堿裂解法從Ecoli中制備質(zhì)粒DNA

1、1質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA制備制備2一、質(zhì)粒簡介一、質(zhì)粒簡介l質(zhì)粒是細菌內(nèi)獨立于染色體并能自我復(fù)制質(zhì)粒是細菌內(nèi)獨立于染色體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀的小環(huán)狀DNADNA分子分子 l其大小范圍從其大小范圍從lkblkb至至200kb200kb以上不等。以上不等。l已經(jīng)在形形色色的細菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒已經(jīng)在形形色色的細菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒. .l這些質(zhì)粒都是獨立于細菌染色體之外進行這些質(zhì)粒都是獨立于細菌染色體之外進行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。 3l質(zhì)粒通過細菌間的接合作用，從雄性體轉(zhuǎn)質(zhì)粒通過細菌間的接合作用，從雄性體轉(zhuǎn)移到雌性體，是細菌有性繁殖的性因子移到雌性體，是細菌有性繁殖的性因

2、子l1946年，年， Lederburg和和Fatum發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)的F因因子是最早發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒，子是最早發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒，F(xiàn)因子與高等生物因子與高等生物細胞質(zhì)中的染色體外遺傳單位極為相似。細胞質(zhì)中的染色體外遺傳單位極為相似。l 1952年，由年，由Lederburg正式命名為質(zhì)粒。正式命名為質(zhì)粒。 4l確切地說，質(zhì)粒是細菌內(nèi)的共生型遺傳確切地說，質(zhì)粒是細菌內(nèi)的共生型遺傳因子，它能在細菌中垂直遺傳并且賦予因子，它能在細菌中垂直遺傳并且賦予宿主細胞表型，是比病毒更簡單的原始宿主細胞表型，是比病毒更簡單的原始生命。生命。5l質(zhì)粒質(zhì)粒依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)來進行依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)來進行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。通

3、常，質(zhì)粒含有編碼某些酶復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。通常，質(zhì)粒含有編碼某些酶的基因，這些酶事實上在一定的環(huán)境下對的基因，這些酶事實上在一定的環(huán)境下對細菌宿主有利。細菌宿主有利。l由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括對抗生素的抗性、由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括對抗生素的抗性、產(chǎn)抗生素、降解復(fù)雜有機化合物，以及產(chǎn)產(chǎn)抗生素、降解復(fù)雜有機化合物，以及產(chǎn)生大腸桿菌素、腸毒素及限制酶與修飾酶生大腸桿菌素、腸毒素及限制酶與修飾酶等等。等等。6l質(zhì)粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表質(zhì)粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的重要媒介物，這種基因運載工具在基達的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值，而質(zhì)粒因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值

4、，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實驗的分離與提取則是最常用、最基本的實驗技術(shù)技術(shù) 7二、二、質(zhì)粒特性質(zhì)粒特性81. 分子相對小分子相對小 l 在在5kb5kb左右，質(zhì)粒較小，比較穩(wěn)定，左右，質(zhì)粒較小，比較穩(wěn)定，不易受物理因素的損傷，此外，較小不易受物理因素的損傷，此外，較小的質(zhì)粒一般有較高的拷貝數(shù)。的質(zhì)粒一般有較高的拷貝數(shù)。92. 含有高效的自主復(fù)制成分含有高效的自主復(fù)制成分l質(zhì)粒的復(fù)制與宿主細胞的繁殖不相關(guān)，在質(zhì)粒的復(fù)制與宿主細胞的繁殖不相關(guān)，在抑制細菌蛋白質(zhì)合成時，細菌染色體抑制細菌蛋白質(zhì)合成時，細菌染色體DNADNA停止復(fù)制，但這種質(zhì)?？衫^續(xù)利用細菌原停止復(fù)制，但這種質(zhì)?？衫^續(xù)利

