基因工程的下游技術重組蛋白的表達,純化和分析

1、基因工程的下游技術基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析重組蛋白的表達、純化和分析 重組蛋白的表達重組蛋白的表達表達體系：表達體系： 表達載體表達載體 原核原核 受體細胞受體細胞 真核真核選擇表達載體常用的關鍵元件：選擇表達載體常用的關鍵元件：啟動子和調(diào)節(jié)序列（表達強弱、細胞或組織特啟動子和調(diào)節(jié)序列（表達強弱、細胞或組織特異性、表達調(diào)節(jié)等，如本實驗的乳糖操縱子。）異性、表達調(diào)節(jié)等，如本實驗的乳糖操縱子。）融合基因（純化、標簽，或增強蛋白可溶性等。融合基因（純化、標簽，或增強蛋白可溶性等。如多聚如多聚His標簽標簽6His，便于鎳柱親和層析純，便于鎳柱親和層析純化?；ST融合蛋白用融

2、合蛋白用GST柱親和層析）柱親和層析）分泌信號分泌信號篩選標記篩選標記其它其它6His 重組蛋白的純化重組蛋白的純化親和層析親和層析離子交換層析離子交換層析凝膠過濾層析凝膠過濾層析 本單元實驗流程：本單元實驗流程：細菌（細菌（pEF-GFPuv） 親和層析親和層析IPTG誘導誘導細菌總蛋白細菌總蛋白重組蛋白融合蛋白重組蛋白融合蛋白乳糖操縱子的特性乳糖操縱子的特性SDS-PAGE初步分析初步分析一一實驗目的實驗目的二二實驗原理實驗原理三三材料與試劑材料與試劑四四實驗儀器實驗儀器五五操作步驟操作步驟六六注意事項注意事項七七實驗安排實驗安排八八思考與討論思考與討論一一實驗目的實驗目的了解和掌握了解和

3、掌握IPTG誘導表達的原理。誘導表達的原理。了解降解物阻遏的現(xiàn)象及其機理。了解降解物阻遏的現(xiàn)象及其機理。二二實驗原理實驗原理操縱子是基因表達的協(xié)調(diào)單位。通常由操縱子是基因表達的協(xié)調(diào)單位。通常由2個以上功能相關的結構基因以及一些調(diào)節(jié)個以上功能相關的結構基因以及一些調(diào)節(jié)序列（如啟動子序列、操縱序列等）組成。序列（如啟動子序列、操縱序列等）組成。乳糖操縱子由三個結構基因乳糖操縱子由三個結構基因Z、Y、A和和操縱序列、啟動子、操縱序列、啟動子、CAP結合位點等調(diào)結合位點等調(diào)節(jié)序列組成。節(jié)序列組成。 乳糖操縱子的誘導表達乳糖操縱子的誘導表達l當沒有乳糖存在時，調(diào)節(jié)基因當沒有乳糖存在時，調(diào)節(jié)基因lacI表

4、達，轉錄表達，轉錄的的mRNA翻譯成阻遏蛋白。阻遏蛋白與操縱翻譯成阻遏蛋白。阻遏蛋白與操縱序列序列l(wèi)acO結合，阻礙了結合在旁邊啟動子的結合，阻礙了結合在旁邊啟動子的RNA聚合酶向前移動，使結構基因不能轉錄，聚合酶向前移動，使結構基因不能轉錄，也就不能翻譯出蛋白質(zhì)。也就是說，當沒有也就不能翻譯出蛋白質(zhì)。也就是說，當沒有乳糖存在時，乳糖操縱子處于阻礙狀態(tài)。乳糖存在時，乳糖操縱子處于阻礙狀態(tài)。 乳糖操縱子的誘導表達（續(xù)）乳糖操縱子的誘導表達（續(xù)）l當有乳糖存在時，乳糖轉化為異乳糖，異乳當有乳糖存在時，乳糖轉化為異乳糖，異乳糖作為誘導物與阻遏蛋白結合，使阻遏蛋白糖作為誘導物與阻遏蛋白結合，使阻遏蛋白

