黃瓜總DNA的提取及鑒定

1、.黃瓜總DNA的提取及鑒定 摘要:植物DNA首先要在液氮或干冰中將新鮮或冷凍的植物組織研磨成粉，使細(xì)胞壁破碎，再用含有去污劑、螯合EDTA等成分的提取緩沖液處理組織勻漿。用氯仿-異戊醇把組織勻漿中變性的蛋白質(zhì)除去，將DNA與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、碳水化合物等分開；再用RNase A去除核酸中的RNA,剩下的便是DNA。DNA可用乙醇或異丙醇沉淀，沉淀的DNA可用挑取或離心方法收集。DNA的純度可用紫外分光光度計做初略測量。核酸、蛋白質(zhì)、鹽與小分子的最大吸收峰值分別為260nm、280nm及230nm。順序測定一個樣品在這三種波長下的OD值，如果提取的樣品較純，蛋白質(zhì)及小分子的污染較小，則OD/OD1

2、.8，OD/OD2.0。通過測定OD，根據(jù)公式（雙鏈）的濃度（ug/m L)。DNA的完整性可用凝膠電泳來測定。常用的凝膠有聚丙烯酰胺與瓊脂糖。瓊脂糖電泳可分理相差100bp的DNA片段，但分離范圍大，制備簡單。方法：植物組織（削皮的黃瓜）在液氮中研磨，磨好的組織溶于65 CTAB提取緩沖液中，保溫一段時間后用酚-氯仿抽取2次，除去變性的蛋白及大部分碳水化合物。再用乙醇將DNA沉淀下來。獲得的DNA用紫外分光光度計測定濃度及純度，再用瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。關(guān)鍵詞：DNA，提取及鑒定1. 實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料黃瓜1.1.1試劑液氮； CTAB提取緩沖液；TE緩沖液或重蒸水；酚：氯仿：

3、異戊醇=25：24:1；異丙醇或無水乙醇；TE緩沖液，重蒸水；0.3%(m/V）標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖；0.5×TBE緩沖液，上樣緩沖液；EB；1.1.2器具研缽，小藥勺；1.5 m L小離心管若干；定量移液器及槍頭；離心機(jī)；恒溫水浴鍋；紫外分光光度計；水平電泳槽；三角瓶（500或1000mL)；微波爐或沸水浴，透射紫外燈1.1.3生物材料黃瓜1.2試驗(yàn)方法1.2.1 提取DNA1. CTAB于65，水浴30min。2. 稱取8g(黃瓜去皮）研磨破碎細(xì)胞壁。3. 加20 mol CTAB于研磨中混勻酚漿，2支離心管于65水浴15min ，3500 Hpm，5min去除殘渣。4. 取上清液5mL于

4、離心管中，加入5mL氯仿-異戊醇上下顛倒混合2 min5. 上清液轉(zhuǎn)移至小燒杯中加2倍體積預(yù)冷的乙醇，觀察纖維狀沉淀。6. 轉(zhuǎn)移10mol離心管中，4水箱保存?zhèn)溆?.2.2 DNA濃度及純度的測定1. 將提取的DNA粗產(chǎn)物離心3500 rmp，10 min。2. 棄上清液，加約5mL70% 乙醇吹打洗滌，使沉淀懸浮。3. 3500 rmp,10min使DNA沉淀。4. 棄上清，2支離心管：一支加5mL氯化鈉水溶液溶解；另一支4保存下次備用5. 用氯化鈉作對照基線校正后沉淀220-350nm的光譜圖。6. 用氯化鈉作空白對照，測定OD、OD、OD。1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳1. 制膠：稱取0.2

5、5g瓊脂糖溶解在25mL1×TBE中微波爐加熱，微沸3次冷卻至60倒膠。2. 點(diǎn)樣：待膠冷卻凝固后，將DNA樣品加2mlddHO溶解，取10ml與3ml loading buffe混合，并用移液槍小心加入至樣品槽中3. 電泳：點(diǎn)樣端放在負(fù)極。120V，40 min 凝膠成像，EB染膠10min，流水5min，凝膠成像在系統(tǒng)下觀察。2. 結(jié)果與分析2.1提取DNA提取出黃瓜的DNA。2.2 DNA濃度及純度的測定1. 記錄220-350nm時的光譜圖2. 計算OD/OD，OD/OD，分析DNA的純度OD=DNA的濃度=50×OD×稀釋倍數(shù)=波長換成280nm及230

6、nm,用同一樣品再次測OD的值：OD = ； OD=OD/OD= ； OD/OD=則提取DNA的純度2.3 瓊脂糖凝膠電泳觀察并分析DNA的電泳圖像從圖中可以看出，如果基因組DNA完整，應(yīng)該僅出現(xiàn)一條主帶；如果很多條深淺不一的帶，則說明DNA已經(jīng)降解；如果背景模糊，說明在DNA樣品中混雜有RNA；3.1提取DNACTAB提取液中各試劑分別的作用？1. 細(xì)胞膜裂解，使DNA釋放到提取緩沖液中，同時使組織勻漿中的蛋白質(zhì)變性；緩沖液中的-疏基乙醇，-疏基乙醇抑制從組織勻漿釋放的多酚氧化，防止植物組織黃褐變。3.3 瓊脂糖凝膠電泳影響DNA電泳速率有哪些因素？1. DNA片段的長度；2. DNA的構(gòu)象；3. 瓊脂糖的濃度；4.