5、用細菌原有的酶系進行復(fù)制有的酶系進行復(fù)制 10l質(zhì)粒含有復(fù)制起始點，此起始點及順式作質(zhì)粒含有復(fù)制起始點，此起始點及順式作用調(diào)控元件組成一個復(fù)制子用調(diào)控元件組成一個復(fù)制子(replicon)(replicon)，能利用細菌染色體能利用細菌染色體DNADNA復(fù)制所用的同一套復(fù)制所用的同一套酶系統(tǒng)，在細菌細胞中獨立地進行自我復(fù)酶系統(tǒng)，在細菌細胞中獨立地進行自我復(fù)制及轉(zhuǎn)錄。制及轉(zhuǎn)錄。11l根據(jù)所含復(fù)制起始區(qū)的不同，有些質(zhì)粒的根據(jù)所含復(fù)制起始區(qū)的不同，有些質(zhì)粒的復(fù)制與宿主細胞染色體的復(fù)制同步，每個復(fù)制與宿主細胞染色體的復(fù)制同步，每個細胞只含有一個或幾個拷貝的質(zhì)粒，即處細胞只含有一個或幾個拷貝的質(zhì)粒，即處

6、于于“嚴密控制嚴密控制”。12l有些質(zhì)粒則處于有些質(zhì)粒則處于“松弛控制松弛控制”，每個細胞，每個細胞可含達可含達15-2015-20乃至數(shù)百拷貝的質(zhì)粒。這類乃至數(shù)百拷貝的質(zhì)粒。這類質(zhì)粒在宿主細胞蛋白質(zhì)停止合成質(zhì)粒在宿主細胞蛋白質(zhì)停止合成( (加入氯加入氯霉素霉素) )、染色體、染色體DNADNA停止復(fù)制的條件下，拷停止復(fù)制的條件下，拷貝數(shù)繼續(xù)增加至數(shù)千。貝數(shù)繼續(xù)增加至數(shù)千。 133.3.不相容性不相容性l利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能穩(wěn)定利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能穩(wěn)定地和平共處，可稱之為不相容質(zhì)粒，當(dāng)?shù)睾推焦蔡?，可稱之為不相容質(zhì)粒，當(dāng)兩個上述質(zhì)粒被導(dǎo)入同一細胞時，它們兩個上述質(zhì)粒被導(dǎo)入同一

7、細胞時，它們在復(fù)制及隨后分配到子細胞的過程中彼在復(fù)制及隨后分配到子細胞的過程中彼此競爭。此競爭。14l由于質(zhì)粒分子是從細胞內(nèi)的質(zhì)粒庫中隨機由于質(zhì)粒分子是從細胞內(nèi)的質(zhì)粒庫中隨機選取出來進行復(fù)制的，所以兩個不同的質(zhì)選取出來進行復(fù)制的，所以兩個不同的質(zhì)粒在一個單細胞中的拷貝數(shù)并不總能保持粒在一個單細胞中的拷貝數(shù)并不總能保持相同。最初在隨機過程中產(chǎn)生的微小差異，相同。最初在隨機過程中產(chǎn)生的微小差異，將很快導(dǎo)致兩種質(zhì)粒在拷貝數(shù)上更嚴重地將很快導(dǎo)致兩種質(zhì)粒在拷貝數(shù)上更嚴重地失衡。失衡。15l在一些細胞中，一種質(zhì)粒處于優(yōu)勢，而在在一些細胞中，一種質(zhì)粒處于優(yōu)勢，而在另一些細胞中，與之不相容的另一種質(zhì)粒另一些細

