RNA生物合成講授課件

1、RNA的轉(zhuǎn)錄合成 轉(zhuǎn)錄基本特點(diǎn)（與復(fù)制的區(qū)別）轉(zhuǎn)錄基本特點(diǎn)（與復(fù)制的區(qū)別） 原核真核轉(zhuǎn)錄的異同點(diǎn)原核真核轉(zhuǎn)錄的異同點(diǎn) 轉(zhuǎn)錄的四各階段（轉(zhuǎn)錄起始：起始點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄的四各階段（轉(zhuǎn)錄起始：起始點(diǎn)的辨認(rèn)辨認(rèn)-延伸延伸-終止）終止） 原核轉(zhuǎn)錄原核轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄相關(guān)酶、啟動(dòng)子序列特征轉(zhuǎn)錄相關(guān)酶、啟動(dòng)子序列特征 真核轉(zhuǎn)錄真核轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄相關(guān)酶、啟動(dòng)子序列特征轉(zhuǎn)錄相關(guān)酶、啟動(dòng)子序列特征 原核真核轉(zhuǎn)錄的終止機(jī)制原核真核轉(zhuǎn)錄的終止機(jī)制 轉(zhuǎn)錄的抑制劑轉(zhuǎn)錄的抑制劑RNA轉(zhuǎn)錄的一般特點(diǎn) 選擇性（編碼區(qū)、個(gè)別基因）選擇性（編碼區(qū)、個(gè)別基因） 起始點(diǎn)、終止點(diǎn)（轉(zhuǎn)錄單位，是一個(gè)或多個(gè)基起始點(diǎn)、終止點(diǎn)（轉(zhuǎn)錄單位，是一個(gè)或多個(gè)基因）因）

2、RNA 聚合酶（無(wú)校正功能聚合酶（無(wú)校正功能) 模板鏈（反義鏈）編碼鏈模板鏈（反義鏈）編碼鏈 轉(zhuǎn)錄的起始由啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)錄的起始由啟動(dòng)子控制 底物底物 方向方向原核生物與真核生物轉(zhuǎn)錄的差異原核生物與真核生物轉(zhuǎn)錄的差異 一種聚合酶一種聚合酶 無(wú)內(nèi)含子無(wú)內(nèi)含子 不加工，直接翻譯不加工，直接翻譯 多順?lè)醋佣囗樂(lè)醋?轉(zhuǎn)錄翻譯相偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄翻譯相偶聯(lián) 3種種 內(nèi)含子內(nèi)含子 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需要加工轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需要加工 單順?lè)醋訂雾樂(lè)醋?轉(zhuǎn)錄翻譯的區(qū)域不同轉(zhuǎn)錄翻譯的區(qū)域不同轉(zhuǎn)錄四個(gè)階段轉(zhuǎn)錄四個(gè)階段 RNA 聚合酶識(shí)別啟動(dòng)子聚合酶識(shí)別啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始 延伸延伸 終止終止細(xì)菌細(xì)菌RNA聚合酶及其轉(zhuǎn)錄聚合酶及其轉(zhuǎn)錄 底物

3、底物 四種四種NTP 模板模板 DNA 合成方向合成方向 ：5-3 無(wú)需引物無(wú)需引物 無(wú)外切酶活性無(wú)外切酶活性 無(wú)校對(duì)功能無(wú)校對(duì)功能(一) 大腸桿菌的RNA聚合酶 原核生物的原核生物的RNARNA聚合酶由聚合酶由2 2構(gòu)成核心酶，構(gòu)成核心酶，為起始為起始因子，因子，因子引導(dǎo)因子引導(dǎo)RNARNA聚合酶穩(wěn)定地結(jié)合到聚合酶穩(wěn)定地結(jié)合到DNADNA的啟動(dòng)子上，不的啟動(dòng)子上，不同的菌種同的菌種因子的大小差別很大因子的大小差別很大, ,不同的不同的因子可以識(shí)別不同因子可以識(shí)別不同的啟動(dòng)子，的啟動(dòng)子，亞基借助疏水作用與亞基借助疏水作用與DNADNA結(jié)合結(jié)合, ,亞基是堿性蛋亞基是堿性蛋白，借助靜電作用與白，

4、借助靜電作用與DNADNA結(jié)合，結(jié)合，構(gòu)成構(gòu)成RNARNA聚合酶的催化中聚合酶的催化中心，心，亞基與啟動(dòng)子上游元件和活化因子結(jié)合，促進(jìn)酶的裝配，亞基與啟動(dòng)子上游元件和活化因子結(jié)合，促進(jìn)酶的裝配，因子參與某些基因轉(zhuǎn)錄的終止。因子參與某些基因轉(zhuǎn)錄的終止。 a a36512 決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄b b150618 聚合功能（聚合功能（被利福平抑制）被利福平抑制）b b155613 解鏈解鏈（結(jié)合（結(jié)合DNADNA模板）模板）s s70263 辨認(rèn)起始點(diǎn)辨認(rèn)起始點(diǎn)亞基亞基分子量分子量 功功 能能核 心 酶核 心 酶 ： 全 酶 脫 離全 酶 脫 離 亞 基 剩 下 的亞 基 剩 下 的

