第二章熒光光譜與熒光信號采集處理

1、第二章 熒光光譜與熒光信號采集處理1.熒光的產生熒光（Fluorescence）： 物質中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時以光的形式釋放出它所吸收的能量，這種光即稱為光致發(fā)光： 利用光源激發(fā)而產生，熒光和磷光均為光致發(fā)光.共聚焦顯微鏡常涉及的光譜區(qū)域共聚焦顯微鏡常涉及的光譜區(qū)域激發(fā)光(EXCITATION)： 能特異性地激發(fā)某種熒光的一定波長范圍內的光線稱為該熒光的激發(fā)光。 激發(fā)/吸收光譜；吸收波峰(最大吸收波長)激發(fā)光譜： 又稱熒光激發(fā)光譜，通過測量熒光物質的熒光發(fā)射強度隨激發(fā)波長變化而獲得的光譜。實質： 反映了不同波長激發(fā)光所激發(fā)出熒光的相對效率。發(fā)射光譜： 又

2、稱熒光發(fā)射光譜，反映熒光物質的熒光發(fā)射強度與發(fā)射光波長之間相互關系的光譜曲線。受激光照射后所發(fā)出的熒光不是單一波長，而是由許多不同波長所組成的光譜曲線 實質： 反映了所發(fā)射的熒光中各種波長組分的相對強度。二者關系: 物質發(fā)生電子從基態(tài)向激發(fā)態(tài)躍遷過程中吸收的能量，要高于熒光發(fā)射的能量，因此，熒光的波長要大于激發(fā)光的波長，兩者的差值稱為 Stokes shift（斯托克斯位移）。激發(fā)和發(fā)射之間存在著能量損失激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的用途 是選擇和使用熒光探針、鑒別不同熒光物質的依據 2.熒光的淬滅 由于各種原因，使熒光探針的熒光強度降低的現(xiàn)象稱為熒光淬滅。 能引起熒光強度降低的物質稱為淬滅劑。 熒光的

3、淬滅原因（內因與外因） 外因的影響因素：光照射最常見的因素，會引起碰撞淬滅熒光分子與外部分子形成非熒光的絡合物共振能量的轉移溶劑種類、pH值溫度 光漂白光漂白如何避免：使用低強度激發(fā)光，盡量縮短采集時間；使用閃爍光源，避免一直激發(fā)使用一些有效的熒光保護劑，延緩熒光淬 滅時間。3.熒光探針： 能產生熒光的特異性生物染料（PI, Dapi)、標有熒光素的特異性蛋白結合物（熒光抗體）。 熒光探針的發(fā)展非常迅速，目前僅美國 Molecular Probes公司就可提供1800多種熒光探 針，每年該公司還不斷推出新的熒光探針。通 常每種被測物質都有幾種或幾十種特異的熒光 探針。 選擇合適的熒光探針是有效

4、地進行實驗并獲取理想實驗結果的保障。理想熒光探針的標準：準確真實地測出所需要檢測的指標；不影響細胞固有的狀態(tài)；盡量減小不同熒光物質間激發(fā)/發(fā)射光譜的重疊。熒光探針的選擇 已經商品化的熒光探針有數千種，可以根據自己研究課題的需要進行選擇。 1.根據實驗目的及所要檢測的指標 實驗中選擇使用何種熒光探針是由實驗目的決定的，如待測心肌細胞內的鈣離子 選擇范圍就限定為標記活細胞鈣離子的探針等。 Molecular Probes, Inc 商品探針價目Probes for ProteinsProbe Excitation EmissionFITC 488525PE 488575APC 630650PerC

5、P 488680Cascade Blue 360450Coumerin-phalloidin 350450Texas Red 610630Tetramethylrhodamine-amines 550575CY3 (indotrimethinecyanines) 540575CY5 (indopentamethinecyanines) 6406702. 考察熒光探針的特異性和毒性 考察的熒光特性包括：熒光探針與樣品的反應性： 選擇性或專一性； 探針的跨膜特性；如標記核的探針AO/ PI 反應條件（濃度、溫度、pH值、作用時間、反應介質）； 熒光探針是否對樣品有毒副作用等干擾。熒光強度應用細胞毒

6、性熒光強度應用細胞毒性PIViable Cell Damaged Cell PI：細胞核熒光染料 熒光探針的靈敏度及熒光強度 光吸收效率（摩爾消光系數）和熒光量子產率能反映探針靈敏度及強度。在選擇時，盡量挑選這兩個數值高的探針。 熒光探針標記后樣品的光譜特性 了解探針的穩(wěn)定性和光漂白性 對光照、熒光物質的濃度、探針所在的介質、溫度的穩(wěn)定性等。如光照下容易淬滅，注意避光濃度低，熒光強度低；濃度太高，熒光強度也下降 樣品中 之間的相互影響 多重熒光用兩種或兩種以上熒光探針標記同一樣品中不同成分或結構的方法。常用于分子的細胞內定位、檢測熒光原位雜交信號、細胞凋亡、細胞融合、細胞外藥物跨膜運轉等。 樣