8、胞中，與之不相容的另一種質(zhì)粒卻占盡上風(fēng)。細菌生長幾代之后，占少數(shù)卻占盡上風(fēng)。細菌生長幾代之后，占少數(shù)的質(zhì)粒將會喪失殆盡，在原始細胞的后代的質(zhì)粒將會喪失殆盡，在原始細胞的后代中可含有兩種質(zhì)粒中的任意一種，但不會中可含有兩種質(zhì)粒中的任意一種，但不會兼而有之。兼而有之。16l通過檢查不同質(zhì)粒在同一細胞中共存的能通過檢查不同質(zhì)粒在同一細胞中共存的能力，可以把它們分為若干不相容組。帶有力，可以把它們分為若干不相容組。帶有相同復(fù)制子的質(zhì)粒屬于同一不相容組，而相同復(fù)制子的質(zhì)粒屬于同一不相容組，而帶有不可互換成分的復(fù)制子的質(zhì)粒則屬于帶有不可互換成分的復(fù)制子的質(zhì)粒則屬于不同的不相容組。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)不同的不相容組?，F(xiàn)

9、已發(fā)現(xiàn)3030多個這樣的多個這樣的不相容組。不相容組。174. 轉(zhuǎn)移性轉(zhuǎn)移性l在自然條件下，很多質(zhì)粒都可以通過在自然條件下，很多質(zhì)粒都可以通過一種稱為細菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿一種稱為細菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)。主內(nèi)。185. 選擇的標(biāo)記選擇的標(biāo)記l質(zhì)粒應(yīng)帶有一個或幾個可供選擇的標(biāo)質(zhì)粒應(yīng)帶有一個或幾個可供選擇的標(biāo)記，便于對轉(zhuǎn)化株的篩選。記，便于對轉(zhuǎn)化株的篩選。19l常用來作為標(biāo)記的有氨芐青霉素抗性常用來作為標(biāo)記的有氨芐青霉素抗性(ampicillin resistance(ampicillin resistance，ampampr r) )基因，基因，此基因編碼此基因編碼內(nèi)酰胺酶，該酶能水內(nèi)酰

10、胺酶，該酶能水解氨芐青霉素的解氨芐青霉素的內(nèi)酰胺環(huán)使之失內(nèi)酰胺環(huán)使之失效，從而賦予細菌抗藥性。效，從而賦予細菌抗藥性。20l另一常用的抗藥性基因為四環(huán)素抗性另一常用的抗藥性基因為四環(huán)素抗性(tetracycline resistance(tetracycline resistance，tettetr r) )基因，基因，該基因編碼一種含該基因編碼一種含399399氨基酸殘基的膜相氨基酸殘基的膜相關(guān)蛋白質(zhì)，能阻止四環(huán)素進入細胞。關(guān)蛋白質(zhì)，能阻止四環(huán)素進入細胞。lampampr r基因或基因或tettetr r基因若被外源基因插入，基因若被外源基因插入，便失去相應(yīng)的抗藥性，便于分子克隆的篩便失去相

11、應(yīng)的抗藥性，便于分子克隆的篩選。選。 21l大腸桿菌的大腸桿菌的lac Zlac Z基因也常被用作為選擇的標(biāo)記，基因也常被用作為選擇的標(biāo)記，此基因編碼半乳糖苷酶，能分解一種有色基因此基因編碼半乳糖苷酶，能分解一種有色基因(x)(x)與半乳糖以糖苷鍵連結(jié)成的化合物與半乳糖以糖苷鍵連結(jié)成的化合物x-galx-gal。 l 半乳糖苷酶半乳糖苷酶l X-gal X + galX-gal X + gall 無色無色 藍色產(chǎn)物藍色產(chǎn)物 半乳糖半乳糖l 23l若在含有若在含有X-galX-gal的培養(yǎng)劑中，在乳糖操縱的培養(yǎng)劑中，在乳糖操縱子子(lac operon)(lac operon)誘導(dǎo)物異丙硫半乳糖

12、苷誘導(dǎo)物異丙硫半乳糖苷(isopropylthiogalactoside(isopropylthiogalactoside，IPTG)IPTG)的作的作用下，細菌合成半乳糖苷酶，分解用下，細菌合成半乳糖苷酶，分解XgalXgal，此菌落成為藍色。此菌落成為藍色。l若若lacZlacZ基因被外源基因被外源DNADNA片斷插入而破壞，片斷插入而破壞，則不能制造半乳糖苷酶，菌落為白斑。則不能制造半乳糖苷酶，菌落為白斑。 246. 限制性內(nèi)切酶單一切口限制性內(nèi)切酶單一切口l在質(zhì)粒復(fù)制子以外的部位具有一種或多在質(zhì)粒復(fù)制子以外的部位具有一種或多種限制性內(nèi)切酶的單一切口，便于外源種限制性內(nèi)切酶的單一切口，便