5、的構象發(fā)生改變，而不能結合到操縱序列上，的構象發(fā)生改變，而不能結合到操縱序列上，RNA聚合酶可以從啟動子向聚合酶可以從啟動子向3端移動，于是，端移動，于是，結構基因可以轉錄出結構基因可以轉錄出mRNA，然后翻譯出蛋，然后翻譯出蛋白質(zhì)。也就是說，當有乳糖存在時，乳糖操白質(zhì)。也就是說，當有乳糖存在時，乳糖操縱子被誘導?？v子被誘導。l 乳糖操縱子的誘導物是異乳糖。乳糖操縱子的誘導物是異乳糖。IPTG是異是異乳糖的結構類似物。由于乳糖的結構類似物。由于IPTG不會被分解，不會被分解，它的誘導作用是持久的。它的誘導作用是持久的。 乳糖操縱子的誘導表達（續(xù)）乳糖操縱子的誘導表達（續(xù)）l本實驗所使用的表達載

6、體上含有乳糖操縱子本實驗所使用的表達載體上含有乳糖操縱子的調(diào)節(jié)序列，目的基因為綠色熒光蛋白基因。的調(diào)節(jié)序列，目的基因為綠色熒光蛋白基因。在在IPTG的誘導下，目的基因表達可增強的誘導下，目的基因表達可增強105倍。然而，誘導表達常常受到溫度和誘導物倍。然而，誘導表達常常受到溫度和誘導物的影響。的影響。乳糖操縱子的降解物乳糖操縱子的降解物阻遏阻遏l當細菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中生長當細菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中生長時，通常優(yōu)先利用葡萄糖，而不利用乳糖。時，通常優(yōu)先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只有當葡萄糖耗盡后，細菌才能充分利用乳只有當葡萄糖耗盡后，細菌才能充分利用乳糖，這種現(xiàn)象稱葡萄糖效應

7、，其實質(zhì)是由葡糖，這種現(xiàn)象稱葡萄糖效應，其實質(zhì)是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又稱降解萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又稱降解物阻遏（物阻遏（catabolic repression）。）。乳糖操縱子的降解物乳糖操縱子的降解物阻遏（續(xù)）阻遏（續(xù)）l降解物降解物阻遏的機理：代謝物基因激活蛋白阻遏的機理：代謝物基因激活蛋白（Catabolite gene Activation Protein，CAP），又稱），又稱cAMP受體蛋白（受體蛋白（cAMP Receptor Protein，CRP）屬于激活蛋白的一）屬于激活蛋白的一種，對乳糖操縱子進行正調(diào)節(jié)。種，對乳糖操縱子進行正調(diào)節(jié)。 CAP分子內(nèi)

8、分別有分子內(nèi)分別有DNA結合區(qū)和結合區(qū)和cAMP結合結合區(qū)。當區(qū)。當CAP與與cAMP結合后，就可結合到結合后，就可結合到CAP結合位點上，促進轉錄。結合位點上，促進轉錄。 葡萄糖降解物能抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，葡萄糖降解物能抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，從而降低并活化磷酸二酯酶的活性，從而降低cAMP的濃度，抑制轉錄。的濃度，抑制轉錄。 阻遏蛋白負調(diào)節(jié)與阻遏蛋白負調(diào)節(jié)與CAP正調(diào)節(jié)的協(xié)調(diào)正調(diào)節(jié)的協(xié)調(diào) 當阻遏蛋白封閉轉錄時，當阻遏蛋白封閉轉錄時，CAP對該系統(tǒng)不能對該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用；而沒有發(fā)揮作用；而沒有CAP存在時，即使沒有阻存在時，即使沒有阻遏蛋白與操縱序列結合，操縱子

9、仍無轉錄活遏蛋白與操縱序列結合，操縱子仍無轉錄活性。只有在性。只有在CAP存在且沒有阻遏蛋白與操縱存在且沒有阻遏蛋白與操縱序列結合時，或者說只有高乳糖低葡萄糖時，序列結合時，或者說只有高乳糖低葡萄糖時，操縱子發(fā)揮最大轉錄活性。操縱子發(fā)揮最大轉錄活性。 這種協(xié)調(diào)與細菌對碳源的優(yōu)先利用相一致。這種協(xié)調(diào)與細菌對碳源的優(yōu)先利用相一致。The structure of lac operon調(diào)節(jié)序列調(diào)節(jié)序列結構基因結構基因Repressor and negative regulation異乳糖異乳糖異丙基硫代半乳糖苷異丙基硫代半乳糖苷異乳糖異乳糖CAP and positive regulation 低乳

