旋的解旋雙螺旋的解旋 單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）在細(xì)胞內(nèi)行使很多涉及單鏈區(qū)域穩(wěn)定性的功能（如同源重組）。在復(fù)制中，這包括穩(wěn)定熔解起點(diǎn)，維持解旋酶活性，從DNA模板上去除二級結(jié)構(gòu)以及抑制核酸酶活性。即SSB與DNA單鏈相結(jié)合，既防止核酸水解酶的作用，又避免解開的單鏈DNA重新締合形成雙鏈，從而保持一種伸展?fàn)顟B(tài)，以保證復(fù)制順利進(jìn)行。在E.coli中SSB為 四聚體，對單鏈DNA有很高的親和性，但對雙鏈DNA和RNA沒有親合力。它們與DNA結(jié)合時(shí)有協(xié)同作用，即有一個(gè)SSB與DNA結(jié)合時(shí)，就會(huì)有更多的SSB迅速結(jié)合上去擴(kuò)展分布整個(gè)DNA單鏈，將DNA包被上蛋白

25、聚合體。SSB有某些堿基組成的傾向性，但很少有順序?qū)Ｒ恍越Y(jié)合，可以周而復(fù)始地循環(huán)使用，在DNA的修復(fù)和重組中都有SSB的參與。 單鏈單鏈DNADNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白單鏈單鏈DNADNA結(jié)合蛋白（結(jié)合蛋白（single strand binding single strand binding protein, SSBprotein, SSB）又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（）又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（HDPHDP）。）。這是一些能夠與單鏈這是一些能夠與單鏈DNADNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。其作用為：其作用為： 使解開雙螺旋后的使解開雙螺旋后的DNADNA單鏈能夠單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈穩(wěn)定存在，即穩(wěn)

26、定單鏈DNADNA，便于以其為模板，便于以其為模板復(fù)制子代復(fù)制子代DNADNA； 保護(hù)單鏈保護(hù)單鏈DNADNA，避免核酸酶，避免核酸酶的降解。的降解。 已經(jīng)證明，DNA的半不連續(xù)復(fù)制中，DNA聚合酶不能從頭起始新的DNA鏈合成，只能在已有引物的3端向前延伸。迄今為止，人們所發(fā)現(xiàn)的引物大多為一段RNA，其長度和序列隨著基因組的種類而表現(xiàn)出不同，在大多數(shù)情況下為110個(gè)核苷酸（表2-3）?；蚪M引物長度主要的引物序列*T7T4174大腸桿菌海膽果蠅多瘤病毒動(dòng)物151515大約1018大約9大約10大約9pppApCpC/ApN12 (N主要為A和C)pppApCpN3pppAp N04pppAC

27、(N) 710(p) ppA/Gp N7pppA (N) 79pppA/Gp N9末測定表5-3 DNA復(fù)制中滯后鏈前體片斷的RNA引物 催化RNA引物（RNA primer）合成的酶叫引發(fā)酶（primerase）。引發(fā)酶識(shí)別DNA單鏈模板特異順序，以核糖核苷三磷酸為底物合成寡聚核苷酸產(chǎn)生3-OH，為DNA聚合酶起始生成磷酸二酯鍵提供條件。引物與典型的RNA（如mRNA）不同，它們在合成以后并不與模板分離，而是以氫鍵與模板結(jié)合。E.coli的引發(fā)酶是一條肽鏈，分子量為60 000，每個(gè)細(xì)胞中有50100個(gè)分子，它是由大腸桿菌dnaG基因所編碼的。該酶單獨(dú)存在時(shí)是相當(dāng)不活潑的，只有在與有關(guān)蛋白質(zhì)

28、相互結(jié)合成為一個(gè)復(fù)合體時(shí)才有活性。這種復(fù)合體就稱為引發(fā)體。機(jī)體選擇RNA作為引物，其原因可能在于減少致死突變（lethal mutation）。DNA復(fù)制中，從模板拷貝最初的幾個(gè)核苷酸時(shí)，由于堿基堆集力很弱，其氫鍵結(jié)合能力也很弱，因而堿基對的錯(cuò)配幾率就大很多，加上這幾個(gè)核苷酸還沒有與模板形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，DNA聚合酶35校對功能很難發(fā)揮作用。因此為了保證生物DNA復(fù)制的保真度，采用以RNA為引物這種過渡形式，既為DNA聚合酶提供3-羥基端，又容易被 DNA聚合酶識(shí)別而停止其聚合作用，且便于DNA聚合酶進(jìn)行切口平移。切口平移過程中發(fā)生錯(cuò)誤的幾率極少，因?yàn)镈NA聚合酶（pol I）有35外切核酸

