原料藥中有機(jī)雜質(zhì)研究與控制

1、原料藥中有機(jī)雜質(zhì)研究與控制綜述1.1 前言隨著公眾和媒體對(duì)藥物安全性的日益關(guān)注， 控制藥物中的雜質(zhì)已成為藥品質(zhì) 量控制中的重要問(wèn)題。人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì) (ICH) 已經(jīng)制定了與雜 質(zhì)控制相關(guān)的切實(shí)可行的指導(dǎo)原則 1，其基本理念已經(jīng)逐步被國(guó)際社會(huì)接受。目 前，英國(guó)藥典 (BP)2、歐洲藥典 (EP)3和美國(guó)藥典 (USP)4均在附錄中設(shè)有專門的雜 質(zhì)檢查通則；中國(guó)藥典 (ChP) 5二部從 ChP(2005)開(kāi)始，附錄中開(kāi)始設(shè)有“藥物雜 質(zhì)研究指導(dǎo)原則”； 2005 年國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局 (SFDA)發(fā)布了化學(xué)藥物 雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則 6；之后， 2007 年又頒布了藥品注冊(cè)

2、管理辦法 ， 在藥品注冊(cè)審評(píng)過(guò)程中， 對(duì)藥品中的雜質(zhì)評(píng)價(jià)都予以高度重視， 極大地促進(jìn)了藥 品質(zhì)量的提高。1.2 原料藥中雜質(zhì)控制理念的變遷原料藥(化學(xué)藥物)中所含有的雜質(zhì)， 按照化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則 定義是指任何影響藥物純度的物質(zhì)。 其雜質(zhì)一般分為三類： 有機(jī)雜質(zhì)、 無(wú)機(jī)雜質(zhì) 和殘留溶劑， 是包括工藝中引入的雜質(zhì)和降解產(chǎn)物。 無(wú)機(jī)雜質(zhì)是指在原料藥及制 劑生產(chǎn)或傳遞過(guò)程中產(chǎn)生的雜質(zhì)，包括：反應(yīng)試劑、配位體、催化劑、重金屬、 無(wú)機(jī)鹽等。 殘留溶劑是指在原料藥及制劑生產(chǎn)過(guò)程中使用的有機(jī)溶劑。 對(duì)于無(wú)機(jī) 雜質(zhì)和殘留溶劑，各國(guó)藥典都收載了經(jīng)典、簡(jiǎn)便、有效的檢測(cè)方法，故可采用藥 典的相關(guān)方法對(duì)其進(jìn)

3、行控制。 而有機(jī)雜質(zhì)因其化學(xué)結(jié)構(gòu)一般與活性成分類似或具 淵源關(guān)系，故又稱為有關(guān)物質(zhì)。由于有機(jī)雜質(zhì)其產(chǎn)生的途徑與工藝流程密切相關(guān)， 且可能產(chǎn)生毒副作用， 從而給原料藥本身在藥物使用的安全性和有效性方面帶來(lái) 諸多影響， 所以各國(guó)藥品監(jiān)督部門在對(duì)原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定上， 均對(duì)有機(jī)雜質(zhì) 的控制予以高度重視， 并隨著新測(cè)試儀器的開(kāi)發(fā)利用、 分析技術(shù)水平的提高， 不 斷地對(duì)有機(jī)雜質(zhì)的分析與控制提出更高的要求。 下文中所提“雜質(zhì)控制”均指有 機(jī)雜質(zhì)的控制。追溯人們對(duì)藥品中雜質(zhì)控制理念的變遷， 可概括為三個(gè)主要階段： 主成分純 度控制階段、非確定性雜質(zhì)限度控制階段和確定性雜質(zhì)定量限度控制階段。早期的藥物質(zhì)量控

4、制主要基于容量法、分光光度法等經(jīng)典的化學(xué)分析方法，對(duì)雜質(zhì)的控制主要是通過(guò)對(duì)測(cè)定與藥品的主成分純度相關(guān)的特征物理化學(xué) 指標(biāo)控制間接實(shí)現(xiàn)的，如測(cè)定雙醋炔諾醇的紫外光譜中 236nm 處的吸收值，當(dāng) 加入 3,5-雙烯雜質(zhì)時(shí)，此處吸光值會(huì)隨著雜質(zhì)量的增加而增大。此階段，由于分 析方法的局限性不能將雜質(zhì)與主成分有效分離，對(duì)雜質(zhì)的控制能力是極其微弱 的，達(dá)不到定性與定量的水平。 Johnson CA7撰文綜述了 1986年前 2030 年間 BP的一般質(zhì)控策略及新分析方法 (HPLC、GC)對(duì) BP的影響。雖然 BP(1980)已經(jīng) 提出了有關(guān)物質(zhì) (related substance的s)概念，但此期