10、糖時低乳糖時 高乳糖時高乳糖時在協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)下，在協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)下，lac operon的強誘導作用發(fā)生在高乳的強誘導作用發(fā)生在高乳糖、低葡萄糖的狀態(tài)。糖、低葡萄糖的狀態(tài)。三三材料與試劑材料與試劑1.材料材料 含含pUC18質(zhì)粒工程菌及含質(zhì)粒工程菌及含pGFPuv質(zhì)粒工質(zhì)粒工程菌。程菌。2.試劑試劑LB 液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基 ： 蛋白胨（蛋白胨（tryptone）10g、酵母粉（酵母粉（yeast extract）5g、NaCl 10g，加，加800mL雙蒸雙蒸水溶解，用水溶解，用10M NaOH調(diào)調(diào)pH至至7.2-7.5，定容至定容至1000mL。 分裝，高壓滅菌，分裝，高壓滅菌，4保存。保存。 氨芐

11、青霉素溶液：氨芐青霉素溶液： 無菌雙蒸水配成無菌雙蒸水配成100mg/mL，分裝，分裝，-20保保存，使用終濃度為存，使用終濃度為50g/mL或或100g/mL。 IPTG溶液：溶液： 將將238.3mg IPTG溶解于溶解于10mL雙蒸水，雙蒸水，0.22m細菌濾器過濾除菌，分裝，細菌濾器過濾除菌，分裝，-20保保存?zhèn)溆?，貯存濃度為存?zhèn)溆茫A存濃度為100 mM。 20%葡萄糖溶液：葡萄糖溶液： 20g葡萄糖溶解于適量雙蒸水，定容至葡萄糖溶解于適量雙蒸水，定容至100mL，121，15min 滅菌，滅菌，4保存。保存。四四實驗儀器實驗儀器 超凈工作臺、超凈工作臺、 恒溫搖床、離心機等。恒溫搖

12、床、離心機等。五五操作步驟操作步驟1.挑取含挑取含pUC18質(zhì)粒工程菌及含質(zhì)粒工程菌及含pGFPuv質(zhì)質(zhì)粒工程菌單菌落，分別接種于含氨芐青霉粒工程菌單菌落，分別接種于含氨芐青霉（終濃度為（終濃度為100g/mL，以下同以下同)的的5mL的的LB培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)基中，于37、250rpm過夜培養(yǎng)過夜培養(yǎng)12h-14h至對數(shù)生長期。至對數(shù)生長期。2.取取3支已滅菌的大試管，分別加入支已滅菌的大試管，分別加入5mL含含有氨芐青霉素的有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，編號為培養(yǎng)液，編號為1#，2#，3#，另取一個，另取一個250mL的滅菌三角瓶，的滅菌三角瓶，編號為編號為6#，加入，加入50mL含氨芐青霉素的

13、含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液。培養(yǎng)液。3. 1#：接：接50L空載工程菌（含空載工程菌（含pUC18）過夜培過夜培養(yǎng)物，養(yǎng)物，25-28培養(yǎng)培養(yǎng)10 h-12h； 2#：接：接50L重組菌（含重組菌（含pGFPuv）過夜培養(yǎng)過夜培養(yǎng)物，物，25-28培養(yǎng)培養(yǎng)10 h-12h； 3#：接：接50L重組菌（含重組菌（含pGFPuv ）過夜培養(yǎng)過夜培養(yǎng)物，物，37培養(yǎng)至培養(yǎng)至O.D600約為約為0.5（約（約3h-4h)，然后加入然后加入20%葡萄糖葡萄糖50L至終濃度為至終濃度為0.2%，及及100mM IPTG 5L至終濃度為至終濃度為0.1mM，25-28培養(yǎng)培養(yǎng)8h-10h或過夜；或過夜； 6#

14、：接：接500L重組菌（含重組菌（含pGFPuv）過夜培養(yǎng)過夜培養(yǎng)物，物，37培養(yǎng)至培養(yǎng)至O.D600約為約為0.5（約（約3h-4h)，然后只加入然后只加入100mM IPTG 50L至終濃度為至終濃度為0.1 mM，25-28培養(yǎng)培養(yǎng)8h-10h或過夜或過夜。4. 收集菌體。分別將收集菌體。分別將1#-3#全部培養(yǎng)物收集到全部培養(yǎng)物收集到三個三個7mL離心管中，編上相應編號，離心棄上離心管中，編上相應編號，離心棄上清；三角瓶培養(yǎng)的清；三角瓶培養(yǎng)的50mL菌液混勻后取菌液混勻后取5mL于于7mL離心管中（編號為離心管中（編號為4#），離心，上清收集），離心，上清收集到另一個指管，編號為到另一