29、酶活性，具有校對功能。 DNA DNA連接酶連接酶(DNA ligase)(DNA ligase)可催化兩段可催化兩段DNADNA片段之間片段之間磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵的形成，而使兩的形成，而使兩段段DNADNA連接起來。連接起來。l DNADNA連接酶催化的連接酶催化的條條件件是：是： 需一段需一段DNADNA片段具有片段具有3-OH3-OH，而，而另一段另一段DNADNA片段具有片段具有5-Pi5-Pi基基； 未封閉未封閉的缺口位于雙鏈的缺口位于雙鏈DNADNA中，即其中有一條鏈中，即其中有一條鏈?zhǔn)峭暾氖峭暾模?需要需要消耗能量，在原核生消耗能量，在原核生物中由物中由NADNAD+ +供

30、能，在供能，在真核生物中由真核生物中由ATPATP供供能。能。 DNA復(fù)制通常是從雙螺旋的特定位置復(fù)制原點(diǎn)（ori）開始，一般是富含A-T的區(qū)段，該區(qū)段的雙鏈DNA具有較強(qiáng)的呼吸作用（breathing），是經(jīng)常瞬間處于打開形成單鏈的區(qū)段（frequently opening region），由此產(chǎn)生的瞬時(shí)單鏈與SSB蛋白（single-stranded DNA binding protein，SSB）結(jié)合，對復(fù)制的起始十分重要。 原核生物的復(fù)制原點(diǎn)通常為一個(gè)，而真核生物則有多個(gè)特定的復(fù)制原點(diǎn)。圖2-17 DNA復(fù)制的不同方式 依DNA合成的起始方式，復(fù)制可分為從新起始與共價(jià)延伸兩種類型： 一

31、、復(fù)制叉式復(fù)制 二、 環(huán)狀環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制雙鏈的復(fù)制 一、復(fù)制叉式復(fù)制一、復(fù)制叉式復(fù)制(一一)、復(fù)制的起始、復(fù)制的起始 DNA復(fù)制的起始階段，由下列兩步構(gòu)成。復(fù)制的起始階段，由下列兩步構(gòu)成。 1、預(yù)引發(fā)：、預(yù)引發(fā)： （ 1）解旋解鏈，形成復(fù)制叉：）解旋解鏈，形成復(fù)制叉：l 由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使DNA的的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈斷裂，形成兩條單鏈DNA。單鏈。單鏈DNAl結(jié)合蛋白（結(jié)合蛋白（SSB）結(jié)合在兩條單鏈）結(jié)合在兩條單鏈DNA上，形成復(fù)制叉。上，形成復(fù)制叉。 DNA復(fù)制時(shí)，局部雙復(fù)制時(shí)，

32、局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，這種叉狀結(jié)構(gòu)螺旋解開形成兩條單鏈，這種叉狀結(jié)構(gòu)稱為稱為復(fù)制叉復(fù)制叉。對于雙向復(fù)制而言，形成。對于雙向復(fù)制而言，形成的的兩個(gè)復(fù)制叉向相反方向行進(jìn)兩個(gè)復(fù)制叉向相反方向行進(jìn)，每個(gè)復(fù)，每個(gè)復(fù)制叉上的兩條制叉上的兩條DNA鏈均被拷貝。鏈均被拷貝。圖5-12 復(fù)制叉 （箭頭表示子鏈總的生長方向） （2 2）引發(fā)體組裝：）引發(fā)體組裝：l由蛋白因子（如由蛋白因子（如dnaBdnaB等）識(shí)別復(fù)制起始等）識(shí)別復(fù)制起始點(diǎn)，并與其他蛋白因子以及引物酶一起點(diǎn)，并與其他蛋白因子以及引物酶一起組裝形成引發(fā)體。組裝形成引發(fā)體。 2 2、引發(fā)：、引發(fā)：在引物酶的催化下，以在引物酶的催化下，以DNAD

33、NA為模板，合成為模板，合成一段短的一段短的RNARNA片段，從而獲得片段，從而獲得33端自由羥端自由羥基（基（3-OH3-OH）。）。 （二）、復(fù)制的延長（二）、復(fù)制的延長 1 1、聚合子代、聚合子代DNADNA：由由DNADNA聚合酶催化，以聚合酶催化，以3535方向的親代方向的親代 DNADNA鏈為模板，從鏈為模板，從5353方向聚合子方向聚合子代代DNADNA鏈。在原核生物中，參與鏈。在原核生物中，參與DNADNA復(fù)制復(fù)制延長的是延長的是DNADNA聚合酶聚合酶；而在真核生物中，；而在真核生物中，是是DNADNA聚合酶聚合酶(延長滯后鏈延長滯后鏈) )和和（延長（延長前導(dǎo)鏈）前導(dǎo)鏈）。