5、2 2稱(chēng)為核心酶稱(chēng)為核心酶。核心酶本身就能。核心酶本身就能催化核苷酸間磷酸二酯鍵的形成。催化核苷酸間磷酸二酯鍵的形成。 亞基亞基：是酶和底物結(jié)合的部位和催化：是酶和底物結(jié)合的部位和催化位點(diǎn)。利福平位點(diǎn)。利福平( (rifampicin)rifampicin)和利福霉素和利福霉素( (rifamycin)rifamycin)通過(guò)結(jié)合通過(guò)結(jié)合亞基，對(duì)全酶有強(qiáng)亞基，對(duì)全酶有強(qiáng)烈的抑制作用，抑制烈的抑制作用，抑制RNARNA合成的起始，但不合成的起始，但不抑制其延長(zhǎng)。抑制其延長(zhǎng)。亞基基因亞基基因rpoBrpoB突變可使細(xì)突變可使細(xì)菌對(duì)利福平有抗性。菌對(duì)利福平有抗性。這類(lèi)抗生素對(duì)真核生物無(wú)影響，醫(yī)藥上用

6、于治療革蘭氏陽(yáng)性菌感染和結(jié)核病 核心酶可以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，但是對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物核心酶可以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，但是對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物無(wú)特異性，對(duì)模板無(wú)選擇性無(wú)特異性，對(duì)模板無(wú)選擇性 全酶可以有選擇性的起始轉(zhuǎn)錄，而且無(wú)全酶可以有選擇性的起始轉(zhuǎn)錄，而且無(wú)位點(diǎn)特異性。位點(diǎn)特異性。 因子可以減少全酶對(duì)松散結(jié)合位點(diǎn)的因子可以減少全酶對(duì)松散結(jié)合位點(diǎn)的親和性，全酶與啟動(dòng)子的結(jié)合常數(shù)反映親和性，全酶與啟動(dòng)子的結(jié)合常數(shù)反映了基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)頻率，對(duì)特異位點(diǎn)的了基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)頻率，對(duì)特異位點(diǎn)的親和力由于親和力由于的存在，而提高結(jié)合常數(shù)的存在，而提高結(jié)合常數(shù)原核生物中轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的共同序列原核生物中轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的共同序列-35 序列增強(qiáng)序列增強(qiáng)因子的識(shí)

7、別作用，因子的識(shí)別作用，-10 序列對(duì)于解螺旋作用十分重要序列對(duì)于解螺旋作用十分重要研究轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)及啟動(dòng)子序列的的方法研究轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)及啟動(dòng)子序列的的方法:足跡法足跡法研究轉(zhuǎn)錄研究轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)及啟起點(diǎn)及啟動(dòng)子序列動(dòng)子序列的的方法的的方法:足跡法足跡法原核生物原核生物RNA 轉(zhuǎn)錄歷程轉(zhuǎn)錄歷程 搜索特異位點(diǎn)搜索特異位點(diǎn) 封閉型起始復(fù)合物（封閉型起始復(fù)合物（-35 形成速度，全酶的一形成速度，全酶的一種構(gòu)象形式，有助于酶與種構(gòu)象形式，有助于酶與-10序列的結(jié)合）序列的結(jié)合） 開(kāi)放型起始復(fù)合物（開(kāi)放型起始復(fù)合物（-10轉(zhuǎn)變速度，并部分解轉(zhuǎn)變速度，并部分解鏈區(qū)形成）鏈區(qū)形成） 個(gè)別基因的轉(zhuǎn)錄需要蛋白因子參與起始，

8、如個(gè)別基因的轉(zhuǎn)錄需要蛋白因子參與起始，如lac 需要需要camp-CAP 復(fù)合物結(jié)合在啟動(dòng)子上游區(qū)域復(fù)合物結(jié)合在啟動(dòng)子上游區(qū)域 DNA-酶酶-底物底物NTP 三元其實(shí)復(fù)合物的形成三元其實(shí)復(fù)合物的形成 因子在合成因子在合成9-109-10個(gè)核苷酸時(shí)脫離聚合酶（啟個(gè)核苷酸時(shí)脫離聚合酶（啟動(dòng)子清除時(shí)間）動(dòng)子清除時(shí)間）1.RNA聚合酶延聚合酶延DNA鏈移動(dòng)，識(shí)別轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)鏈移動(dòng)，識(shí)別轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)打開(kāi)螺旋，形成聚合酶打開(kāi)螺旋，形成聚合酶-DNA-RNA復(fù)合體。復(fù)合體。RNA聚合酶聚合酶搜索啟動(dòng)子序列搜索啟動(dòng)子序列-35序列緊密結(jié)合，序列緊密結(jié)合，-10序列結(jié)合，序列結(jié)合，-10序列處局部解鏈序列處局部解鏈全酶

9、與啟動(dòng)子形成開(kāi)放型起始復(fù)合物，即封閉型復(fù)合物構(gòu)象變化而來(lái)全酶與啟動(dòng)子形成開(kāi)放型起始復(fù)合物，即封閉型復(fù)合物構(gòu)象變化而來(lái)核心酶功能 核心酶：全酶脫離核心酶：全酶脫離亞基剩下的亞基剩下的2稱(chēng)為核稱(chēng)為核心酶。心酶。 亞基的亞基的265位的精氨酸對(duì)于啟動(dòng)子上游識(shí)別很位的精氨酸對(duì)于啟動(dòng)子上游識(shí)別很重要，協(xié)助重要，協(xié)助亞基與啟動(dòng)子的結(jié)合亞基與啟動(dòng)子的結(jié)合 亞基功能：具有與模板鏈、新生亞基功能：具有與模板鏈、新生RNA鏈、及鏈、及底物底物NTP的結(jié)合能力，催化鏈延伸，新鍵形成，的結(jié)合能力，催化鏈延伸，新鍵形成，對(duì)利福平敏感對(duì)利福平敏感 聚合酶呈堿性，帶正電荷，聚合酶呈堿性，帶正電荷，新生RNA 鏈的延伸 亞基