5、間對(duì)藥品質(zhì)量的控制主要為對(duì) 藥品主成分純度的控制。進(jìn)入 20世紀(jì) 90 年代，伴隨著色譜分析技術(shù)的飛速發(fā)展， 對(duì)化學(xué)藥品中的雜 質(zhì)分析成為當(dāng)時(shí)藥品質(zhì)控分析研究的主流。在藥品質(zhì)量控制理念方面， BP(1988) 已明確，“與已知雜質(zhì)相比，對(duì)藥品中的未知 (潛在 )雜質(zhì)的控制更為重要；在良 好的藥品生產(chǎn)條件下，藥品中不應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)性質(zhì)未知和量不可控的雜質(zhì)”。從 BP(1988)起，歷版的 BP 逐漸增加了對(duì)各類化學(xué)藥品有關(guān)物質(zhì)的檢查； BP(1998) 是藥物雜質(zhì)控制的重要“分水嶺”， 該版藥典在附錄中首次增加了有關(guān)物質(zhì)和殘 留溶劑檢查通則， 增加了雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則； 同時(shí)在各論中對(duì)化學(xué)藥品的已知雜

6、質(zhì)給出了具體的名稱、分子式和結(jié)構(gòu)式，并通過(guò)“已知雜質(zhì)”、 “任意單個(gè)雜質(zhì)” 和“總雜質(zhì)”實(shí)現(xiàn)對(duì)化學(xué)藥品中雜質(zhì)的控制；標(biāo)志著對(duì)藥品中雜質(zhì)的“限度控 制”理念已經(jīng)成熟。 ChP(2000)和 ChP(2005)均遵循該“限度控制”理念控制化學(xué) 藥品中的雜質(zhì)。進(jìn)入 21 世紀(jì)，伴隨著人們對(duì)藥品中的雜質(zhì)特性，特別是生物學(xué)特性的深入 了解，發(fā)現(xiàn)不同的雜質(zhì)可能具有完全不同的生理活性，如 -內(nèi)酰胺抗生素中的微 量聚合物雜質(zhì)可能導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)， “致突變雜質(zhì)”與其他雜質(zhì)相比對(duì)人體的危害 更大，僅用“限度控制”雜質(zhì)總量和非確定的單個(gè)雜質(zhì)的控制方式， 是無(wú)法實(shí)現(xiàn) 針對(duì)此類“致敏、 致突變類”雜質(zhì)進(jìn)行定量控制的目的。

7、 此時(shí)藥品的“非確定性 雜質(zhì)限度控制”理念暴露出明顯缺陷。 藥品中的諸雜質(zhì)的種類與相應(yīng)含量被總稱 為雜質(zhì)譜或雜質(zhì)概況 (impurity profiles)。理想的控制理念應(yīng)是針對(duì)藥品中的每一個(gè) 雜質(zhì)，依據(jù)其生理活性逐一制定其質(zhì)控限度。 1997年，GorogS 等8撰文較詳細(xì)地 闡述了利用雜質(zhì)譜控制藥品中雜質(zhì)的策略，并以甲哌地強(qiáng)龍(mazipredone為) 例，提出了利用色譜 (TLC、HPLC、GC)、光譜(UV、NMR)和聯(lián)用技術(shù) (HPLC-PDA， GC-MS，HPLC-MS)組合分析藥品雜質(zhì)譜的方法。之后，藥品“雜質(zhì)譜控制”的 理念逐漸形成。 ChP(2010)中的部分化學(xué)藥品已

8、開(kāi)始嘗試?yán)秒s質(zhì)譜控制的理念 進(jìn)行雜質(zhì)控制。1.3 原料藥雜質(zhì)譜研究與控制的意義原料藥雜質(zhì)譜研究與控制具有如下的重要意義： 首先，雜質(zhì)譜的研究有助于對(duì)原料藥合成工藝進(jìn)行有效監(jiān)控， 從而保證原料 藥生產(chǎn)流程的質(zhì)量穩(wěn)定性。原料藥雜質(zhì) (有關(guān)物質(zhì) )可能是在原料藥生產(chǎn)過(guò)程中帶 入的起始原料、試劑、中間體、副產(chǎn)物和異構(gòu)體等物質(zhì)，也可能是在生產(chǎn)、貯藏 和運(yùn)輸過(guò)程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物、聚合物或晶型轉(zhuǎn)變等特殊雜質(zhì) 9。同一種原料藥 由于合成路線和合成工藝的不同而會(huì)產(chǎn)生多種不同雜質(zhì)， 而其中的一些雜質(zhì)的產(chǎn) 生是與特定的合成路線和合成工藝密切相關(guān)的， 這類雜質(zhì)又稱為合成路線標(biāo)記雜 質(zhì)，它們的生成量的大小往往取決于合