34、2 2、引發(fā)體移動(dòng)：、引發(fā)體移動(dòng)：引發(fā)體向前移動(dòng)，解開新的局部雙螺旋，引發(fā)體向前移動(dòng)，解開新的局部雙螺旋，形成新的復(fù)制叉，滯后鏈重新合成形成新的復(fù)制叉，滯后鏈重新合成RNARNA引引物，繼續(xù)進(jìn)行鏈的延長。物，繼續(xù)進(jìn)行鏈的延長。 （三）、復(fù)制的終止（三）、復(fù)制的終止 1 1、去除引物，填補(bǔ)缺口：、去除引物，填補(bǔ)缺口：在原核生物中，由在原核生物中，由DNADNA聚合酶聚合酶來水解去除來水解去除RNARNA引物，并由該酶催化延長引物缺口處引物，并由該酶催化延長引物缺口處的的DNADNA，直到剩下最后一個(gè)磷酸酯鍵的缺，直到剩下最后一個(gè)磷酸酯鍵的缺口。而在真核生物中，口。而在真核生物中，RNARNA引物

35、的去除，引物的去除，由一種特殊的核酸酶來水解，而岡崎片由一種特殊的核酸酶來水解，而岡崎片段仍由段仍由DNADNA聚合酶來延長。聚合酶來延長。 2 2、連接岡崎片段：、連接岡崎片段：l在在DNADNA連接酶的催化下，形成最后一個(gè)磷連接酶的催化下，形成最后一個(gè)磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的整的DNADNA長鏈。長鏈。 (1)型型 (2) 滾環(huán)型滾環(huán)型(rolling circle) (3) D-環(huán)型環(huán)型(D-loop)大腸桿菌質(zhì)粒大腸桿菌質(zhì)粒DNADNA雙向復(fù)制雙向復(fù)制的模式與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。的模式與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。左：左：形復(fù)制模式圖；右：形復(fù)制模式圖；右：3 3

36、H H標(biāo)記質(zhì)粒標(biāo)記質(zhì)粒DNADNA合成圖。合成圖。（一）環(huán)狀（一）環(huán)狀DNADNA雙鏈的雙鏈的型復(fù)制型復(fù)制（二）、（二）、滾環(huán)式復(fù)制：滾環(huán)式復(fù)制：環(huán)狀環(huán)狀DNADNA可以通過這種方式產(chǎn)生可以通過這種方式產(chǎn)生多單元單鏈多單元單鏈DNADNA雙鏈環(huán)狀雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制起始于某復(fù)制起始于某一條一條DNA鏈上鏈上新生新生DNA鏈延伸，鏈延伸，不斷取代母鏈不斷取代母鏈復(fù)制一圈，產(chǎn)生復(fù)制一圈，產(chǎn)生單位長度的線性單位長度的線性DNA鏈鏈若復(fù)制繼續(xù)進(jìn)行，若復(fù)制繼續(xù)進(jìn)行，可產(chǎn)生多單元線可產(chǎn)生多單元線性性DNA鏈鏈單向復(fù)制單向復(fù)制的特殊方式X174的雙鏈DNA復(fù)制型(RF)滾環(huán)式復(fù)制滾環(huán)式復(fù)制（三）（三）D lo

37、ops單向復(fù)制單向復(fù)制的特殊方式的特殊方式 雙鏈環(huán)狀DNA中的一條前導(dǎo)鏈已經(jīng)引發(fā)并開始合成，與其模板形成雙鏈結(jié)構(gòu)，而另一條親本鏈則被前導(dǎo)鏈置換出來成為單鏈狀態(tài)。 這種由一條單鏈和一條雙鏈組成的三元泡狀結(jié)構(gòu)，叫做置換嚕噗或D-嚕噗（displacement loop）。只有前導(dǎo)鏈將另一條親本鏈（即滯后鏈的模板）的特別序列置換出來成為單鏈形式，才能產(chǎn)生滯后鏈前體的引發(fā)并合成其互補(bǔ)鏈。線粒體DNA的復(fù)制就是以這種有趣的不對稱方式進(jìn)行復(fù)制，并由真核DNA聚合酶負(fù)責(zé)。 三、真核生物三、真核生物DNADNA的復(fù)制特點(diǎn)的復(fù)制特點(diǎn) ( (一）、真核生物有一）、真核生物有多處復(fù)制起始點(diǎn)多處復(fù)制起始點(diǎn)。（二）、真