10、脫離，進(jìn)入鏈延伸階段亞基脫離，進(jìn)入鏈延伸階段 全酶構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)楹诵拿?，（延伸靜止全酶構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)楹诵拿?，（延伸靜止-跳跳躍躍-延伸，每次延伸，每次6-7個(gè)核苷酸）個(gè)核苷酸） 加入到加入到3-OH端，雜和雙鏈的長(zhǎng)度約端，雜和雙鏈的長(zhǎng)度約12bp, 速度影響因素：聚合酶種類(lèi)、模板鏈的速度影響因素：聚合酶種類(lèi)、模板鏈的特殊序列、（暫停信號(hào)如特殊序列、（暫停信號(hào)如GC反向重復(fù)反向重復(fù)序列序列)其他因素，競(jìng)爭(zhēng)性類(lèi)似物，調(diào)節(jié)因其他因素，競(jìng)爭(zhēng)性類(lèi)似物，調(diào)節(jié)因素等）素等）反響重復(fù)序列有回文結(jié)構(gòu)區(qū)，但不富含有回文結(jié)構(gòu)區(qū)，但不富含C，回文結(jié)構(gòu)后也無(wú)寡聚，回文結(jié)構(gòu)后也無(wú)寡聚U依賴(lài)于依賴(lài)于RNA的的RNA酶活力，具解旋酶

11、活性，促進(jìn)雜和雙鏈的解聚合酶活力，具解旋酶活性，促進(jìn)雜和雙鏈的解聚合結(jié)合于結(jié)合于新生鏈，新生鏈，聚合酶聚合酶遇到特遇到特異結(jié)構(gòu)異結(jié)構(gòu)時(shí)，速時(shí)，速度下降，度下降，終止因終止因子追上，子追上，解螺旋解螺旋抗終止作用 噬菌體中，后期基因的表達(dá)是噬菌體中，后期基因的表達(dá)是RNA 鏈延鏈延長(zhǎng)引起的，因?yàn)樵缙诨蚓幋a抗終止長(zhǎng)引起的，因?yàn)樵缙诨蚓幋a抗終止因子，使因子，使RNA 聚合酶可以越過(guò)終止子而聚合酶可以越過(guò)終止子而使得后期表達(dá)基因獲得轉(zhuǎn)錄。使得后期表達(dá)基因獲得轉(zhuǎn)錄。 識(shí)別終止子需要特定的蛋白因子，識(shí)別終止子需要特定的蛋白因子，Nus因因子，是抗終止蛋白因子的一種，與子，是抗終止蛋白因子的一種，與因因

12、子作用）子作用）。 （真核生物的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)知之甚少）（真核生物的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)知之甚少）T7RNA聚合酶 噬菌體的聚合酶，只有一條多肽鏈，不噬菌體的聚合酶，只有一條多肽鏈，不易受調(diào)控，具有完整的功能，用于原核易受調(diào)控，具有完整的功能，用于原核生物體外表達(dá)系統(tǒng)生物體外表達(dá)系統(tǒng) 有利于研究有利于研究RNA聚合酶的作用機(jī)制聚合酶的作用機(jī)制 用于構(gòu)建用于構(gòu)建RNA原核表達(dá)載體系統(tǒng)原核表達(dá)載體系統(tǒng)真核生物的轉(zhuǎn)錄真核生物的轉(zhuǎn)錄幾個(gè)重要的概念幾個(gè)重要的概念 1、順式作用元件、順式作用元件（cis-acting element） 與結(jié)構(gòu)基因連鎖、并調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)與結(jié)構(gòu)基因連鎖、并調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因表達(dá) 的的DNA

13、序列。序列。 2、反式作用因子（、反式作用因子（trans-acting factor） 能與能與順式作用元件直接或間接辨認(rèn)、結(jié)合的順式作用元件直接或間接辨認(rèn)、結(jié)合的蛋白質(zhì)的總稱(chēng)。蛋白質(zhì)的總稱(chēng)。 3、轉(zhuǎn)錄因子（、轉(zhuǎn)錄因子（transcriptional factor):直接或直接或間接結(jié)合間接結(jié)合RNA聚合酶的反式作用因子。聚合酶的反式作用因子。轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)TATA盒盒CAAT盒盒GC盒盒 增強(qiáng)子增強(qiáng)子順式作用元件順式作用元件(cis-acting element)1. 轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段 AATAAA切離加尾切離加尾 轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn) 修飾點(diǎn)修飾點(diǎn) 外顯子外