15、個指管，編號為5#，其余的培養(yǎng)液用，其余的培養(yǎng)液用 50mL離心管于離心管于5000rpm，4，離心，離心10min，棄上清，菌體用裂解緩沖液重懸后用超聲波破棄上清，菌體用裂解緩沖液重懸后用超聲波破碎細胞或保存于碎細胞或保存于20備用（見實驗十二）。備用（見實驗十二）。 5. 于紫外燈下觀察于紫外燈下觀察1# -5#管收集的菌體或上清管收集的菌體或上清液，觀察哪支管有熒光，記錄觀察到的現(xiàn)象。液，觀察哪支管有熒光，記錄觀察到的現(xiàn)象。注意：把注意：把1#和和2#管置管置4保存。分別標保存。分別標Sample1和和Sample2。 1236pUC18pGFPuv挑取單菌落，接種于挑取單菌落，接種于5

16、mLLBA培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中。37過夜培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)。按按1:100接種接種對照對照IPTG+GlcIPTG12361234525 -28培養(yǎng)過夜培養(yǎng)過夜5000rpm離離心心，收菌體收菌體取取5mL離心離心其余離心收其余離心收菌體，提取菌體，提取蛋白蛋白六六注意事項注意事項1.本實驗的目的是比較該重組本實驗的目的是比較該重組DNA在大腸在大腸桿菌中表達時受桿菌中表達時受IPTG和葡萄糖存在的影和葡萄糖存在的影響。在轉管培養(yǎng)及收菌時要注意各管編響。在轉管培養(yǎng)及收菌時要注意各管編號要相應對好，不能混亂。號要相應對好，不能混亂。 1#、2#管不加管不加IPTG和葡萄糖。和葡萄糖。3#管除加管除加I

17、PTG外還加入葡萄糖（濃度要大于外還加入葡萄糖（濃度要大于0.2%以上）。以上）。 6#瓶僅加瓶僅加IPTG 。2. 不同的重組不同的重組DNA在不同的宿主菌中蛋白的在不同的宿主菌中蛋白的表達量往往受到表達量往往受到IPTG濃度和培養(yǎng)溫度的影濃度和培養(yǎng)溫度的影響。在科研中一般都采用不同溫度或不同響。在科研中一般都采用不同溫度或不同濃度的濃度的IPTG來誘導，以獲得最大的蛋白表來誘導，以獲得最大的蛋白表達量。達量。3. 本實驗所表達的綠色熒光蛋白基因，其產(chǎn)本實驗所表達的綠色熒光蛋白基因，其產(chǎn)物在大腸桿菌中有很強的熒光。離心后收物在大腸桿菌中有很強的熒光。離心后收集的菌體在紫外線的照射下可見黃綠色

18、熒集的菌體在紫外線的照射下可見黃綠色熒光，所以把光，所以把1#、2#、3#、4#沉淀菌體放在沉淀菌體放在紫外燈下觀察其是否有熒光以及熒光的強紫外燈下觀察其是否有熒光以及熒光的強弱，就可判斷其是否有表達及其所表達的弱，就可判斷其是否有表達及其所表達的強度。強度。七七實驗安排實驗安排 第一天：第一天： 上午配試劑，滅菌；上午配試劑，滅菌； 下午開始接種，約下午開始接種，約3 h-4h后開始誘導。后開始誘導。（步驟（步驟2、3） 第二天：第二天： 收菌、紫外觀察結果和拍照；收菌、紫外觀察結果和拍照； 破碎細菌，分離上清，待過柱。破碎細菌，分離上清，待過柱。八八思考與討論思考與討論1.對紫外燈下觀察到

19、的結果作出解釋。對紫外燈下觀察到的結果作出解釋。2.為什么誘導表達的大腸桿菌要在其為什么誘導表達的大腸桿菌要在其OD600濃度約為濃度約為0.5時加入時加入IPTG？3.大腸桿菌的誘導表達常受哪些因素的影大腸桿菌的誘導表達常受哪些因素的影響？響？一一實驗目的實驗目的二二實驗原理實驗原理三三材料與試劑材料與試劑四四實驗儀器實驗儀器五五操作步驟操作步驟六六注意事項注意事項七七實驗安排實驗安排八八思考與討論思考與討論一實驗目的一實驗目的 學習親和層析的原理。學習親和層析的原理。 掌握親和層析法分離蛋白質(zhì)的技術與掌握親和層析法分離蛋白質(zhì)的技術與操作。操作。二二實驗原理實驗原理 以普通凝膠作載體，連接上