38、核生物（二）、真核生物復(fù)制子相對較小復(fù)制子相對較小，為，為40-10040-100千千堿基對。在全部完成復(fù)制之前，各個(gè)起始點(diǎn)上堿基對。在全部完成復(fù)制之前，各個(gè)起始點(diǎn)上DNADNA的復(fù)制不能再開始。的復(fù)制不能再開始。DNADNA復(fù)制復(fù)制只在只在S S期進(jìn)行期進(jìn)行。真核生物真核生物DNA的的復(fù)制子復(fù)制子被稱為被稱為ARS (autonomously replicating sequences)，長約長約150bp左右，包括數(shù)個(gè)復(fù)制起始必左右，包括數(shù)個(gè)復(fù)制起始必需的保守區(qū)。需的保守區(qū)。真核生物真核生物DNA復(fù)制的起始需要復(fù)制的起始需要起始點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物起始點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物（origin recogniti

39、on complex，ORC）參與，）參與，ORC結(jié)合于結(jié)合于ARS，它是由，它是由6種蛋白質(zhì)組成的啟動(dòng)復(fù)合物。種蛋白質(zhì)組成的啟動(dòng)復(fù)合物。 （三）、真核生物（三）、真核生物DNA復(fù)制叉的復(fù)制叉的移動(dòng)速度大約只有移動(dòng)速度大約只有50bp/秒，還不到秒，還不到大腸桿菌的大腸桿菌的1/20。因此，人類。因此，人類DNA中中每隔每隔30,000-300,000bp就有一個(gè)復(fù)制就有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。起始位點(diǎn)。（四）、（四）、DNA聚合酶聚合酶 真核生物真核生物DNA聚合酶有聚合酶有15種以種以上，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中主要有上，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中主要有5種種DNA聚合酶聚合酶，分別稱為，分別稱為DNA聚合聚合酶

40、酶、和和 。真核生物真核生物DNA聚合酶的特性比較聚合酶的特性比較性質(zhì)性質(zhì)DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶亞基數(shù)亞基數(shù)4122-31在細(xì)胞內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)分布分布核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)線粒體線粒體核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)(?)功能功能DNA引物合引物合成成損傷修損傷修復(fù)復(fù)線粒體線粒體DNA復(fù)制復(fù)制主要主要DNA復(fù)復(fù)制酶制酶DNA復(fù)復(fù)制制(?)35外外切切無無無無有有有有有有53外外切切無無無無無無無無無無 DNA聚合酶聚合酶主要參與主要參與引物合成引物合成。DNA聚合酶聚合酶活性水平穩(wěn)定，主要在活性水平穩(wěn)定，主要在DNA損損傷的修復(fù)傷的修復(fù)中起作用。中起作

41、用。DNA聚合酶聚合酶主要負(fù)責(zé)主要負(fù)責(zé)DNA的復(fù)制。的復(fù)制。DNA聚合酶聚合酶與后隨鏈合成有關(guān)，在與后隨鏈合成有關(guān)，在DNA合合成過程中核苷切除以及堿基的切除修復(fù)中成過程中核苷切除以及堿基的切除修復(fù)中起著重要的作用。起著重要的作用。DNA聚合酶聚合酶 在線粒體在線粒體DNA的復(fù)制中發(fā)揮的復(fù)制中發(fā)揮作用。作用。 真核生物中還存在真核生物中還存在 、 、 和和 等等幾種幾種DNA聚合酶，它們承擔(dān)著聚合酶，它們承擔(dān)著修修復(fù)損傷復(fù)損傷的功能，但這些修復(fù)酶的的功能，但這些修復(fù)酶的忠實(shí)性都很低。忠實(shí)性都很低。 （五）真核生物（五）真核生物端粒端粒和和端粒酶端粒酶：l端粒端粒（telomeretelomer

42、e）是指真核生物染色體）是指真核生物染色體線性線性DNADNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。其共同的結(jié)構(gòu)特征是由一些富成粒狀。其共同的結(jié)構(gòu)特征是由一些富含含G G、C C的短重復(fù)序列構(gòu)成，可重復(fù)數(shù)十的短重復(fù)序列構(gòu)成，可重復(fù)數(shù)十次至數(shù)百次。次至數(shù)百次。 l 線性線性DNADNA在復(fù)制完成后，其末端由于引物在復(fù)制完成后，其末端由于引物RNARNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶端粒酶（telomerasetelomerase）的催化下，進(jìn)行延長反應(yīng)。）的催化下，進(jìn)行延長反應(yīng)。l 端粒酶端粒酶是一種參與真核生物染色體末端的端是一種參