9、成路線和合成工藝中關(guān)鍵控制參數(shù)的優(yōu)化 水平、以及日常生產(chǎn)穩(wěn)態(tài)控制水平， 它們當(dāng)中在含量與種類上的微小變動(dòng)都可能 是藥物在合成工藝過(guò)程中的某些因素的改變 (甚至是較大幅度的變更 )所造成的 10。對(duì)原料藥雜質(zhì)譜進(jìn)行研究與控制， 通過(guò)對(duì)比同一廠家不同時(shí)期的生產(chǎn)批中雜 質(zhì)的種類與數(shù)量關(guān)系， 可了解廠家在不同階段工藝改進(jìn)與參數(shù)優(yōu)化方面的變更情 況；對(duì)近期連續(xù)生產(chǎn)批中雜質(zhì)譜進(jìn)行種類數(shù)量分布統(tǒng)計(jì)， 以此為指標(biāo)可動(dòng)態(tài)反映 當(dāng)前階段生產(chǎn)工藝控制水平；而對(duì)不同廠家生產(chǎn)的同種原料藥中雜質(zhì)譜的比較， 則不僅反映出產(chǎn)品質(zhì)量在雜質(zhì)控制水平上的差異， 還可反映出產(chǎn)品在合成工藝上 的差異性。 此外，原料藥雜質(zhì)譜研究在合成工

10、藝專利保護(hù)上還有特殊意義， 由于 合成路線標(biāo)記雜質(zhì)， 與特定的合成路線具有唯一的確認(rèn)關(guān)系， 有些在合成工藝上 取得專利的原料藥廠商，為保護(hù)自身利益，通過(guò)對(duì)比其它廠家同一產(chǎn)品雜質(zhì)譜， 以是否存在合成路線標(biāo)記雜質(zhì)作為依據(jù)， 來(lái)判定其它廠家是否有盜用專利合成工 藝的侵權(quán)行為 11。其次，雜質(zhì)譜的研究為原料藥進(jìn)一步進(jìn)行毒理學(xué)安全評(píng)價(jià)、 藥理學(xué)臨床研究、 藥劑學(xué)研究提供數(shù)據(jù)參考。 化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則規(guī)定了原料藥 雜質(zhì)限度 (見(jiàn)表 1-1)的要求，定義了三類雜質(zhì)限度：報(bào)告限度(Reporting Threshold：) 超出此限度的雜質(zhì)均應(yīng)在檢測(cè)報(bào)告中報(bào)告， 并應(yīng)報(bào)告具體的檢測(cè)數(shù)據(jù)。鑒定限度(

11、Identification Threshold)：超出此限度的雜質(zhì)均應(yīng)進(jìn)行定性分析， 確 定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。質(zhì)控限度 (Qualification Threshold)：質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中一般允許的雜質(zhì)限度， 如制訂 的限度高于此限度，則應(yīng)有充分的依據(jù)。表 1-1 原料藥雜質(zhì)限度每日最大劑量報(bào)告限度鑒定限度界定限度 2g/day>0.05%>0.10%or 1.0mg/day（取最小值 ）>0.15%or 1.0mg/day（取最小值 ）>2g/day>0.03%>0.05%>0.05%當(dāng)原料藥存在化學(xué)結(jié)構(gòu)相近的雜質(zhì) （有關(guān)物質(zhì) ）且含量超過(guò)鑒定限度或界定限 度

12、時(shí)，藥物研發(fā)者有義務(wù)對(duì)雜質(zhì)的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。 如果可以降低雜質(zhì)含量至質(zhì) 控限度以下， 或者通過(guò)研究文獻(xiàn)資料可以提供雜質(zhì)安全性證據(jù)的， 可以免于雜質(zhì) 的安全性評(píng)價(jià)。否則，必須進(jìn)行雜質(zhì)毒性 （包括遺傳毒性 ）實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)雜質(zhì)可能產(chǎn) 生的毒副作用。具體研究方法可以采用含有一定雜質(zhì)的樣品（雜質(zhì)量可能與臨床研究用樣品不同，但雜質(zhì)種類和個(gè)數(shù)應(yīng)該一致 ）在嚙齒類和非嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行急 性毒性試驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，確定原料藥的 NOEL（No Observed Effect Leve ，不 能觀察到反應(yīng)的量 ）或 LOEL（lowest observed effect level 即能觀察到反應(yīng)的最低 量），從而計(jì)

13、算出每日可接受的最大攝入量 （PDE， permitted daily exposure。） 因此，在對(duì)原料藥雜質(zhì)進(jìn)行毒性 （包括遺傳毒性 ）實(shí)驗(yàn)前，必須提供該原料藥 雜質(zhì)譜的研究數(shù)據(jù)， 并且要求臨床研究用樣品的雜質(zhì)量不得高于毒性試驗(yàn)研究用 樣品的雜質(zhì)量。 如果合成工藝發(fā)生較大的變更， 終產(chǎn)品的雜質(zhì)種類和數(shù)量均發(fā)生 變化，則需要重新進(jìn)行雜質(zhì)的毒性研究，確定新雜質(zhì)的 PDE 值。同時(shí)原料藥雜質(zhì)譜研究也為進(jìn)一步藥劑學(xué)研究開(kāi)發(fā)， 提供了初期藥物穩(wěn)定性 數(shù)據(jù)。原料藥的雜質(zhì)可能是工藝過(guò)程產(chǎn)生的雜質(zhì)和生產(chǎn)儲(chǔ)存過(guò)程中自身降解物。 對(duì)原料藥進(jìn)行初期藥物穩(wěn)定性試驗(yàn) （加速試驗(yàn)、強(qiáng)制降解試驗(yàn) ），通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)樣