20、金屬離子制成螯以普通凝膠作載體，連接上金屬離子制成螯合吸附劑，用于分離純化蛋白質(zhì)，這種方法合吸附劑，用于分離純化蛋白質(zhì)，這種方法稱為金屬螯合親和層析。稱為金屬螯合親和層析。 蛋白質(zhì)對金屬離子具有親和力是這種方法的蛋白質(zhì)對金屬離子具有親和力是這種方法的理論依據(jù)。已知蛋白質(zhì)中的組氨酸和半胱氨理論依據(jù)。已知蛋白質(zhì)中的組氨酸和半胱氨酸殘基在接近中性的水溶液中能與鎳或銅離酸殘基在接近中性的水溶液中能與鎳或銅離子形成比較穩(wěn)定的絡合物，因此，連接上鎳子形成比較穩(wěn)定的絡合物，因此，連接上鎳或銅離子的載體凝膠可以選擇性地吸附含咪或銅離子的載體凝膠可以選擇性地吸附含咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì)。唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì)

21、。 過渡金屬元素鎳在較低過渡金屬元素鎳在較低pH范圍時（范圍時（pH 6-8），），有利于選擇性地吸附帶咪唑基和巰基有利于選擇性地吸附帶咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì)。在堿性的肽和蛋白質(zhì)。在堿性pH時吸附更有效，時吸附更有效，但選擇性降低。但選擇性降低。 金屬螯合親和層析在很大程度上，由被吸金屬螯合親和層析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白質(zhì)分子表面咪唑基和巰基的附的肽和蛋白質(zhì)分子表面咪唑基和巰基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。 用用IPTG誘導表達的蛋白質(zhì)含有特定的組氨誘導表達的蛋白質(zhì)含有特定的組氨酸標簽，這種可溶性蛋白質(zhì)能用金屬親和酸標簽，這種可溶性蛋白質(zhì)

22、能用金屬親和層析法進行分離，且操作簡單，快速，純層析法進行分離，且操作簡單，快速，純化效率高?；矢摺Ｈ牧吓c試劑材料與試劑1.材料材料 含含pUC18質(zhì)粒工程菌及含重組質(zhì)粒工程菌及含重組pGFPuv質(zhì)粒質(zhì)粒工程菌經(jīng)誘導表達的細胞裂解蛋白。工程菌經(jīng)誘導表達的細胞裂解蛋白。2.試劑試劑0.05mol/L EDTA-0.5mol/L NaCl溶液溶液 50mL2mol/L NaCl 溶液溶液 50mL1mol/L NaOH溶液溶液 50mL0.2mol/L NiSO4溶液溶液 30mL 起始緩沖液：起始緩沖液：50mmol/L Tris-HCl; 500mmol/L NaCl; pH7.0 5

23、00mL Chelating Sepharose Fast Flow 4-5 mL 大腸桿菌細胞裂解蛋白樣品大腸桿菌細胞裂解蛋白樣品 10-20mL 洗滌液：洗滌液：50mmol/L咪唑；咪唑；50mmol/L Tris-HCl； 0.5mol/L NaCl，pH 7.0 洗脫液：洗脫液：300mmol/L咪唑；咪唑；50mmol/L Tris-HCl；0.5mol/L NaCl，pH7.0 四四實驗儀器實驗儀器 1.5cm X 50cm層析柱、自動分部收集層析柱、自動分部收集器、紫外分光光度計、紫外檢測儀及器、紫外分光光度計、紫外檢測儀及記錄儀等。記錄儀等。五五操作步驟操作步驟1.樣品的制備

24、樣品的制備: 細胞的培養(yǎng)及熒光蛋白表達見實驗十，細胞的培養(yǎng)及熒光蛋白表達見實驗十，細胞的破碎及蛋白的收集如下：細胞的破碎及蛋白的收集如下： 收集在收集在25培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)液，5000r/min，離心離心10min，去上清液，菌體用起始緩沖液去上清液，菌體用起始緩沖液洗滌一次，離心收集菌體，用三分之一洗滌一次，離心收集菌體，用三分之一（細胞培養(yǎng)液）體積（細胞培養(yǎng)液）體積（15mL）的起始緩沖）的起始緩沖液充分懸浮，冰浴下進行超聲波處理，功液充分懸浮，冰浴下進行超聲波處理，功率為率為400W，工作工作4秒，間隙秒，間隙4 秒，為一次，秒，為一次，99次為一周期。共處理六周期。然后