43、與真核生物染色體末端的端粒粒DNADNA復(fù)制的復(fù)制的RNA-RNA-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)復(fù)合體，其本質(zhì)是一復(fù)合體，其本質(zhì)是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，它可以其種逆轉(zhuǎn)錄酶，它可以其RNARNA為模板，通過為模板，通過逆轉(zhuǎn)逆轉(zhuǎn)錄錄過程對末端過程對末端DNADNA鏈進(jìn)行延長。鏈進(jìn)行延長。 被延長的TG鏈可以作為合成岡崎片段的模板，使端粒形成雙鏈。 端粒酶以自身的RNA作為端粒DNA復(fù)制的模版，合成出富含脫氧單磷酸鳥苷Deoxyguanosine Monophosphate(dGMP)的DNA序列后添加到染色體的末端并與端粒蛋白質(zhì)結(jié)合，從而穩(wěn)定了染色體的結(jié)構(gòu)。 細(xì)胞發(fā)生癌變后，端粒酶活性比正常時(shí)明顯增高，端粒DNA這種漸進(jìn)

44、性縮短趨勢受到阻礙，使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化成具有無限分裂能力的永生化惡性細(xì)胞。 端粒酶的活性是癌細(xì)胞的一種標(biāo)志，可以作為癌癥治療中的一個(gè)靶子。l作為一種能決定生命狀態(tài)存在和延續(xù)的生物大分子，DNA在遺傳過程中必需保持高度的精確性和完整性，而且這種性能是細(xì)胞中任何一種分子都無法與之相比的。盡管如此，在DNA復(fù)制過程中，仍難免會(huì)存在少量未被校正的差錯(cuò)。此外，DNA還會(huì)受到各種物理和化學(xué)因素的損傷。這些差錯(cuò)和損傷如果不被修復(fù)，將會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的細(xì)胞學(xué)后果，因?yàn)镈NA分子本身是無法替代的，一個(gè)細(xì)胞通常只有1-2套基因組DNA，而不像蛋白質(zhì)和RNA分子那樣，能利用DNA中的遺傳信息不斷產(chǎn)生新的分子來替代受損傷的分子

45、。所以，維護(hù)DNA遺傳信息的穩(wěn)定性對生物細(xì)胞來說是極其重要的。在漫長的生命進(jìn)化過程中，生物體不僅演化出能糾正復(fù)制錯(cuò)誤的“校正”系統(tǒng)，而且在細(xì)胞中形成了多種多樣的DNA修復(fù)系統(tǒng)，能對各種DNA的損傷進(jìn)行修復(fù)，恢復(fù)DNA正常的超螺旋結(jié)構(gòu)，以保持每個(gè)世代遺傳信息的穩(wěn)定性。極少數(shù)不能修復(fù)的DNA損傷將會(huì)導(dǎo)致基因的突變，其中一部分突變將有利于物種的進(jìn)化，而另一部分突變將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生變異和死亡。l由自發(fā)的或環(huán)境的因素引起由自發(fā)的或環(huán)境的因素引起DNADNA一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)的任何異常的改變稱為的任何異常的改變稱為DNADNA的損傷的損傷。l常見的常見的DNADNA的損傷包括的損傷包括堿基脫落堿基脫落、堿基修

46、堿基修飾、交聯(lián)，鏈的斷裂，重組飾、交聯(lián)，鏈的斷裂，重組等。等。（一）引起（一）引起DNADNA損傷的因素：損傷的因素： 1 1自發(fā)因素：自發(fā)因素： 1)1)脫嘌呤和脫嘧啶脫嘌呤和脫嘧啶 在生理?xiàng)l件下，在生理?xiàng)l件下，DNADNA分子通過自發(fā)水分子通過自發(fā)水解解經(jīng)常經(jīng)常發(fā)生脫嘧啶和脫嘌呤反應(yīng)，使嘌發(fā)生脫嘧啶和脫嘌呤反應(yīng)，使嘌呤堿和嘧啶堿從呤堿和嘧啶堿從DNADNA分子的分子的脫氧核糖脫氧核糖- -磷磷酸骨架上脫落下來酸骨架上脫落下來。LindahlLindahl估計(jì)，一個(gè)估計(jì)，一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞在哺乳動(dòng)物細(xì)胞在3737條件下，條件下，2020小時(shí)內(nèi)小時(shí)內(nèi)通過自發(fā)水解可從通過自發(fā)水解可從DNADNA鏈