14、品與空白試驗(yàn)樣品中的雜質(zhì)譜，可分清楚哪些雜質(zhì)是由工藝生產(chǎn)帶進(jìn)（此類雜質(zhì)在穩(wěn)定性試驗(yàn)中含量無(wú)顯著改變 ），哪些雜質(zhì)是由降解產(chǎn)生的 （此類雜質(zhì)在穩(wěn)定性 試驗(yàn)中含量顯著改變 ）。原料藥的降解產(chǎn)物對(duì)于劑型選擇、處方組成、劑型工藝 確定、以及劑型產(chǎn)品的儲(chǔ)存方式等均產(chǎn)生較大的影響。 通過(guò)對(duì)初期藥物穩(wěn)定性試 驗(yàn)樣品中降解雜質(zhì)譜進(jìn)行分離， 并進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證， 可了解原料藥降解雜質(zhì)基本組 成以及產(chǎn)生的原因， 為劑型藥中雜質(zhì)的定性、 定量分析提供實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備， 所以原料 藥雜質(zhì)譜研究應(yīng)是藥品質(zhì)量研究、質(zhì)量控制和安全性研究的基礎(chǔ)。1.4 原料藥雜質(zhì)譜中的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)分析基本步驟目前，雜質(zhì)結(jié)構(gòu)定性研究仍是國(guó)內(nèi)有關(guān)物質(zhì)研究中的薄

15、弱環(huán)節(jié)， 在一定程度 上限制了我國(guó)藥品研究水平和藥品質(zhì)量的提高。 由于各研究機(jī)構(gòu)采用的分析方法 手段不同， 使用儀器設(shè)備的差異， 以及不同原料藥的特性差異， 導(dǎo)致各研究機(jī)構(gòu) 對(duì)不同原料藥雜質(zhì)譜研究的步驟會(huì)有所差異。 但有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的途徑還是有 跡可循的 （見(jiàn)圖 1-1）9。圖 1-1 有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的途徑總體上，它包括以下步驟： 1）采用不同分離機(jī)制的色譜分離方法檢測(cè)有關(guān)物 質(zhì)，結(jié)合合成、制備路線與 MS 的檢測(cè)推測(cè)有關(guān)物質(zhì)的可能結(jié)構(gòu)，然后取可能存 在的雜質(zhì) （如合成過(guò)程中的原料、中間體等 ）與含雜質(zhì)的藥物進(jìn)樣，在相同的色譜 條件下考查已知化合物與該雜質(zhì)的保留時(shí)間是否一致； 也可將已知化

16、合物加入含 雜質(zhì)的藥物中，考查擬確定的雜質(zhì)峰面積是否有變化。 2）利用光電二極管陣列檢 測(cè)器（DAD） ，觀察擬定性的有關(guān)物質(zhì)的紫外吸收，或與已知化合物的紫外吸收光 譜進(jìn)行對(duì)比，分析該雜質(zhì)結(jié)構(gòu)中可能存在的官能團(tuán)。 3）采用 GC-MS或 LC-MS-MS 聯(lián)用技術(shù)，為有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)確定提供相關(guān)信息；或利用 LC-IR 和 LC-NMR 等 聯(lián)用技術(shù)，在不分離雜質(zhì)的情況下在線獲得雜質(zhì)的 IR 和 NMR 圖譜；或利用制 備型色譜獲得有關(guān)物質(zhì)的樣品，然后通過(guò) IR、MS、NMR 的檢測(cè)，確定有關(guān)物質(zhì) 的結(jié)構(gòu)。 4）合成已知結(jié)構(gòu)的有關(guān)物質(zhì)，并與藥物雜質(zhì)的色譜數(shù)據(jù)和光譜信息進(jìn)行 對(duì)照，以確定有關(guān)物質(zhì)，