25、次為一周期。共處理六周期。然后8000r/min,離心離心30min，取上清液。放冰箱取上清液。放冰箱備用。備用。2. 親和層析柱的安裝親和層析柱的安裝 把層析柱固定在鐵支架上，柱下端出把層析柱固定在鐵支架上，柱下端出口封閉。加入少量的無離子水，排去下端口封閉。加入少量的無離子水，排去下端的空氣泡。取出的空氣泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝膠乙醇浸泡的螯合凝膠4mL到燒杯中，加入少量的無離子水制成到燒杯中，加入少量的無離子水制成糊狀，沿著貼緊柱內(nèi)壁的玻璃棒把糊狀凝糊狀，沿著貼緊柱內(nèi)壁的玻璃棒把糊狀凝膠倒進柱內(nèi)，打開下端的排水口，讓親和膠倒進柱內(nèi)，打開下端的排水口，讓親和凝膠劑隨水流自然沉下。親和

26、層析劑為凝膠劑隨水流自然沉下。親和層析劑為4-5mL。3. 親和凝膠的再生處理：親和凝膠的再生處理： 用用10 倍柱體積的再生溶液（倍柱體積的再生溶液（0.05mol/L EDTA、 0.5mol/L NaCl）過柱，流速過柱，流速3mL/min。1drops/2s! 用用5倍柱體積的倍柱體積的2 mol/L NaCl 溶液洗親和層析柱除溶液洗親和層析柱除去多余的去多余的EDTA。流速。流速3mL/min。 用用5倍柱體積的倍柱體積的1 mol/L NaOH溶液洗滌層析柱，流溶液洗滌層析柱，流速速2mL/min。 用用10倍柱體積的無離子水洗至倍柱體積的無離子水洗至pH8-9，流速流速3mL/

27、min。 用用2倍柱體積的倍柱體積的0.2mol/L的硫酸鎳溶液過層析柱，使的硫酸鎳溶液過層析柱，使凝膠金屬鎳離子結合凝膠金屬鎳離子結合, 流速流速2mL/min。過完后放置。過完后放置5 分鐘。分鐘。 用用10倍柱體積的無離子水洗滌層析柱除去多余的鎳倍柱體積的無離子水洗滌層析柱除去多余的鎳離子。流速離子。流速3mL/min。 用用5 倍柱體積的起始緩沖溶液平衡層析柱，備用。倍柱體積的起始緩沖溶液平衡層析柱，備用。4. 上樣：上樣： 先從先從15mL裂解上清液中取出裂解上清液中取出50L準備用于準備用于電泳，作為親和層析分離前上清液中的總蛋區(qū)電泳，作為親和層析分離前上清液中的總蛋區(qū)帶對照圖譜（

28、帶對照圖譜（Sample3）。然后以每分鐘）。然后以每分鐘1mL的的流速上層析柱，分部收集流出液，每管流速上層析柱，分部收集流出液，每管3mL，（測得的（測得的OD280值曲線為穿流峰，取最高的一管值曲線為穿流峰，取最高的一管樣品液用作電泳，標樣品液用作電泳，標Sample4）。再用）。再用10mL起起始緩沖液過層析柱，操作同前。始緩沖液過層析柱，操作同前。5. 洗滌：洗滌： 用含用含50 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液咪唑的洗滌緩沖液25mL洗脫洗脫，分部收集洗脫液，每管，分部收集洗脫液，每管5mL，取中間管樣品取中間管樣品電泳（電泳（Sample5） 。6. 洗脫：洗脫： 用含用含300mm

29、ol/L咪唑的洗脫緩沖液咪唑的洗脫緩沖液10mL洗脫洗脫，用，用Ep管分部收集洗脫液。每管收管分部收集洗脫液。每管收0.5mL。（。（測得的測得的OD280值曲線峰為目的蛋白峰值曲線峰為目的蛋白峰GFP，標，標Sample6 ）。）。7. 12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測：聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測：進行進行12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測親和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測親和層析分離純化的結果。層析分離純化的結果。Sample1-6，外加，外加Marker（見實驗十一）。（見實驗十一）。 六六注意事項注意事項1. 不管是裝柱還是上樣、洗脫，在整個操作過不管是裝柱還是上樣、洗脫，在整個操作過程

