G418篩選細胞(整合版)

1、G418 篩選細胞G418 簡介：G418 是一種氨基糖甘類抗生素,在分子遺彳試驗中，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性篩選試劑。白色粉末，融點 138144C,溶于水、甲醇。CASNo.:108321-42-2分子式：C20H40N4O10?2H2sO4 子量：692.71儲運室溫下運輸，干粉在室溫下儲存，溶液于-20C 儲存。G418 工作原理：它通過抑制轉(zhuǎn)座子 Tn601,Tn5 的基因，干擾 80S 核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對原核和真核等細胞都有毒性，包括細菌、酵母、植物和哺乳動物細胞，也包括原生動物和蠕蟲。細菌 Tn5 轉(zhuǎn)座子序列（neo 抗性基因）攜帶的氨基糖甘磷酸轉(zhuǎn)移酶可以將 G418轉(zhuǎn)

2、變成無毒形式。當 neo 基因被整合進真核細胞基因組合適的地方后，則能啟動 neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為 mRN 陽而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖甘磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達，使細胞獲得抗性而能在含有 G418 的選擇性培養(yǎng)基中生長。利用 G418 篩選細胞：1、準備工作在篩選之前，一定要確定你的細胞對這一批 G418 的最佳篩選濃度。每種細胞對G418 的敏感性不同，一般變動在 100ug/ml1000ug/ml 范圍。分子克隆給出的幾個常用細胞系所需G41軸佳用量：細胞系或機體G418 濃度（ug/ml）中國倉鼠卵巢細胞700800Madin-Darby 犬腎細胞500人上皮 A431 細胞400猿 CV-

3、1 細胞500盤基網(wǎng)柄菌屬10-35植物10酵母1255002、確定最佳篩選濃度最適用量通過建立細胞死亡曲線獲得。將細胞稀釋至 1000cell/ml,每孔 100ul 加入有培養(yǎng)基的 24 孔板G418 濃度稀釋至 0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ug/ml等 12 個級別，培養(yǎng) 10-14天,以細胞全部死亡最低濃度為基準，一般 400-800 左右。篩選時比該濃度再高一個級別，維持時使用篩選濃度的一半即可。匯合度對 G418 篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時匯合度不宜超過 50%3、加藥時間一般要在轉(zhuǎn)染 24 小時之后才開始加 G

4、418 篩選（由于基因轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)之后要一段時間才能表達出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增殖較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒，最終導致篩選不出陽性克?。Ｃ?35d 更換一次含有 G418 的篩選液 （因為隨著細胞的代謝 G418 的濃度和活性都會下降），這時藥物濃度可以降至 200ug/ml04、培養(yǎng)液的使用加藥篩選約 6 天左右，細胞會大量死亡：非選擇性死亡： 死亡的細胞會裂解釋放出有害物質(zhì)，導致那些有 neo 表達的陽性細胞死亡。陽性細胞的狀態(tài)不佳甚至死亡：孔中細胞數(shù)目很少，細胞之間的信號會變得很弱，導致陽性細胞死亡這個時

5、候需要一種特殊的培養(yǎng)液：轉(zhuǎn)染前，在細胞匯合度達到 80%勺時候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按 1:1 混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應用這種培養(yǎng)基。5、挑選單克隆的優(yōu)化（篩選陽性克?。┠康模罕M量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響；增加陽性克隆的得率。方法：加藥后，在高倍鏡下，陽性克隆和陰性克隆很容易辨認，在陽性克隆下用記號筆做個標記。之后：套環(huán)法（結(jié)合有限稀釋法）：用套環(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或EDT 內(nèi)肖化， 把消化液吸到另外一個新的孔中培養(yǎng)。 最后再用有限稀釋法把陽性克隆在96 孔板中篩選。刮除法（結(jié)合有限稀釋法）：刮除陰性克隆，消化陽

6、性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)。最后再用有限稀釋法把陽性克隆在 96 孔板中篩選。6、鑒定之后一般經(jīng)過 4 周左右的篩選，得到的陽性克隆都比較穩(wěn)定。但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話，目的基因還是很容易丟失的。但是外源基因整合到基因組中的概率太小了，而且是隨機整合，會導致表達的目的蛋白的量產(chǎn)生很大差異。隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)， 那些丟失了外源基因的細胞和很少表達目的基因的細胞會占據(jù)優(yōu)勢，強表達目的蛋白的細胞會越來越少。這樣再次篩選是必不可少的。只有經(jīng)過 2 次以上的篩選之后才能找到那種我們想要的強分泌目的蛋白的，遺傳穩(wěn)定的細胞克隆。細胞克隆-有限稀釋法有限稀釋法采用梯變倍數(shù)稀釋的原則，將稀釋的細胞懸液接

7、種于微孔培養(yǎng)板中（也可在板上的 96 孔中直接稀釋）培養(yǎng)一定時間后，孔中可出現(xiàn)單個細胞克隆。本法不需特殊設(shè)備，操作簡單快速，適合大大批量克隆化培養(yǎng)?，F(xiàn)已廣泛用于異質(zhì)性細胞系的克隆化培養(yǎng)、誘導和分離，如耐藥性細胞株或高轉(zhuǎn)移性細胞株或突變細胞株以及單克隆抗體雜交瘤細胞株的克隆篩選中。取對數(shù)生長期的細胞制成懸液（貼壁細胞用 0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成），經(jīng)臺盼藍染色計數(shù)，測定活細胞數(shù)及濃度（細胞存活率及單個細胞百分率應高于 90 犯上）。將細胞懸液在試管中稀釋，用培養(yǎng)基將細胞稀釋至 50 個/ml、10 個/ml、5 個/ml,將 3 種稀釋度的細胞分別接種于 96 孔板中，每孔 100 間于 37C、5%CO2 下培養(yǎng)。次日在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)板各孔中的細胞數(shù)，挑選只含一個細胞的孔，做好標記并補加 10