17、并建立其定量測(cè)定方法。1.5 國(guó)內(nèi)外對(duì)原料藥中雜質(zhì)譜的分析方法及最新進(jìn)展有關(guān)物質(zhì)的種類與藥物的合成路線和制劑工藝密切相關(guān)， 藥物在合成和制劑 工藝過(guò)程中的任何一個(gè)因素的改變都可能導(dǎo)致其有關(guān)物質(zhì)的種類不同， 因而有關(guān) 物質(zhì)的檢測(cè)和控制過(guò)程相對(duì)復(fù)雜。藥物中的有關(guān)物質(zhì)大多具有潛在的生物活性， 有的甚至?xí)c藥物發(fā)生相互作用從而影響藥物的安全性和有效性， 嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?產(chǎn)生毒性作用 12，因此有關(guān)物質(zhì)研究是藥物質(zhì)量研究中最重要的一個(gè)方面， 同時(shí) 也是藥品開(kāi)發(fā)過(guò)程中的一個(gè)重要內(nèi)容。根據(jù)人用藥品注冊(cè)技術(shù)規(guī)范國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì) （簡(jiǎn)稱 ICH） 準(zhǔn)則的要求， 藥物中雜質(zhì)的限度僅為 0.10%（毒性藥物限度則更低 ），

18、高 于此水平的所有未知雜質(zhì)均應(yīng)被鑒別且定量， 此外，還應(yīng)對(duì)這些雜質(zhì)進(jìn)行毒性研 究 6。因此，有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定對(duì)于確保藥物質(zhì)量和用藥安全、 有效是非常必要的。 因有關(guān)物質(zhì)多為微量，必須選擇專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的檢測(cè)方法，目 前首選的是色譜法， 可根據(jù)新藥的具體品種及其有關(guān)物質(zhì)的性質(zhì)選用高效液相色 譜法 （HPLC）、薄層色譜法 （TLC）、氣相色譜法 （GC） 等或波譜分析技術(shù)，包括 HPLC-MS或 GC-MS等聯(lián)用技術(shù)。有關(guān)物質(zhì)的常用測(cè)定方法主要包括如下幾種。1.5.1 薄層色譜法TLC 法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便，易于操作， 可同時(shí)分離多個(gè)樣品， 分析成本低，對(duì)樣 品預(yù)處理要求低， 且可同時(shí)檢測(cè)

19、極性大和極性小的雜質(zhì) 13，故在藥物雜質(zhì)檢查中 應(yīng)用十分廣泛， 在各國(guó)藥典中都有多種藥物采用此方法檢查有關(guān)物質(zhì)。 而且，也 有人嘗試將 TLC 法用于藥典中未采用此法測(cè)定其有關(guān)物質(zhì)的藥品，如羅功才 14 采用硅膠 G 板，以甲苯 -甲醇 （8：2）為展開(kāi)劑， 1%二苯胺硫酸溶液為顯色劑，對(duì) 硝酸異山梨酯的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了檢查。結(jié)果顯示：該法簡(jiǎn)便易行，重復(fù)性好，雜 質(zhì)的最低檢出量為 90ng。但在有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定中 TLC 法只能達(dá)到定性或半定量 的目的，且由于靈敏度受操作條件影響較大， 因此難以滿足快速定量分析的需要。1.5.2 高效液相色譜法HPLC 法具有分離效能高、分析速度快和檢測(cè)靈敏度高等

20、特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng) 用于藥物中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。目前， HPLC 測(cè)定有關(guān)物質(zhì)的定量方法主要有雜質(zhì) 對(duì)照品法 （外標(biāo)法 ）、主成分自身對(duì)照法和峰面積歸一化法。1.5.2.1 雜質(zhì)對(duì)照品法當(dāng)藥物中有關(guān)物質(zhì)已知并可獲得其對(duì)照品時(shí)， 可采用雜質(zhì)對(duì)照品法測(cè)定單個(gè) 雜質(zhì)的含量。 該法專屬性強(qiáng)， 靈敏度與準(zhǔn)確度均較高， 但由于通常較難獲得雜質(zhì) 對(duì)照品，不能廣泛使用。 Chandorkar 等15采用該法對(duì)鹽酸坦索羅辛中已知雜質(zhì) 5-（2-氨基丙基）-2-甲氧基苯磺 酰胺進(jìn)行了測(cè)定 ，色譜 條件 為：色譜柱為 Lichrosphere C8柱；流動(dòng)相為乙腈 -磷酸二氫鉀緩沖液 （50：50，用磷酸調(diào)節(jié) pH 至

21、 5.0）；檢測(cè)波長(zhǎng)為 275nm。結(jié)果，該方法回收率達(dá) 99%，重復(fù)性和回收率的 RSD 均小于 1%，檢測(cè)限為 6ng。1.5.2.2 主成分自身對(duì)照法主成分自身對(duì)照法又可分為加校正因子和不加校正因子兩種。（1）若雜質(zhì)已知但無(wú)對(duì)照品， 可采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法對(duì)雜質(zhì)進(jìn) 行定量檢測(cè)。例如，劉文華等 16以 Alltech C18 柱為色譜柱，乙腈 -磷酸二氫銨緩 沖液 （10：90）為流動(dòng)相，在 280nm檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)定頭孢丙烯合成起始原料和中間 體以及頭孢丙烯的色譜峰面積， 計(jì)算各校正因子， 采用該法對(duì)頭孢丙烯原料藥等 有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定， 結(jié)果各有關(guān)物質(zhì)均達(dá)到了較好的分離。 該