47、上脫落約鏈上脫落約1000010000個(gè)嘌呤堿和個(gè)嘌呤堿和500500個(gè)嘧啶堿。個(gè)嘧啶堿。2 2）堿基的脫氨基作用）堿基的脫氨基作用 堿基中的胞嘧啶（C）、腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G）都含有環(huán)外氨基，氨基有時(shí)會(huì)自發(fā)脫落，從而使胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏ぃ║），腺嘌呤變?yōu)榇吸S嘌呤（I）, 鳥嘌呤變?yōu)辄S嘌呤（X）。例如，胞嘧啶自發(fā)水解脫氨變成尿嘧啶后，如果未被修復(fù)，產(chǎn)生的尿嘧啶會(huì)在接下來的復(fù)制中與腺嘌呤配對，從而產(chǎn)生點(diǎn)突變。3 3）堿基的互變異構(gòu)）堿基的互變異構(gòu) DNA中的四個(gè)堿基都可能自發(fā)地使氫原子改變位置而產(chǎn)生互變異構(gòu)體，從而使堿基的配對形式發(fā)生改變。如腺嘌呤的稀有互變異構(gòu)體與胞嘧啶配對，胸腺嘧啶的稀有互

48、變異構(gòu)體與鳥嘌呤配對。當(dāng)DNA復(fù)制時(shí)，如果模板鏈上存在著這樣形式的互變異構(gòu)體，在子鏈上就可以產(chǎn)生錯(cuò)誤，造成DNA損傷。4 4）細(xì)胞正常代謝產(chǎn)物對）細(xì)胞正常代謝產(chǎn)物對DNADNA的損傷的損傷 在所有需氧細(xì)胞中，細(xì)胞呼吸作用產(chǎn)生的副產(chǎn)物超氧陰離子（O2-）和H2O2非常活躍，由于這些超氧化物、羥基自由基（OH）等活性氧的存在，導(dǎo)致DNA在正常條件下發(fā)生氧化損傷。 2 2物理因素物理因素：l 由紫外線、電離輻射、由紫外線、電離輻射、X X射線等引起的射線等引起的DNADNA損傷。損傷。其中，其中，X X射線和電離輻射常常引起射線和電離輻射常常引起DNADNA鏈的斷裂，鏈的斷裂，而而紫外線紫外線常常引

49、起常常引起嘧啶二聚體嘧啶二聚體的形成，如的形成，如TTTT，TCTC，CCCC等二聚體。這些嘧啶二聚體由于形成了等二聚體。這些嘧啶二聚體由于形成了共價(jià)鍵連接的環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)，因而會(huì)引起復(fù)制障共價(jià)鍵連接的環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)，因而會(huì)引起復(fù)制障礙。礙。 3 3化學(xué)因素：化學(xué)因素： (1)(1)脫氨劑脫氨劑：如：如亞硝酸與亞硝酸鹽亞硝酸與亞硝酸鹽，可，可加速加速C C脫氨基脫氨基生成生成U U，A A脫氨基生成脫氨基生成I I。 (2)(2)烷基化劑烷基化劑：這是一類帶有活性烷基：這是一類帶有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起堿基或磷酸基的堿基或磷酸基的烷基化烷基化，

50、甚至可引起鄰近，甚至可引起鄰近堿基的交聯(lián)。堿基的交聯(lián)。 (3)DNA(3)DNA加合劑加合劑：如苯并芘，在體內(nèi)代謝：如苯并芘，在體內(nèi)代謝后生成后生成四羥苯并芘，與嘌呤共價(jià)結(jié)合引起四羥苯并芘，與嘌呤共價(jià)結(jié)合引起損傷。損傷。 (4)(4)堿基類似物堿基類似物：如：如5-FU5-FU，6-MP6-MP等，可等，可摻入到摻入到DNADNA分子中引起損傷或突變。分子中引起損傷或突變。 (5)(5)斷鏈劑斷鏈劑：如過氧化物，含巰基化合：如過氧化物，含巰基化合物等，可引起物等，可引起DNADNA鏈的斷裂。鏈的斷裂。 生物體內(nèi)存在多種修復(fù)途徑：生物體內(nèi)存在多種修復(fù)途徑：l光復(fù)活修復(fù)系統(tǒng)光復(fù)活修復(fù)系統(tǒng)l切除修復(fù)

51、系統(tǒng)切除修復(fù)系統(tǒng)l重組修復(fù)系統(tǒng)重組修復(fù)系統(tǒng)l錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)lSOSSOS修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)系統(tǒng)等。等。 DNADNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)是其損傷修復(fù)的分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)是其損傷修復(fù)的重要基礎(chǔ)，因?yàn)橹匾A(chǔ)，因?yàn)镈NADNA的的互補(bǔ)雙鏈互補(bǔ)雙鏈可保證其一股可保證其一股鏈上的損傷被切除后，能從另一股鏈上獲得鏈上的損傷被切除后，能從另一股鏈上獲得修復(fù)所需要的修復(fù)所需要的信息信息。 （一）光復(fù)活修復(fù)（直接修復(fù)）（一）光復(fù)活修復(fù)（直接修復(fù)）（light repairinglight repairing）：）： 這是一種廣泛存在的修復(fù)作這是一種廣泛存在的修復(fù)作用。光復(fù)活能夠修復(fù)任何嘧啶二用。光復(fù)活能夠修復(fù)任