13、于外源基因的插入?；虻牟迦?。l若這種單一的限制性內(nèi)切酶位點處于選若這種單一的限制性內(nèi)切酶位點處于選擇標(biāo)記基因的內(nèi)部，外源基因片斷插入擇標(biāo)記基因的內(nèi)部，外源基因片斷插入后會導(dǎo)致該基因失活便于篩選。后會導(dǎo)致該基因失活便于篩選。 25三、常用三、常用質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體261. pBR322l pBR322pBR322是一種使用最廣泛的質(zhì)粒，全長是一種使用最廣泛的質(zhì)粒，全長為為4 363bp4 363bp，由，由3 3種野生型質(zhì)粒成分組成，種野生型質(zhì)粒成分組成，ampampr r基因來自基因來自pRSF2124pRSF2124，tettetr r來自來自pSCl01pSCl01，復(fù)制起始點來自復(fù)制起始

14、點來自pM9pM9。核苷酸的序次號，。核苷酸的序次號，以以EcoRIEcoRI序列序列GAATTCGAATTC的第一個的第一個T T為第一個核為第一個核苷酸。苷酸。 272. pUCpUC系統(tǒng)系統(tǒng)l如如pUCl8pUCl8和和pUCI9pUCI9，由，由pBR322pBR322的的ampampr r基因和基因和復(fù)制子，以及大腸桿菌部分復(fù)制子，以及大腸桿菌部分1acZ1acZ基因和一基因和一個多種限制性內(nèi)切酶單一位點的接頭構(gòu)成，個多種限制性內(nèi)切酶單一位點的接頭構(gòu)成，全長全長2 666bp2 666bp，pUCl8pUCl8和和pUCl9pUCl9所含多位點所含多位點接頭的方向正好相反。接頭的方向

15、正好相反。 293表達載體表達載體l載體含有載體含有tac啟動子、啟動子、Lac操縱基因、操縱基因、SD序列、序列、Lac I阻遏蛋白基因等。阻遏蛋白基因等。30四、質(zhì)粒四、質(zhì)粒DNA的提取和純化的提取和純化 31（一）、（一）、質(zhì)粒提取的主要步驟質(zhì)粒提取的主要步驟 32 1 1細菌的培養(yǎng)：細菌的培養(yǎng)：l先分離單個菌落，先分離單個菌落， 接種到含少量適當(dāng)抗接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴增，隨著細菌的生長，生素的培養(yǎng)基中擴增，隨著細菌的生長，質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA也在自主復(fù)制。也在自主復(fù)制。33l對于松弛型質(zhì)粒，由于它的復(fù)制在一定程對于松弛型質(zhì)粒，由于它的復(fù)制在一定程度上受到宿主細胞的控制，故

16、在細菌對數(shù)度上受到宿主細胞的控制，故在細菌對數(shù)生長后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白質(zhì)的生長后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白質(zhì)的合成和染色體合成和染色體DNADNA的復(fù)制。質(zhì)粒的復(fù)制。質(zhì)粒DNADNA的復(fù)制的復(fù)制不受影響而大量擴增。不受影響而大量擴增。34l對于新一代的質(zhì)粒如對于新一代的質(zhì)粒如pUCpUC系列等，由于宿系列等，由于宿主對這些松弛型質(zhì)粒的復(fù)制控制不嚴，利主對這些松弛型質(zhì)粒的復(fù)制控制不嚴，利用氯霉素對質(zhì)粒用氯霉素對質(zhì)粒DNADNA的選擇性擴增并不十的選擇性擴增并不十分必要。分必要。35l長時間在氯霉素存在下，質(zhì)粒長時間在氯霉素存在下，質(zhì)粒DNADNA合成過合成過程中，復(fù)制鏈中會摻入核糖核苷酸