30、中，水或溶液面都不能低于凝膠柱平面。程中，水或溶液面都不能低于凝膠柱平面。否則，凝膠柱會產(chǎn)生氣泡，就會影響層析效否則，凝膠柱會產(chǎn)生氣泡，就會影響層析效果。果。2. 樣樣品上柱和洗脫過程，其流速都要慢，分離品上柱和洗脫過程，其流速都要慢，分離效果才好。效果才好。3. 親和層析劑可回收，經(jīng)再生可循環(huán)使用。該親和層析劑可回收，經(jīng)再生可循環(huán)使用。該親和層析劑用親和層析劑用20%20%乙醇浸泡于冰箱保存。乙醇浸泡于冰箱保存。4. 親和層析柱在再生處理、上樣、洗脫過程中親和層析柱在再生處理、上樣、洗脫過程中其顏色都有明顯變化（白、藍、綠），只要其顏色都有明顯變化（白、藍、綠），只要細心操作，樣品是否被吸附

31、上去或被洗脫下細心操作，樣品是否被吸附上去或被洗脫下來？都能觀察到從而作出判斷。來？都能觀察到從而作出判斷。七七實驗安排實驗安排 先用母液配制其它未配制溶液，再生先用母液配制其它未配制溶液，再生鎳柱；然后，過柱純化重組蛋白。鎳柱；然后，過柱純化重組蛋白。 八八思考與討論思考與討論1.解釋解釋IPTG誘導表達的熒光蛋白經(jīng)誘導表達的熒光蛋白經(jīng)12 SDS-PAGE電泳結果圖譜。電泳結果圖譜。2.鎳柱在再生處理、上樣、洗脫過程鎳柱在再生處理、上樣、洗脫過程中其顏色有何變化？為什么？中其顏色有何變化？為什么？3.要達到好的分離效果要注意哪些問要達到好的分離效果要注意哪些問題？題？一一實驗目的實驗目的二

32、二實驗原理實驗原理三三材料與試劑材料與試劑四四實驗儀器實驗儀器五五操作步驟操作步驟六六注意事項注意事項七七實驗安排實驗安排八八思考與討論思考與討論一一.實驗目的實驗目的 1. 了解了解SDS-PAGE靈敏度高，分辯率強的靈敏度高，分辯率強的原理。原理。2. 用此法分析不同條件下培養(yǎng)的菌其熒光用此法分析不同條件下培養(yǎng)的菌其熒光蛋白表達情況。蛋白表達情況。 二二實驗原理實驗原理 聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide,簡稱簡稱

33、ACR）和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 簡稱簡稱BIS）在催化在催化劑的作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結構的劑的作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結構的凝膠，通過改變單體濃度與交聯(lián)劑的比例可凝膠，通過改變單體濃度與交聯(lián)劑的比例可以得到不同孔徑的凝膠。以得到不同孔徑的凝膠。 聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：（1）化學聚合：催化劑采用過硫酸銨，加）化學聚合：催化劑采用過硫酸銨，加速劑為速劑為N、N、N、N四甲基乙二胺（簡四甲基乙二胺（簡稱稱TEMED）。）。通常控制這兩種溶液的用量通?？刂七@兩種

34、溶液的用量使聚合在使聚合在1h內(nèi)完成。（內(nèi)完成。（2）光聚合：通常用）光聚合：通常用核黃素為催化劑，通過控制光照時間和強度核黃素為催化劑，通過控制光照時間和強度來控制聚合時間也可加速反應。本實驗采用來控制聚合時間也可加速反應。本實驗采用化學聚合。聚丙烯酰胺凝電泳常分為二大類：化學聚合。聚丙烯酰胺凝電泳常分為二大類：第一類為連續(xù)的凝膠（僅有分離膠）電泳；第一類為連續(xù)的凝膠（僅有分離膠）電泳；第二類為不連續(xù)的凝膠（濃縮膠和分離膠）第二類為不連續(xù)的凝膠（濃縮膠和分離膠）電泳。電泳。通常聚丙烯酰胺凝膠（不連續(xù)）電泳有三種通常聚丙烯酰胺凝膠（不連續(xù)）電泳有三種效應：電荷效應；（電泳物所帶電荷的差效應：電