22、法的優(yōu)點(diǎn)是可減 小雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子可能不同所引起的測(cè)定誤差， 故準(zhǔn)確度較高； 缺點(diǎn)是 在檢驗(yàn)時(shí)沒(méi)有雜質(zhì)對(duì)照品，必須根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間確定雜質(zhì)峰在圖譜中的位置， 而相對(duì)保留時(shí)間在不同實(shí)驗(yàn)條件下可能有所波動(dòng)， 特別是當(dāng)供試品中存在多個(gè)雜 質(zhì)且分離效果不佳時(shí)，更難確定色譜圖中的雜質(zhì)峰。(2) 若雜質(zhì)未知或無(wú)法獲得雜質(zhì)對(duì)照品， 可采用不加校正因子的主成分自身對(duì) 照法對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。 該法不但操作簡(jiǎn)便， 且無(wú)需對(duì)照品， 但由于忽略了各雜質(zhì) 與主成分的響應(yīng)因子有可能不同， 從而使實(shí)驗(yàn)測(cè)得的雜質(zhì)含量可能存在誤差， 其 測(cè)定誤差要比加校正因子的主成分自身對(duì)照法更大。 當(dāng)雜質(zhì)對(duì)主成分的校正因子 超出 0.9

23、1.1 范圍時(shí)，應(yīng)采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定。當(dāng)采用主成 分自身對(duì)照法時(shí)， 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇是否合理直接影響到有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果。 若 將主成分的最大吸收波長(zhǎng)確定為有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的波長(zhǎng)， 而雜質(zhì)在此波長(zhǎng)下的吸收 與主成分差異較大， 則所測(cè)結(jié)果不能真實(shí)地反映藥品中雜質(zhì)含量。 因此在選擇檢 測(cè)波長(zhǎng)時(shí)應(yīng)綜合考察主成分和雜質(zhì)的紫外吸收特性， 既要保證有關(guān)物質(zhì)在該波長(zhǎng) 下有較高的靈敏度， 又要盡量減小有關(guān)物質(zhì)與主成分之間的響應(yīng)差異。 可通過(guò)二 極管陣列檢測(cè)器 (DAD) 來(lái)考察主成分和各個(gè)雜質(zhì)的紫外吸收特性， 選取響應(yīng)基本 一致的波長(zhǎng)作為有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。 如王桂云等 17在奧美沙坦酯的有關(guān)物質(zhì)

24、檢 查中，采用 DAD 對(duì)奧美沙坦酯和 5 個(gè)中間體的紫外吸收特性進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn) 奧美沙坦酯和 5 個(gè)中間體的紫外最大吸收波長(zhǎng)分別為 254、258、 261、264、256 和 252nm，且吸收強(qiáng)度也相似，故最后選定接近主峰且近似于平均值的波長(zhǎng) (256 nm)作為有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。1.5.2.3 峰面積歸一化法若只需粗略考察雜質(zhì)的含量， 可采用峰面積歸一化法。 楊倩等 18采用該法對(duì) 鹽酸平陽(yáng)霉素及注射用鹽酸平陽(yáng)霉素中有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，色譜條件為： C18 色譜柱 (150mm×4.6mm，5m)；以己烷磺酸鈉溶液 (pH4.2)為流動(dòng)相 A 、甲醇-乙 腈(70： 30

25、)為流動(dòng)相 B，進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為 254nm。結(jié)果，主峰與雜質(zhì) 能較好分離， 最低檢測(cè)質(zhì)量濃度達(dá) 1mg/L 。峰面積歸一化法的特點(diǎn)是其測(cè)定值基 本不受稱樣量及進(jìn)樣量的影響， 故重復(fù)性良好。 但需指出的是， 只有在所有成分 均出峰、所有雜質(zhì)均與主成分分離且響應(yīng)因子相同時(shí)， 該法的結(jié)果方可真實(shí)準(zhǔn)確。 此外，當(dāng)所含雜質(zhì)為微量時(shí)， 需通過(guò)增加進(jìn)樣量來(lái)確保檢測(cè)靈敏度， 此時(shí)主成分 響應(yīng)值可能超出儀器檢測(cè)范圍。1.5.3 氣相色譜法GC 法具有選擇性好、靈敏度高、進(jìn)樣量小、分析速度快等特點(diǎn)。李丹等 19 采用毛細(xì)管 GC 法對(duì)-石竹烯醇的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，考察了不同色譜柱和柱 溫程序升溫對(duì)分離