52、何嘧啶二聚體的損傷。其修復(fù)過程為：聚體的損傷。其修復(fù)過程為：光光復(fù)活酶復(fù)活酶（photo-lyase)photo-lyase)識(shí)別嘧啶識(shí)別嘧啶二聚體并與之結(jié)合形成復(fù)合物二聚體并與之結(jié)合形成復(fù)合物在在300300600nm600nm可見光照射下，酶可見光照射下，酶獲得能量，將嘧啶二聚體的丁酰獲得能量，將嘧啶二聚體的丁酰環(huán)打開，使之完全修復(fù)環(huán)打開，使之完全修復(fù)光復(fù)活光復(fù)活酶從酶從DNADNA上解離。上解離。 （二）切除修復(fù)（二）切除修復(fù)(excision repairing)(excision repairing)： 切除修復(fù)切除修復(fù)（excision repair）需要先識(shí)別損傷部位，然后切除損

53、傷的堿基或核苷酸，用正常的堿基或核苷酸填補(bǔ)缺口，用連接酶連接切口。1 1、堿基切除修復(fù)、堿基切除修復(fù) 堿基切除修復(fù)堿基切除修復(fù)（base excision repair, BER） 是在DNA聚合酶、DNA糖苷酶、內(nèi)切酶和連接酶等參與下完成的。 DNA糖苷酶（DNA-glycosylase）可以特異性識(shí)別并將不正常的堿基水解切除，形成無堿基的AP位點(diǎn)（AP site），由AP核酸內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)附近將DNA鏈切開，然后外切酶切除包括AP位點(diǎn)在內(nèi)的DNA鏈，聚合酶填補(bǔ)單鏈缺口，最后由連接酶將鏈連接。 BER特別適合于修復(fù)較輕的堿基損傷。堿基切除修復(fù)堿基切除修復(fù)2 2、核苷酸切除修復(fù)、核苷酸切除修

54、復(fù) 核苷酸切除修復(fù)核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair, NER） 主要用來修復(fù)導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲并影響到DNA復(fù)制的損傷，如可造成DNA發(fā)生大約30o彎曲的嘧啶二聚體。 主要由5步反應(yīng)組成： 由特殊的蛋白質(zhì)探測損傷，并引發(fā)一系列蛋白質(zhì)與損傷部位的有序結(jié)合。 由特殊的內(nèi)切酶在損傷部位的兩側(cè)切開DNA鏈。 去除2個(gè)切口之間的帶有損傷的DNA片段，形成缺口。 由DNA pol填補(bǔ)缺口。 由DNA連接酶連接切口。 （三）重組修復(fù)（三）重組修復(fù)(recombination (recombination repairing)repairing)： 其過程分為三個(gè)步驟：

55、 1、復(fù)制，損傷的DNA仍然可以復(fù)制，但復(fù)制到損傷部位時(shí)，子鏈就出現(xiàn)了缺口。 2、重組，從完整的母鏈將相應(yīng)的片段移到缺口，而母鏈上形成缺口。 3、填補(bǔ)和連接，母鏈上的缺口由DNA聚合酶進(jìn)行填補(bǔ)合成，最后由DNA連接酶連接。 重組修復(fù)重組修復(fù)是是DNADNA的復(fù)制過程中所采的復(fù)制過程中所采用的一種有差錯(cuò)的修復(fù)方式。用的一種有差錯(cuò)的修復(fù)方式。 修復(fù)過修復(fù)過程中，程中，DNADNA損傷并未除去，但隨著復(fù)制損傷并未除去，但隨著復(fù)制的不斷進(jìn)行，損傷部位被逐漸稀釋，的不斷進(jìn)行，損傷部位被逐漸稀釋，實(shí)際上消除了損傷的影響。實(shí)際上消除了損傷的影響。（四）、錯(cuò)配修復(fù)（四）、錯(cuò)配修復(fù)DNA復(fù)制是一個(gè)高保真過程，但