14、顯子 翻譯起始點(diǎn)翻譯起始點(diǎn)內(nèi)內(nèi)含含子子 OCT-1 OCT-1：ATTTGCAT八聚體八聚體真核轉(zhuǎn)錄特點(diǎn) 單順?lè)醋訂雾樂(lè)醋?相對(duì)獨(dú)立而又相聯(lián)系的復(fù)雜調(diào)控系相對(duì)獨(dú)立而又相聯(lián)系的復(fù)雜調(diào)控系統(tǒng)統(tǒng) 3種酶種酶 各司其職各司其職 多種蛋白因子參與多種蛋白因子參與 順式作用原件更復(fù)雜順式作用原件更復(fù)雜 轉(zhuǎn)錄調(diào)控以正調(diào)控為主（多種蛋白因子協(xié)同促轉(zhuǎn)錄調(diào)控以正調(diào)控為主（多種蛋白因子協(xié)同促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，多因子共同存在時(shí)，激活轉(zhuǎn)錄）進(jìn)轉(zhuǎn)錄，多因子共同存在時(shí)，激活轉(zhuǎn)錄） 真核生物的轉(zhuǎn)錄終止：編碼鏈上存在轉(zhuǎn)錄終止真核生物的轉(zhuǎn)錄終止：編碼鏈上存在轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)的修飾點(diǎn)AATAAA，三種聚合酶分別識(shí)別不同，三種聚合酶分別識(shí)別不

15、同的終止序列的終止序列 真核生物的RNA聚合酶1對(duì)-鵝膏蕈堿不敏感，轉(zhuǎn)錄45S rRNA前體，經(jīng)加工產(chǎn)生5.8S rRNA，18S rRNA 和28S rRNA； RNA聚合酶對(duì)-鵝膏蕈堿敏感，轉(zhuǎn)錄編碼蛋白質(zhì)的基因和大多數(shù)snRNA；RNA聚合酶 對(duì)-鵝膏蕈堿中等敏感，轉(zhuǎn)錄小RNA，包括tRNA，5S rRNA， snRNA和scRNA 。真核轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)系統(tǒng) 爪蟾卵母細(xì)胞系統(tǒng)爪蟾卵母細(xì)胞系統(tǒng) 轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因系統(tǒng) 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)轉(zhuǎn)染系統(tǒng) 體外系統(tǒng)體外系統(tǒng) 純化組分試驗(yàn)純化組分試驗(yàn) 檢測(cè)真核生物基因的轉(zhuǎn)錄活性，確定啟動(dòng)子功能所必檢測(cè)真核生物基因的轉(zhuǎn)錄活性，確定啟動(dòng)子功能所必需的序列，從而發(fā)現(xiàn)與啟動(dòng)子結(jié)合

16、的相關(guān)蛋白因子。需的序列，從而發(fā)現(xiàn)與啟動(dòng)子結(jié)合的相關(guān)蛋白因子。轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的測(cè)定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的測(cè)定雜交分析法雜交分析法 短時(shí)間標(biāo)記后分析產(chǎn)物短時(shí)間標(biāo)記后分析產(chǎn)物RNA組成組成引物延伸法引物延伸法 隨機(jī)合成的短的隨機(jī)合成的短的20個(gè)個(gè)BP的標(biāo)記核苷酸，以的標(biāo)記核苷酸，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄，測(cè)定產(chǎn)物的延伸的長(zhǎng)度即可知道轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)為模板，逆轉(zhuǎn)錄，測(cè)定產(chǎn)物的延伸的長(zhǎng)度即可知道轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)S1核酸酶圖譜技術(shù)核酸酶圖譜技術(shù)相對(duì)轉(zhuǎn)錄速度測(cè)定相對(duì)轉(zhuǎn)錄速度測(cè)定不同基因轉(zhuǎn)錄速度不同不同基因轉(zhuǎn)錄速度不同 P238脈沖標(biāo)記脈沖標(biāo)記 測(cè)定分析測(cè)定分析測(cè)定特定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的測(cè)定特定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA占總占總RNA的比例。的比

17、例。 真核細(xì)胞的真核細(xì)胞的RNA聚合酶的性質(zhì)與大腸桿菌聚合酶的性質(zhì)與大腸桿菌RNA聚合酶的性聚合酶的性質(zhì)相似。但真核細(xì)胞中的質(zhì)相似。但真核細(xì)胞中的RNA聚合酶可能有三類(lèi)，各類(lèi)酶的聚合酶可能有三類(lèi)，各類(lèi)酶的分子量大致為分子量大致為50萬(wàn)左右，它們分別負(fù)責(zé)不同萬(wàn)左右，它們分別負(fù)責(zé)不同RNA的合成。其的合成。其作用和存在位置見(jiàn)下表：分別含有作用和存在位置見(jiàn)下表：分別含有14-17個(gè)亞基個(gè)亞基 RNA聚合酶聚合酶 所合成的所合成的RNA（前體）（前體） 在細(xì)胞內(nèi)的分布在細(xì)胞內(nèi)的分布 rRNA(5.8S,18S,28S)mRNAtRNA和和5SRNA 核仁核仁 核質(zhì)核質(zhì) 核質(zhì)核質(zhì) 表表12-4 真核細(xì)胞