26、效果的影響， 并用氣相色譜 -質(zhì)譜 (GC-MS)確定了有關(guān)物質(zhì)主要 為-石竹烯醇共存物-欖香醇、長(zhǎng)葉烯醇和丁子香烯醇。 與 TLC 法和 HPLC 法 相比，GC 法要求樣品能夠氣化且具有熱穩(wěn)定性， 故較少用于有關(guān)物質(zhì)檢查。 2005年版中國(guó)藥典精品3中只有林旦等少數(shù)幾個(gè)化學(xué)藥品采用 GC 法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的檢查。1.5.4 毛細(xì)管電泳法毛細(xì)管電泳法 (CE)近年來(lái)發(fā)展迅速，與 HPLC 法相比，具有快速、高效、進(jìn) 樣量小、分離模式多等優(yōu)點(diǎn)。盡管目前受自身靈敏度和重復(fù)性的限制，CE 法在藥物的雜質(zhì)研究中的應(yīng)用還不普遍，但當(dāng) HPLC 法不能獲得很好的分離效果時(shí)， CE法可能是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。

27、Jouyban等20對(duì)近年來(lái) CE 法在藥物雜質(zhì)研究中的 應(yīng)用做了總結(jié)，指出：目前毛細(xì)管區(qū)帶電泳法 (CZE)在各種分離模式中應(yīng)用的最 多，主要用于離子型和可電離藥物的分析；膠束毛細(xì)管電色譜 (MEKC) 和微乳液 毛細(xì)管電動(dòng)色譜 (MEEKC) 則比較適合疏水性藥物的分離；等速電泳 (ITP)等其它 分離模式應(yīng)用的較少。 有一個(gè)例子是 Jankovics等21采用 CE 法檢查不同廠家的苯 磺酸氨氯地平中有關(guān)物質(zhì)，電泳條件為：緩沖液為 25mmol/L 檸檬酸緩沖液 (pH7.0)-甲醇 (80：20)；分離電壓為 30kV；檢測(cè)波長(zhǎng)為 223nm；內(nèi)標(biāo)為鹽酸普魯卡 因。其檢測(cè)結(jié)果與采用歐洲

28、藥典規(guī)定的 HPLC 法的結(jié)果基本一致。1.5.5 毛細(xì)管電色譜法毛細(xì)管電色譜法 (CEC)是 20 世紀(jì) 90年代初興起的一種新型分離分析技術(shù)， 它綜合了 HPLC 法和 CE 法的優(yōu)點(diǎn)，具有高柱效、多選擇性、流動(dòng)相體系相對(duì)簡(jiǎn) 單、峰容量大、易于聯(lián)用等特點(diǎn)。 Orlandini 等 22采用 CEC 法對(duì)酮咯酸及其有關(guān) 物質(zhì)進(jìn)行了分離，并通過(guò)對(duì)緩沖液的 pH、乙腈的濃度、有機(jī)改性劑的種類和電 壓強(qiáng)度等因素的優(yōu)化考察，確定了最佳分離條件：流動(dòng)相為 50mmol/L 甲酸銨緩 沖液 (pH3.5)-水-乙腈 (10：20：70)；檢測(cè)波長(zhǎng)為 323nm；電壓為 30V；溫度為 20； 內(nèi)標(biāo)為氟滅

29、酸。結(jié)果， 9 分鐘內(nèi)主藥和 3 種有關(guān)物質(zhì)達(dá)到基線分離。但目前 CEC 技術(shù)還處于研究階段， 在日常分析中使用較少， 其檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性差等問(wèn)題還 有待進(jìn)一步解決。1.5.6 超臨界流體色譜法超臨界流體色譜法 (SFC)是 20 世紀(jì) 80 年代初發(fā)展并得以廣泛應(yīng)用的色譜分 離技術(shù)。該技術(shù)以超臨界流體為流動(dòng)相， 以固定吸附劑或鍵合到載體上的高聚物 為固定相， 必要時(shí)加入甲醇等極性物質(zhì)為改性劑來(lái)改善分離性能。 SFC 法具有分 析速度快、選擇性好、分離效率高和樣品處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適用于熱穩(wěn)定性差、極性大和揮發(fā)性小的藥物。 Toribio L 等23采用手性填 充柱 SFC法對(duì) 4 種抗真菌藥進(jìn)

30、行了手性拆分，并考察了不同改性劑對(duì)保留時(shí)間 和分離度的影響，發(fā)現(xiàn)在使用甲醇為改性劑的條件下，咪康唑、益康唑、硫康唑 與其各自的對(duì)映異構(gòu)體在 10 分鐘內(nèi)均能達(dá)到很好的分離效果；而伊曲康唑需使 用異丙醇 -乙醇(85：15)為改性劑時(shí)才能與其 3 個(gè)異構(gòu)體達(dá)到基線分離。由于 SFC 技術(shù)檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性差，目前在有關(guān)物質(zhì)測(cè)定中并不常用。1.5.7 聯(lián)用技術(shù)色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是目前發(fā)展最為成熟的聯(lián)用技術(shù)，其中液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用技術(shù)在有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)確定和降解產(chǎn)物的產(chǎn)生機(jī)制研究中有著廣泛 的應(yīng)用。 Ermer等24介紹了 LC-MS 技術(shù)在有關(guān)物質(zhì)研究中的應(yīng)用情況，一方面， 可利用 L