17、，對堿程中，復(fù)制鏈中會摻入核糖核苷酸，對堿性條件敏感，將會導(dǎo)致大量的缺口環(huán)狀性條件敏感，將會導(dǎo)致大量的缺口環(huán)狀DNADNA和線性質(zhì)粒的產(chǎn)生和線性質(zhì)粒的產(chǎn)生 36l但有些人仍然偏愛用氯霉素選擇性擴增質(zhì)但有些人仍然偏愛用氯霉素選擇性擴增質(zhì)粒，其理由是在中等體積培養(yǎng)物中能獲取粒，其理由是在中等體積培養(yǎng)物中能獲取與大量培養(yǎng)物等同的質(zhì)粒產(chǎn)量。而且細菌與大量培養(yǎng)物等同的質(zhì)粒產(chǎn)量。而且細菌量的減少，使得裂解物的復(fù)雜性和粘稠度量的減少，使得裂解物的復(fù)雜性和粘稠度降低，操作更方便、有效，對煮沸法更是降低，操作更方便、有效，對煮沸法更是如此。所以使用氯霉素的主要目的，是在如此。所以使用氯霉素的主要目的，是在不減低

18、質(zhì)粒產(chǎn)量的前提下，減少細菌的培不減低質(zhì)粒產(chǎn)量的前提下，減少細菌的培養(yǎng)體積和細菌的數(shù)量養(yǎng)體積和細菌的數(shù)量 37l有時質(zhì)粒在細菌中的擴增狀況很差，常是有時質(zhì)粒在細菌中的擴增狀況很差，常是由于質(zhì)粒攜帶外源基因或質(zhì)粒分子量過大由于質(zhì)粒攜帶外源基因或質(zhì)粒分子量過大所致。所致。l這種低效率擴增，可利用高營養(yǎng)培養(yǎng)基促這種低效率擴增，可利用高營養(yǎng)培養(yǎng)基促進生長，一般可增加質(zhì)粒產(chǎn)量進生長，一般可增加質(zhì)粒產(chǎn)量4-64-6倍。倍。 382 2細菌的收集與裂解細菌的收集與裂解l細胞生長過程中，排出大量代謝產(chǎn)物，細胞生長過程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質(zhì)粒為了提高質(zhì)粒DNADNA的純度，離心棄上清，的純度，離心棄上清

19、，細菌沉淀最好用細菌沉淀最好用STESTE或生理鹽水懸浮，或生理鹽水懸浮，漂洗漂洗l-2l-2次，離心管壁上的液體也應(yīng)該次，離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細去除干凈。仔細去除干凈。 39l細胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水細胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂法、堿變性法，有機溶劑法和溶菌酶熱裂法、堿變性法，有機溶劑法和溶菌酶法等。法等。l不同方法各有利弊，一般要根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)、不同方法各有利弊，一般要根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)、宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后加以選擇。素綜合后加以選擇。 403 3質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA純化純化l 質(zhì)粒從細菌中分離出來以后，為滿足

20、質(zhì)粒從細菌中分離出來以后，為滿足有些實驗的要求還應(yīng)進一步純化。有些實驗的要求還應(yīng)進一步純化。CsClCsCl溴溴乙錠平衡超速離心法是純化質(zhì)粒的可靠經(jīng)乙錠平衡超速離心法是純化質(zhì)粒的可靠經(jīng)典方法。典方法。43l但是由于此法費用昂貴及流程長，近年來，但是由于此法費用昂貴及流程長，近年來，發(fā)展了幾種不同的方法取代了超離法。如發(fā)展了幾種不同的方法取代了超離法。如離子交換層析法或排阻層析法，分級聚乙離子交換層析法或排阻層析法，分級聚乙二醇沉淀法等，也可獲得較好質(zhì)量的質(zhì)粒二醇沉淀法等，也可獲得較好質(zhì)量的質(zhì)粒DNADNA。44l轉(zhuǎn)基因動物，真核細胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)基因動物，真核細胞轉(zhuǎn)染及DNADNA外切酶外切酶酶切缺