18、真核細(xì)胞RNA聚合酶聚合酶 線粒體和葉綠體也有線粒體和葉綠體也有DNADNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的RNARNA聚合酶。所有這些聚合聚合酶。所有這些聚合酶都有類(lèi)似酶都有類(lèi)似的起始因子和與大腸桿菌的起始因子和與大腸桿菌RNARNA聚合酶類(lèi)似的使聚合酶類(lèi)似的使RNARNA鏈延伸的方式。鏈延伸的方式。 u 真核細(xì)胞的真核細(xì)胞的RNARNA聚合酶聚合酶酶類(lèi)酶類(lèi)分布分布產(chǎn)物產(chǎn)物- -鵝膏蕈堿鵝膏蕈堿對(duì)酶的作用對(duì)酶的作用分子量分子量反應(yīng)條件反應(yīng)條件I核仁核仁核質(zhì)核質(zhì)核質(zhì)核質(zhì)rRNA5.8SrRNA18SrRNA28SrRNAmRNAtRNA 5SrRNA不抑制不抑制低濃度抑制低濃度抑制高濃度抑制高濃度抑制500 00

19、0700 000700 000_低離子強(qiáng)度低離子強(qiáng)度,要要求求Mg2+或或Mn2+高離子強(qiáng)度高離子強(qiáng)度高高M(jìn)n2+濃度濃度真核細(xì)胞的真核細(xì)胞的RNA聚合酶特點(diǎn)聚合酶特點(diǎn) 結(jié)構(gòu)復(fù)雜結(jié)構(gòu)復(fù)雜 空間結(jié)構(gòu)相似（與原核類(lèi)似）空間結(jié)構(gòu)相似（與原核類(lèi)似） 3種酶具有幾種共同亞基種酶具有幾種共同亞基 核心亞基（酶活性相關(guān)）、共同亞基核心亞基（酶活性相關(guān)）、共同亞基（參與底物（參與底物NTP的定位，在模板滑動(dòng)）、的定位，在模板滑動(dòng)）、非必須亞基（相對(duì)的）非必須亞基（相對(duì)的）2 真核生物的啟動(dòng)子真核生物的啟動(dòng)子三種三種 RNApol 三種轉(zhuǎn)錄方式三種轉(zhuǎn)錄方式 三種啟動(dòng)子三種啟動(dòng)子 三類(lèi)基因，三類(lèi)基因，類(lèi)類(lèi) 類(lèi)類(lèi)

20、類(lèi)類(lèi) 與原核的啟動(dòng)子的區(qū)別：與原核的啟動(dòng)子的區(qū)別：（1）多種元件：）多種元件：TATA框，框，GC框，框，CATT框，框，OCT（octamer,八聚體基序元件）等；八聚體基序元件）等；（2）不同元件的組合情況：位置、序列、距離和方向都不完全）不同元件的組合情況：位置、序列、距離和方向都不完全相同；相同；（3）需轉(zhuǎn)錄因子參與轉(zhuǎn)錄的全過(guò)程。轉(zhuǎn)錄因子先和啟動(dòng)子結(jié)合，）需轉(zhuǎn)錄因子參與轉(zhuǎn)錄的全過(guò)程。轉(zhuǎn)錄因子先和啟動(dòng)子結(jié)合，再與再與RNA聚合酶一起形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的聚合酶一起形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的過(guò)程。過(guò)程。 類(lèi)型基因啟動(dòng)子 RNA 聚合酶聚合酶1的啟動(dòng)子，的啟動(dòng)子， 物種間差異大，

21、物種間差異大，同種拷貝間的啟動(dòng)子序列基本相同同種拷貝間的啟動(dòng)子序列基本相同 核心啟動(dòng)子：核心啟動(dòng)子：-45-+20，上游控制元件，上游控制元件-180 -107，2.2 RNA pol啟動(dòng)子 核心啟動(dòng)子（核心啟動(dòng)子（core promoter）或核心元件：）或核心元件： 位于位于-45到到+20，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的起始。，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的起始。 上游控制元件（上游控制元件（upstream control element UCE）：）： -180到到-107，增加核心元件轉(zhuǎn)錄起始效率。，增加核心元件轉(zhuǎn)錄起始效率。 兩個(gè)區(qū)域都有兩個(gè)區(qū)域都有G.C豐富區(qū)（含量達(dá)豐富區(qū)（含量達(dá)85%）。）。 100 70 50

22、30 10 1GGGCGGGGTCAATCTTATATAT轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)GC boxCAAT boxTATA box真核真核IIII類(lèi)啟動(dòng)子類(lèi)啟動(dòng)子真核II類(lèi)啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)TATA box: -25-30 決定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的選擇決定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的選擇GC box : -40 -110 CAAT box: -70 -80 決定轉(zhuǎn)錄起始的頻率決定轉(zhuǎn)錄起始的頻率保守性高保守性高 2.1 RNApol的啟動(dòng)子的啟動(dòng)子 通用型啟動(dòng)子（無(wú)組織特異性）通用型啟動(dòng)子（無(wú)組織特異性） 結(jié)構(gòu)最復(fù)雜結(jié)構(gòu)最復(fù)雜 位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游 有多個(gè)短序列元件組成有多個(gè)短序列元件組成 （1） 帽子位點(diǎn)（帽子

23、位點(diǎn)（cap site）：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)）：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 與與Prok.的相似的相似 ，多為多為A（2） TATA框（框（Hogness 框或框或 Goldberg-Hogness 框）框）結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 位于位于30處處 一致序列為一致序列為T(mén)82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）功能：功能： 定位轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)定位轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) （類(lèi)似原核的（類(lèi)似原核的Pribnow框）框）TATA是絕大多數(shù)真核基因的正確表達(dá)所必需的是絕大多數(shù)真核基因的正確表達(dá)所必需的故也稱(chēng)為選擇子（故也稱(chēng)為選擇子（selector） （3） CAAT框（框（CAAT box） 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 位