31、C-MS 法對(duì)色譜峰進(jìn)行峰純度檢查，以驗(yàn)證分析方法的可靠性；另一方 面，可通過(guò)高分辨質(zhì)譜提供的元素組成信息和 LC-MS-MS 法提供的碎片離子信息 來(lái)推斷雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。除色譜-質(zhì)譜聯(lián)用外，液相色譜 -核磁共振波譜聯(lián)用 (LC-NMR)是人們關(guān)注的另 一個(gè)焦點(diǎn)。 LC-NMR 技術(shù)在藥物分析中主要用于藥物中雜質(zhì)、 藥物代謝的產(chǎn)物以 及手性藥物的分析等。 Vasu Dev等 25在對(duì)雷貝拉唑鈉片進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)研究的過(guò) 程中，發(fā)現(xiàn)經(jīng) 6 個(gè)月加速試驗(yàn)的樣品產(chǎn)生了 3 個(gè)新的降解產(chǎn)物，采用停留模式 LC-NMR 和高分辨 LC-MS技術(shù)得到了降解產(chǎn)物的 NMR 和MS信息，并將這些信 息與雷貝拉唑的結(jié)

32、構(gòu)信息進(jìn)行比較， 確定了 3個(gè)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)， 并推斷降解產(chǎn)物可 能源自碳硫鍵氧化斷裂和雷貝拉唑自身結(jié)構(gòu)的重排。目前，對(duì)有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定已成為有關(guān)物質(zhì)研究技術(shù)要求的重要組成部 分。應(yīng)用色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定屢見(jiàn)報(bào)道。例如，在對(duì)洛 匹那韋原料藥中有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行研究時(shí)， Chitturi 等26首先采用 HPLC 法對(duì)洛匹那 韋粗品進(jìn)行初步檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)共有 10 個(gè)有關(guān)物質(zhì) (RS1RS10，) 將起始原料、中間 體等可能的有關(guān)物質(zhì)與樣品中雜質(zhì)的保留時(shí)間進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)， RS1為合成的中 間體，RS2為起始原料，RS3為洛匹那韋的水解產(chǎn)物； 然后應(yīng)用 LC-MS和 LC-MS-MS

33、 技術(shù)分析樣品，分別得到 RS3RS10的分子質(zhì)量和碎片離子的信息，進(jìn)一步結(jié)合 洛匹那韋的結(jié)構(gòu)及合成過(guò)程， 推測(cè)出這幾個(gè)未知雜質(zhì)的可能結(jié)構(gòu)； 最后，將通過(guò) 制備型色譜得到的幾個(gè)未知雜質(zhì)的純品進(jìn)行 NMR 和 IR 分析，以驗(yàn)證先前的推 測(cè)，從而確定了有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。1.6 結(jié)語(yǔ)藥物中有關(guān)物質(zhì)的研究是藥物研發(fā)和質(zhì)量控制的一個(gè)重要方面， 貫穿于藥品 研究、生產(chǎn)、儲(chǔ)存的全過(guò)程。藥品中的有關(guān)物質(zhì)是否能得到合理、有效的控制， 直接關(guān)系到藥品質(zhì)量的可控性和安全性。目前含量在 0.1%左右的有關(guān)物質(zhì)是人 們研究的熱點(diǎn)，綜合利用各種分析手段建立準(zhǔn)確、 快速、靈敏度高的檢測(cè)分析方 法仍是研究人員努力的方向。 H

34、PLC 法在有關(guān)物質(zhì)分析中仍將占主導(dǎo)地位， TLC 法和 GC 法則是補(bǔ)充手段。隨著技術(shù)、方法的成熟， CE 法也有望成為一種常規(guī) 分析手段，特別是在手性異構(gòu)體的檢查中能發(fā)揮重要的作用。 近幾年 SFC、UPLC、 CEC等方法在有關(guān)物質(zhì)研究中的應(yīng)用逐年增加，但其重復(fù)性還有待進(jìn)一步改善。 在有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析中， LC-MS 及 LC-MS-MS 技術(shù)已相當(dāng)成熟。近年來(lái)， LC-NMR 技術(shù)有了較大的發(fā)展，憑借著強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)鑒定能力，其在有關(guān)物質(zhì)的結(jié) 構(gòu)分析中必將有著較好的應(yīng)用前景。隨著檢測(cè)手段的進(jìn)一步完善，人們對(duì)藥物中 有關(guān)物質(zhì)的研究將會(huì)更加深入，藥品質(zhì)量也將得到進(jìn)一步的提升。參考文獻(xiàn)1 Q3

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