21、失等實驗，對閉合環(huán)狀雙鏈酶切缺失等實驗，對閉合環(huán)狀雙鏈DNADNA的的要求較高，一般還是用超速離心法純化質(zhì)要求較高，一般還是用超速離心法純化質(zhì)粒。粒。46l對于對于DNADNA片段酶切回收，內(nèi)切酶圖譜分析、片段酶切回收，內(nèi)切酶圖譜分析、細菌轉(zhuǎn)化、亞克隆及探針放射性標(biāo)記等實細菌轉(zhuǎn)化、亞克隆及探針放射性標(biāo)記等實驗，直接用小量或中量提取的驗，直接用小量或中量提取的DNADNA樣品，樣品，并不需要超速離心純化，一般可滿足實驗并不需要超速離心純化，一般可滿足實驗要求。要求。47（二）（二） 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的制備的制備l質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的小量制備的小量制備 2-5mll質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的大量

22、制備的大量制備 500mll堿裂解法堿裂解法 l煮沸法煮沸法 lSDSSDS裂解法裂解法 lTriton-Triton-溶菌酶法溶菌酶法 48（三）質(zhì)粒（三）質(zhì)粒DNA提取方法的選擇提取方法的選擇 49l常用的煮沸法，堿法常用的煮沸法，堿法,SDS,SDS法均可獲得較滿法均可獲得較滿意效果至于有人采用堿法提取小量細菌意效果至于有人采用堿法提取小量細菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒，培養(yǎng)物的質(zhì)粒， 用煮沸法或用煮沸法或SDSSDS法進行質(zhì)法進行質(zhì)粒粒DNADNA的大量分離，的大量分離， 只是各個實驗室的習(xí)只是各個實驗室的習(xí)慣問題慣問題. .50l但是對于不同的菌株和不同大小的質(zhì)但是對于不同的菌株和不同大小的質(zhì)粒粒

23、DNADNA分子及以后進行的不同實驗等具分子及以后進行的不同實驗等具體情況，選擇哪種方法制備質(zhì)粒體情況，選擇哪種方法制備質(zhì)粒DNADNA，應(yīng)考慮以下因素：應(yīng)考慮以下因素：511 1菌株類型菌株類型l 大量提取大量提取HB101HB101，TGlTGl菌株中的質(zhì)菌株中的質(zhì)粒不提倡選擇煮沸法，這類細菌富含粒不提倡選擇煮沸法，這類細菌富含糖類，在煮沸或去污劑裂解細菌時，大糖類，在煮沸或去污劑裂解細菌時，大量釋放出來。量釋放出來。52l若用若用CsCl-EBCsCl-EB梯度平衡超速離心，梯度平衡超速離心， 糖糖類的密度平衡區(qū)域與閉環(huán)共價質(zhì)粒類的密度平衡區(qū)域與閉環(huán)共價質(zhì)粒DNADNA帶非常鄰近，在抽取

24、閉環(huán)質(zhì)粒帶非常鄰近，在抽取閉環(huán)質(zhì)粒DNADNA時，時， 不可避免地污染有糖類，它們可抑制許不可避免地污染有糖類，它們可抑制許多多DNADNA限制性內(nèi)切酶的活性。限制性內(nèi)切酶的活性。53l另外，另外，HB101HB101及其它含有及其它含有endA+endA+基因型基因型的菌株表達中的核酸內(nèi)切酶的菌株表達中的核酸內(nèi)切酶A A，在煮沸，在煮沸時不能完全失活，時不能完全失活， 在以后操作中，在以后操作中，只要有只要有MgMg2+2+存在存在( (如內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液如內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液) )，核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶A A就可將質(zhì)粒就可將質(zhì)粒DNADNA降解，而降解，而影響實驗結(jié)果。影響實驗結(jié)果。54l若一