24、于位于75bp處處 一致序列為一致序列為GGC/TCAATCT功能：功能： 前兩個(gè)前兩個(gè) G 的作用十分重要的作用十分重要(轉(zhuǎn)錄效率轉(zhuǎn)錄效率) 增強(qiáng)啟動(dòng)子的效率、頻率，不影響啟動(dòng)子的特異性增強(qiáng)啟動(dòng)子的效率、頻率，不影響啟動(dòng)子的特異性 （距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離，正反方向）（距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離，正反方向） 以上三個(gè)保守序列在絕大多數(shù)啟動(dòng)子中都存在以上三個(gè)保守序列在絕大多數(shù)啟動(dòng)子中都存在（4） GC框框 （GC box） 位于位于90附近，較常見(jiàn)的成分附近，較常見(jiàn)的成分 核心序列為核心序列為GGGCGG 可有多個(gè)拷貝，也可以正反兩方向排列可有多個(gè)拷貝，也可以正反兩方向排列（5）其他元件）其他元件 八聚核

25、苷酸元件（八聚核苷酸元件（octamer element OCT元件）元件） 一致序列為一致序列為 ATTTGCAT KB元件元件 一致序列為一致序列為 GGGACTTTCC ATF元件元件 一致序列為一致序列為 GTGACGT 還有一些位于起始點(diǎn)下游的相關(guān)元件還有一些位于起始點(diǎn)下游的相關(guān)元件(6) 起始子（起始子（initiator，Inr）：）： 位于起始點(diǎn)位于起始點(diǎn) -3+5 Py2CAPy5構(gòu)成，構(gòu)成， 可能提供可能提供RNA pol 識(shí)別。識(shí)別。 當(dāng)有的基因缺少當(dāng)有的基因缺少TATA框時(shí)，可能由框時(shí)，可能由Inr來(lái)替代它來(lái)替代它的作用，的作用， 無(wú)論無(wú)論TATA是否存在，是否存在，I

26、nr對(duì)于啟動(dòng)子的強(qiáng)度和起對(duì)于啟動(dòng)子的強(qiáng)度和起始位點(diǎn)的選擇都是十分重要的始位點(diǎn)的選擇都是十分重要的 。2.3 RNApol 啟動(dòng)子 1）基因內(nèi)啟動(dòng)子）基因內(nèi)啟動(dòng)子/下游啟動(dòng)子下游啟動(dòng)子 /內(nèi)部控制區(qū)內(nèi)部控制區(qū) 由由RNApol 識(shí)別（大多數(shù)為基因內(nèi)啟動(dòng)子）（上游序列識(shí)別（大多數(shù)為基因內(nèi)啟動(dòng)子）（上游序列切除后，仍可以轉(zhuǎn)錄）切除后，仍可以轉(zhuǎn)錄） 型型 ：5SrRNA基因啟動(dòng)子基因啟動(dòng)子 型：型：tRNA基因啟動(dòng)子基因啟動(dòng)子 2）基因外啟動(dòng)子（轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游啟動(dòng)子，）基因外啟動(dòng)子（轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游啟動(dòng)子，） 由由pol或者或者pol 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 III型：型： snRNA基因基因 3） 混合型啟動(dòng)子混合型啟

27、動(dòng)子 基因內(nèi)啟動(dòng)子 起始位點(diǎn) boxA boxC 基因內(nèi)啟動(dòng)子 boxA boxB 基因外啟動(dòng)子 OCT PSE TATA 圖 12-23 真核 RNA Pol 的基因內(nèi)啟動(dòng)子和基因外啟動(dòng)子 I 型：型：II 型型III型型類(lèi)型類(lèi)型基因的轉(zhuǎn)錄因子及起始復(fù)基因的轉(zhuǎn)錄因子及起始復(fù)合物合物 通用型轉(zhuǎn)錄因子（作用于基本啟動(dòng)子）通用型轉(zhuǎn)錄因子（作用于基本啟動(dòng)子） 基因特異性轉(zhuǎn)錄因子基因特異性轉(zhuǎn)錄因子 基本轉(zhuǎn)錄因子、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基本轉(zhuǎn)錄因子、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與參與RNA-pol轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄的TF 蛋蛋白白激激酶酶活活性性，使使CTD磷磷酸酸化化TFHATPase57（a a） 34（b b）TFE解解

28、螺螺旋旋酶酶30，74TFF促促進(jìn)進(jìn)RNA-pol結(jié)結(jié)合合及及作作為為其其他他因因子子結(jié)結(jié)合合的的橋橋梁梁33TFB穩(wěn)穩(wěn)定定TFD-DNA復(fù)復(fù)合合物物12，19，35TFA輔輔助助TBP-DNA結(jié)結(jié)合合TAF*結(jié)結(jié)合合TATA盒盒TBP* 38TFD功功能能亞亞基基組組成成，分分子子量量(kD)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄因因子子蛋蛋白白激激酶酶活活性性，使使CTD磷磷酸酸化化TFHATPase57（a a） 34（b b）TFE解解螺螺旋旋酶酶30，74TFF促促進(jìn)進(jìn)RNA-pol結(jié)結(jié)合合及及作作為為其其他他因因子子結(jié)結(jié)合合的的橋橋梁梁33TFB穩(wěn)穩(wěn)定定TFD-DNA復(fù)復(fù)合合物物12，19，35TFA輔輔助助T