7、品中多重熒光之間的相互影響主要表現(xiàn)為光譜交叉（竄色）。光譜交叉Emission wavelength (nm) 530 580 630 680 730 780FITCPEPE-TRPE-CY54 colors - simultaneous collection兩色以上熒光分析存在 光譜交叉熒光光譜拆分紅色熒光顯示微絲黃色顯示微管蘭色顯示細胞核3.考察熒光探針與所用共聚焦系統(tǒng)的匹配情況 主要指：二者的激發(fā)波長要匹配；儀器的性能能否達到實驗要求，如掃描速度能否檢測到熒光信號的快速變化等。廣譜性的熒光染料（探針） 苯胺藍、焦寧Y（pyronin Y） 羅丹明B（rhodamine B） 熒光素（fl

8、uorescein） 曙紅Y（eosin Y） 吖啶橙（acridine orange）專一性的熒光染料（探針） 核酸檢測探針：DAPI、PI、YOYO、TOTO 肽和蛋白質檢測探針：Fluorescamine，OPA， BCA method 酶檢測探針：EnzChekTM 5Nucleotidaes Assay kit 細胞骨架探針：微管探針、微絲探針常用熒光探針舉例1.標記細胞器的熒光探針1)線粒體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活細胞，陽離子, 可檢 測線粒體膜電位, 且在多數細胞中停留時間 短（慢反應線粒體膜電位探針） JC1 線粒體膜電位低時

9、為單體 490/527 發(fā)綠光 線粒體膜電位高時為多聚體 490/590 發(fā)紅光 可標記活細胞線粒體，且為檢測線粒體膜電 位最佳探針Mitotracker Green FM 490/516, 染活細胞或固定細胞 , 穩(wěn)定不漏出Mitotracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitotracker Orange 還原型, 只能染活細胞 2)溶酶體 Lysosome 中性紅 541/640: 微偏堿性, 可標記溶酶體等酸性器 官為非特異性3)內質網 Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特異性, 較高濃度標記內質網, 較低濃度

10、標記線粒體4)高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細胞 5)細胞核PI propidiumiodide 536/617 DNA/RNA 死細胞EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細胞Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活細胞Hochest 33258 352/461 DNA A-T 活細胞DAPI 358/461 DNA A-T 半通透細胞AO 500/526 DNA 活細胞 500/650 RNATOTO-1 514/533 DNA 死細胞SYTO1116 2024

11、488/ 520 活細胞SYTO1116 2024 521/ 556 活細胞SYTO 17 621/634 活細胞2. pH熒光探針SNAFL-calcein-AM：胞漿pH熒光探針，吸收波長為 506nm，發(fā)射波長為530nm、605nm； 適用于單激發(fā)雙發(fā)射測量。BCECF-AM：胞漿pH熒光探針，吸收波長482nm,發(fā) 射波長520nmFITCdextran：通過胞飲作用進入溶酶體。適用于 pH值范圍是46。3.常見膜電位熒光探針DiBAC4(3)膜電位慢反應熒光探針，吸收峰波長340nm，發(fā)射波長517nm，在生理液中帶有負電荷。僅存在于細胞漿中，細胞核不會著色。原理：膜電位超級化使胞

12、漿中探針濃度增加，二聚體增多，熒光強度降低；膜電位去極化時探針排出，胞漿內單體增加，熒光強度增加。Rhodamine123慢反應線粒體膜電位探針，吸收峰波長為505nm，發(fā)射峰波長534nm。染色后胞漿和線粒體中均有熒光探針。根據實驗記錄的細胞熒光圖像。圈定粒體區(qū)域和胞漿區(qū)域計算平均熒光強度。4.膜磷脂流動性NBD-C6-HPC為磷脂特異性熒光標記探針。吸收波長為466nm，發(fā)射波長531nm。 這種探針的熒光在強光源照射下會產生光漂白效應，可用熒光漂白后重恢復技術（Fluorescence Recovery After Photobleaching,FRAP）測量膜磷脂的流動性。FRAP：借

13、助高強度、脈沖式激光照射細胞的某一區(qū)域，從而造成該區(qū)域熒光分子的淬滅，通過低強度激光掃描，可以探測到該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子向照射區(qū)域擴散的速率。觀察熒光分子在活細胞中的流動熒光恢復漂白脂膜流動性的測試原理 4.熒光圖像的采集、處理與定量測定4.1 采集的圖像類型與處理 采集的圖像分為兩種: 熒光圖像 光學圖像?？蓪崿F(xiàn)如下圖像采集功能： 1) 單獨采集熒光或光學圖像; 2) 分通道同時采集多重熒光圖像和透射光圖像，并通過疊加使之同時展示在一幅畫面上；overlayoverlayoverlay 3)可完成斷層掃描、三維重建、時間動態(tài)實時監(jiān)測及波長掃描等。4.2 采圖方法 逐層采集二維及三維熒光像高分辨率XY平面牛肺動脈內皮細胞 ，微管轉導GFP的菌絲體高分辨率XY平面高分辨率XY平面檢測人類癌細胞表皮生長因子高分辨率XY平面培養(yǎng)的293細胞中的綠色熒光蛋白（GFP）高分辨率XY平面培養(yǎng)的人肝癌細胞吖啶橙染色高分辨率XY平面 牛肺動脈內皮細胞藍色：Hoechst 33342 染DNA紅色：PI，染核仁RNA綠色：Alexa Fluor 488染肌絲蛋白選擇感興趣的區(qū)域（regions ofinterest,ROI)512 x 512512 x 512 Zoom IN三維膠原基質培養(yǎng)的血管平滑肌細胞三維膠原基質培養(yǎng)的血管平滑肌細胞 透射光圖像 利用熒光與透射光同時掃描，進行共定位