25、定要用煮沸法提取這類菌株的質(zhì)粒若一定要用煮沸法提取這類菌株的質(zhì)粒DNADNA，不管是大量還是小量制備，必須，不管是大量還是小量制備，必須用酚、氯仿反復(fù)抽提幾次以去除該用酚、氯仿反復(fù)抽提幾次以去除該酶酶552質(zhì)粒的大小質(zhì)粒的大小l 大于大于15kb的質(zhì)粒的質(zhì)粒DNA易被強烈的物理易被強烈的物理或化學(xué)作用損壞，所以常選用操作過程或化學(xué)作用損壞，所以常選用操作過程較溫和的較溫和的SDS法。細菌懸浮液中含有法。細菌懸浮液中含有10%蔗糖以提高溶液的滲透壓，減輕細蔗糖以提高溶液的滲透壓，減輕細菌裂解時菌裂解時DNA泄漏過快產(chǎn)生的機械剪切泄漏過快產(chǎn)生的機械剪切力。力。56l在溶菌酶消化細菌壁與膜后，再加在

26、溶菌酶消化細菌壁與膜后，再加SDS解聚蛋白質(zhì)與解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合。的結(jié)合。l整個操作中物理剪切力小，整個操作中物理剪切力小， 適用于大適用于大分子量的質(zhì)粒分子量的質(zhì)粒DNA的提取。的提取。573 3細菌染色體細菌染色體DNADNA變性條件強弱的控制變性條件強弱的控制l 堿法是目前實驗室中最常用的質(zhì)粒堿法是目前實驗室中最常用的質(zhì)粒DNADNA提取方法。它對細菌的裂解，細菌提取方法。它對細菌的裂解，細菌染色體染色體DNADNA及蛋白質(zhì)變性充分，所以提及蛋白質(zhì)變性充分，所以提取的質(zhì)粒取的質(zhì)粒DNADNA產(chǎn)量高純度好。產(chǎn)量高純度好。58l但是暴露在強堿性環(huán)境中時間過長，但是暴露在強堿性環(huán)境中時間

27、過長， 共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNADNA可發(fā)生不可逆的可發(fā)生不可逆的變性，導(dǎo)致內(nèi)切酶切割困難，質(zhì)粒變性，導(dǎo)致內(nèi)切酶切割困難，質(zhì)粒DNADNA遷移速度降低遷移速度降低1 1倍左右，倍左右，EBEB染色效率低。染色效率低。59l19661966年年VinogradVinograd等人對這個問題作過等人對這個問題作過報道，但目前，仍有些實驗人員，對報道，但目前，仍有些實驗人員，對這一關(guān)鍵問題并沒有足夠的重視。如這一關(guān)鍵問題并沒有足夠的重視。如出現(xiàn)這種狀況，在下次提取時，可以出現(xiàn)這種狀況，在下次提取時，可以適當(dāng)縮短堿變性時間，不必按某些書適當(dāng)縮短堿變性時間，不必按某些書籍中規(guī)定的籍中規(guī)定的1010分鐘時間操作分鐘時間操作l 60l在煮沸法中，過長時間，過高熱度也在煮沸法中，過長時間，過高熱度也會導(dǎo)致類似問題的出現(xiàn)，這種影響實會導(dǎo)致類似問題的出現(xiàn)，這種影響實驗結(jié)果的操作細節(jié)應(yīng)根據(jù)具體的菌株驗結(jié)果的操作細節(jié)應(yīng)根據(jù)具體的菌株和質(zhì)粒情況加以適當(dāng)改進。和質(zhì)粒情況加以適當(dāng)改進。614細菌的培養(yǎng)與收集細菌的培養(yǎng)與收集l 細菌生長過程中的代謝廢物和脫落的細細菌生