29、BP-DNA結(jié)結(jié)合合TAF*結(jié)結(jié)合合TATA盒盒TBP* 38TFD功功能能亞亞基基組組成成，分分子子量量(kD)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄因因子子TBP=TATA box3. 轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物(pre-initiation complex, PIC) 真核生物真核生物RNA-pol不與不與DNA分子直接結(jié)分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子。 真核生物RNA聚合酶前轉(zhuǎn)錄復(fù)合物TFD是包含TATA結(jié)合蛋白(TATA-binding protein,TBP)和多種TBP聯(lián)結(jié)因子(TBP-associated factor,TAF)的寡聚蛋白，可以與RNA聚合酶的C端相互作

30、用。TFB有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)結(jié)合TBP。另一個(gè)可以引進(jìn)TFF/pol復(fù)合物TFF有ATP酶，解螺旋酶，激酶等多種活性，可以使RNA聚合酶大亞基的C端磷酸化，引起構(gòu)像變化，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。還可以參與DNA損傷的修復(fù)。E和H促進(jìn)除F以外的其他轉(zhuǎn)錄因子脫落，使轉(zhuǎn)錄由起始階段進(jìn)入延伸階段。黃色為T(mén)ATA box的糖磷酸骨架，堿基對(duì)為紅色，相鄰的DNA片段為藍(lán)色，馬鞍形的TBP（綠色）結(jié)合在DNA的小溝，使小溝擴(kuò)大，并使DNA軸彎曲約100o，使TATA序列解旋。TFD雜聚體的其它組分位于TBP上方，像騎在馬鞍上的牛仔。所有真核生物的基因均依賴(lài)于TBP。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成TFA協(xié)助TFD上的TBP結(jié)合到TA

31、TA框TFB 結(jié)合到動(dòng)態(tài)的瞬時(shí)復(fù)合物上RNA聚合酶與TFF 預(yù)先結(jié)合后，再結(jié)合至復(fù)合物上TFE 和TFH 進(jìn)入復(fù)合物，使之轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘钠鹗紡?fù)合物， TFF的解旋酶活性促進(jìn)DNA解旋進(jìn)入延伸階段 CTD 是RNA聚合酶的最大亞基的C末端，有7個(gè)氨基酸肽段的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)，可以發(fā)生磷酸化， CTD 重復(fù)序列的磷酸化對(duì)于轉(zhuǎn)錄的起始和延伸有調(diào)節(jié)作用， CTD 重復(fù)序列的磷酸化可以影響RNA聚合酶與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用 CTD 重復(fù)序列的磷酸化可能是轉(zhuǎn)錄起始邁向延伸的開(kāi)關(guān)類(lèi)型、類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄因子及其轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物類(lèi)型類(lèi)型基因的轉(zhuǎn)錄因子基因的轉(zhuǎn)錄因子 組分選擇因子組分選擇因子SL-1,單獨(dú)不與啟動(dòng)子結(jié)合，與單獨(dú)

32、不與啟動(dòng)子結(jié)合，與RNA聚合酶聚合酶結(jié)合后增強(qiáng)其與上游控制元件結(jié)合后增強(qiáng)其與上游控制元件（UCE）的結(jié)合力）的結(jié)合力 UBF (上游結(jié)合因子上游結(jié)合因子) 與核心啟動(dòng)子結(jié)合，啟動(dòng)與核心啟動(dòng)子結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 涉及的轉(zhuǎn)錄因子涉及的轉(zhuǎn)錄因子TFA, TFB, TFC TFA是具有典型的鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，與是具有典型的鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，與DNA結(jié)結(jié)合，（合，（P257） 鋅指（鋅指（zinc finger）：一種常出現(xiàn)在）：一種常出現(xiàn)在DNA結(jié)結(jié)合蛋白中的一種結(jié)構(gòu)基元。是由一個(gè)含有合蛋白中的一種結(jié)構(gòu)基元。是由一個(gè)含有大約大約30個(gè)氨基酸的環(huán)和一個(gè)與環(huán)上的個(gè)氨基酸的環(huán)和一個(gè)與環(huán)上的4個(gè)個(gè)Cys或或2個(gè)個(gè)Cy

33、s和和2個(gè)個(gè)His配位的配位的Zn2構(gòu)成，形構(gòu)成，形成的結(jié)構(gòu)像手指狀。成的結(jié)構(gòu)像手指狀。鋅指結(jié)構(gòu)指的是在很多蛋白中存在的一類(lèi)具鋅指結(jié)構(gòu)指的是在很多蛋白中存在的一類(lèi)具有指狀結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域，這些具有鋅指結(jié)構(gòu)的有指狀結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域，這些具有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白大多都是與基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)的功能蛋白。蛋白大多都是與基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)的功能蛋白。 4 4、RNARNA生物合成的抑制劑生物合成的抑制劑（1 1）嘌呤和嘧啶類(lèi)似物：）嘌呤和嘧啶類(lèi)似物：人工合成的堿基類(lèi)似物能人工合成的堿基類(lèi)似物能夠抑制和干擾核酸的合成。如夠抑制和干擾核酸的合成。如NNNHNNH2NH2SHSH作為代謝拮抗物抑制作為代謝拮抗物抑制合成酶類(lèi)