56、其正確性畢竟不是絕對的，復(fù)制產(chǎn)物中仍會(huì)存在少數(shù)未被校出的錯(cuò)配堿基。通過對錯(cuò)配堿基的修復(fù)將使復(fù)制的精確性提高102-103倍?，F(xiàn)已在大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物中都發(fā)現(xiàn)了錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)。復(fù)制錯(cuò)配中的錯(cuò)配堿基存在于新合成的子代鏈中，錯(cuò)配修復(fù)是按模板的遺傳信息來修復(fù)錯(cuò)配堿基的。因此，該修復(fù)系統(tǒng)必須有一種能在復(fù)制叉通過之后識(shí)別模板鏈與新合成 DNA鏈的機(jī)制，以保證只從新合成的DNA鏈中去除錯(cuò)配堿基。 在大腸桿菌中主要通過對模板鏈的甲基化來區(qū)分新合成的DNA鏈。大腸桿菌中存在一種Dam甲基化酶，它通常首先對DNA模板鏈的5- GATC序列中腺嘌呤的N6位置進(jìn)行甲基化，當(dāng)復(fù)制完成后，在短暫的時(shí)間內(nèi)（幾秒或幾分鐘

57、），只有模板鏈?zhǔn)羌谆模潞铣傻逆準(zhǔn)欠羌谆?。正是子代DNA鏈中的這種暫時(shí)半甲基化，可以作為一種鏈的識(shí)別標(biāo)志，以區(qū)別模板鏈和新合成的鏈，從而使存在于GATC序列附近的復(fù)制錯(cuò)配將按親代鏈為模板進(jìn)行修復(fù)。幾分鐘后新合成鏈也將在Dam甲基化酶作用下被甲基 化，從而成為全甲基化DNA。一旦兩條鏈都被甲基化，這種錯(cuò)配修復(fù)過程幾乎不再發(fā)生。由于甲基化DNA成為識(shí)別模板鏈和新合成鏈的基礎(chǔ)，且錯(cuò)配修復(fù)發(fā)生在GATC的鄰近處，故這種修復(fù)也稱為甲基指導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)（methyl-directed mismatch repair）。 （五）（五）SOSSOS修復(fù)修復(fù)：l 這是一種在這是一種在DNADNA分子受到

58、較大范圍損傷分子受到較大范圍損傷并且使復(fù)制受到抑制時(shí)出現(xiàn)的修復(fù)機(jī)制，并且使復(fù)制受到抑制時(shí)出現(xiàn)的修復(fù)機(jī)制，以以SOSSOS借喻細(xì)胞處于危急狀態(tài)。借喻細(xì)胞處于危急狀態(tài)。l DNADNA分子受到長片段高密度損傷，使分子受到長片段高密度損傷，使DNADNA復(fù)制過程在損傷部位受到抑制。復(fù)制過程在損傷部位受到抑制。l 損傷誘導(dǎo)一種特異性較低的新的損傷誘導(dǎo)一種特異性較低的新的DNADNA聚聚合酶，以及重組酶等的產(chǎn)生。合酶，以及重組酶等的產(chǎn)生。l 由這些特異性較低的酶繼續(xù)催化損傷部由這些特異性較低的酶繼續(xù)催化損傷部位位DNADNA的復(fù)制，復(fù)制完成后，保留許多錯(cuò)的復(fù)制，復(fù)制完成后，保留許多錯(cuò)誤的堿基，從而造成突

59、變。誤的堿基，從而造成突變。 （一）、基因突變的類型（一）、基因突變的類型堿基序列發(fā)生改變的基因我們稱之為突變基因（mutant gene）。攜帶突變基因的生物個(gè)體或群體或株系通常稱為突變體（mutant）。基因沒有發(fā)生變化而表現(xiàn)正常的生物個(gè)體則稱為野生型（wild type）。突變及其在機(jī)體中的后效也可用 基 因 型 （ g e n e t y p e ） 和 表 現(xiàn) 型（phenotype）兩個(gè)術(shù)語來表述，前者用于描述突變及其所處基因；后者用于描述突變在機(jī)體中的后果。此外，按照突變生成的過程可將突變分為自發(fā)突變（spontaneous mutation）和誘發(fā)突變（induced muta

60、tion，簡稱誘變）兩種類型。由于自然界中突變劑的作用或由于偶然的復(fù)制錯(cuò)誤而產(chǎn)生的突變都屬于自發(fā)突變。由于人們使用突變劑處理生物體而產(chǎn)生突變則是誘變。從不同角度看，基因突變可以分為許多相互聯(lián)系的類別。目前人們最了解和最常見的基因突變主要有以下兩類：1 1、堿基置換突變、堿基置換突變指基因中一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)堿基被替代的突變。最簡單的堿基置換突變是點(diǎn)突變，即DNA序列上單個(gè)堿基的改變。如前述鐮刀型紅細(xì)胞貧血病人的血紅蛋白中，鏈第6為谷氨酸被纈氨酸取代，其編碼鏈DNA序列中的谷氨酸密碼子GAG被置換為纈氨酸密碼子GTG，兩者之間僅發(fā)生了一個(gè)堿基的改變。點(diǎn)突變?nèi)绻青堰逝c嘌呤之間，嘧啶與嘧啶之間發(fā)生互換