34、或直接摻到核酸合成酶類(lèi)或直接摻到核酸分子中，形成異常分子中，形成異常RNA或或DNA。NNNHNNH2NH2NNNHNNH2NH2OHNNHNHOOFNNNHNNH2NH2SH（2 2）DNADNA模板功能的抑制物：模板功能的抑制物：可以與可以與DNADNA模模板結(jié)合，抑制其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄板結(jié)合，抑制其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄（1 1）烷化劑：）烷化劑：使使DNADNA發(fā)生烷基化，發(fā)生在發(fā)生烷基化，發(fā)生在G-NG-N7 7，A-NA-N1 1、N N3 3 N N7 7 ；C-NC-N1 1。易引起嘌呤的水解，在易引起嘌呤的水解，在DNADNA上留下空隙干擾上留下空隙干擾復(fù)制或轉(zhuǎn)錄；或引起堿基錯(cuò)配。復(fù)制或轉(zhuǎn)錄；

35、或引起堿基錯(cuò)配。（2 2）放線菌素：）放線菌素：放線菌素放線菌素D D與與DNADNA形成非共價(jià)的復(fù)合物，形成非共價(jià)的復(fù)合物，抑制其模板功能（低濃度抑制轉(zhuǎn)錄，較高濃度抑制復(fù)抑制其模板功能（低濃度抑制轉(zhuǎn)錄，較高濃度抑制復(fù)制）。具有類(lèi)似作用的還有色霉素制）。具有類(lèi)似作用的還有色霉素A A3 3 、橄欖霉素、光橄欖霉素、光神霉素。神霉素。（3 3）嵌入染料：）嵌入染料：可插入雙鏈可插入雙鏈DNADNA分子相鄰的堿基對(duì)之間，分子相鄰的堿基對(duì)之間，一般具有芳香族發(fā)色團(tuán)。溴化乙錠（一般具有芳香族發(fā)色團(tuán)。溴化乙錠（EBEB）是一種高靈敏是一種高靈敏的熒光試劑，常用來(lái)檢測(cè)的熒光試劑，常用來(lái)檢測(cè)DNADNA和和

36、RNARNA。與與DNADNA結(jié)合后抑制結(jié)合后抑制其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。（3 3）RNARNA聚合酶抑制物聚合酶抑制物（1 1）利福霉素：）利福霉素：抑制細(xì)菌抑制細(xì)菌RNARNA聚合酶活性聚合酶活性。利福平可利福平可以高效抑制結(jié)核桿菌，殺死麻瘋桿菌，在體外有抗病以高效抑制結(jié)核桿菌，殺死麻瘋桿菌，在體外有抗病毒作用。毒作用。（2 2）利鏈霉素：與細(xì)菌）利鏈霉素：與細(xì)菌RNARNA聚合酶聚合酶b b亞基結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄亞基結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程中過(guò)程中RNARNA鏈的延長(zhǎng)反應(yīng)。鏈的延長(zhǎng)反應(yīng)。（3 3）a a- -鵝膏蕈堿：抑制真核生物鵝膏蕈堿：抑制真核生物RNARNA聚合酶活性。聚合酶活性。6 6

37、、轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)節(jié)：轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)在遺傳信息的表達(dá)中占有、轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)節(jié)：轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)在遺傳信息的表達(dá)中占有非常重要的地位，其調(diào)控主要發(fā)生在起始和終止階段。非常重要的地位，其調(diào)控主要發(fā)生在起始和終止階段。 啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄起始的控制部位，通常轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的結(jié)合啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄起始的控制部位，通常轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的結(jié)合位點(diǎn)存在于啟動(dòng)子內(nèi)部或啟動(dòng)子附近。當(dāng)調(diào)節(jié)因子（位點(diǎn)存在于啟動(dòng)子內(nèi)部或啟動(dòng)子附近。當(dāng)調(diào)節(jié)因子（RNARNA或蛋白或蛋白質(zhì)）與質(zhì)）與DNADNA結(jié)合后對(duì)轉(zhuǎn)錄或是促進(jìn)作用（正調(diào)控），或是起抑制結(jié)合后對(duì)轉(zhuǎn)錄或是促進(jìn)作用（正調(diào)控），或是起抑制作用（負(fù)調(diào)控）。作用（負(fù)調(diào)控）。 Monod Monod 和和

38、JacobJacob所建立的操縱子模型（所建立的操縱子模型（operon structural operon structural modelmodel）是基因在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的一個(gè)顯著例子。所謂操縱子是）是基因在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的一個(gè)顯著例子。所謂操縱子是指細(xì)菌基因表達(dá)和調(diào)控的單位，它包括結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因和指細(xì)菌基因表達(dá)和調(diào)控的單位，它包括結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因和由調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物所識(shí)別的控制序列。通常在功能上彼此有關(guān)的由調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物所識(shí)別的控制序列。通常在功能上彼此有關(guān)的編碼基因串聯(lián)在一起，有共同的啟動(dòng)子，并受操縱基因的控制編碼基因串聯(lián)在一起，有共同的啟動(dòng)子，并受操縱基因的控制（祥見(jiàn)后面的代謝調(diào)節(jié)）。（