35、荷效應；（電泳物所帶電荷的差異性）。異性）。 凝膠的分子篩效應。（凝膠的網(wǎng)凝膠的分子篩效應。（凝膠的網(wǎng)狀結構及電泳物的大小形狀不同所致）濃狀結構及電泳物的大小形狀不同所致）濃縮效應，（凝膠濃度的不連續(xù)性、緩沖液離縮效應，（凝膠濃度的不連續(xù)性、緩沖液離子成分的不連續(xù)性、電位梯度的不連續(xù)性以子成分的不連續(xù)性、電位梯度的不連續(xù)性以及及pH的不連續(xù)性所致）。因此，樣品分離效的不連續(xù)性所致）。因此，樣品分離效果好，分辨率高。果好，分辨率高。SDS-PAGE，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS（十二烷基磺酸鈉）。十二烷基磺酸鈉）。SDS破壞蛋白質(zhì)的破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結構；

36、強還原劑使半胱氨酸之間二級和三級結構；強還原劑使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，因此，蛋白質(zhì)在一定濃度的的二硫鍵斷裂，因此，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強還原劑的含有強還原劑的SDS溶液中，與溶液中，與SDS分子按比分子按比例結合，形成帶負電荷的例結合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質(zhì)復合物。蛋白質(zhì)復合物。這種復合物由于結合大量的這種復合物由于結合大量的SDS，降低或消除，降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異。而了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異。而由于由于SDS與蛋白質(zhì)的結合是按大小成比例的，與蛋白質(zhì)的結合是按大小成比例的，在進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決在進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決

37、于分子大小。當分子量在于分子大小。當分子量在15KD到到200KD之間之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關系，符合下式：關系，符合下式：logMW=K-bX，式，式中：中：MW為分子量，為分子量，X為遷移率，為遷移率，k、b均為常數(shù)。均為常數(shù)。三三試劑試劑30%的凝膠貯備液的凝膠貯備液: Acr 29g + Bis 1g溶于溶于100mL去離子水中。避去離子水中。避光貯存棕色瓶中。光貯存棕色瓶中。3M Tris-HCl (pH8.9): 36.6g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至至100mL5Tris-甘氨酸電泳甘氨

38、酸電泳buffer（pH8.3): Tris-base15.1g + 甘氨酸甘氨酸94g + 5gSDS + H2O至至1L（用時稀釋用時稀釋5倍）。倍）。 10%SDS：10g SDS溶解于溶解于100mL去離子水去離子水中，貯存于室溫中。中，貯存于室溫中。0.5M Tris-HCl(pH6.8): 6.05g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至至100mLTEMED(四甲基乙二胺四甲基乙二胺):濃度濃度10%，20 mL (共用共用)10% AP(過硫酸銨過硫酸銨):10 mL，1g AP溶解于溶解于10mL去離子水中，新鮮配制。去離子水中，新鮮配制。 2x樣品

39、緩沖液樣品緩沖液： 100mM Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT(二硫蘇糖醇二硫蘇糖醇) 4% SDS 0.2% 溴酚藍溴酚藍 20% 甘油甘油 考馬斯亮藍染色液：考馬斯亮藍染色液：0.25g考馬斯亮藍考馬斯亮藍R250溶溶于于45mL甲醇中，加甲醇中，加10mL冰醋酸冰醋酸 + H2O至至100mL。（。（濾紙過濾除去不溶物）濾紙過濾除去不溶物） 脫色液：脫色液：75mL冰乙酸冰乙酸 + 50mL甲醇甲醇 + 875mL H2O（如只配（如只配500mL，各物質(zhì)減半），各物質(zhì)減半）四四實驗儀器實驗儀器 電泳儀、垂直板電泳裝置、微量進電泳儀、垂直板電泳裝置、微量進樣器（樣器（

40、5050LL）、染色、染色/ /脫色搖床等。脫色搖床等。五五操作步驟操作步驟1.膠板模型的安裝：在干凈的帶隔板的玻璃板膠板模型的安裝：在干凈的帶隔板的玻璃板的三條邊上把橡膠條壓上，然后將另一塊凹的三條邊上把橡膠條壓上，然后將另一塊凹形玻璃板壓上，放入電泳槽中。（示范）形玻璃板壓上，放入電泳槽中。（示范）2.12%分離膠的制備（每次配分離膠的制備（每次配10 mL） 去離子水去離子水 3.2mL 30% 凝膠液凝膠液 4.0mL 3mol/L Tris-HCl(pH8.9) 2.6mL 10% SDS 0.1mL 10% APS 0.1mL TEMED 0.005mL 用手輕搖約用手輕搖約2分鐘

41、混勻分鐘混勻(注意不要產(chǎn)生氣注意不要產(chǎn)生氣泡）泡）,小心將混合液注入準備好的玻璃板間隙小心將混合液注入準備好的玻璃板間隙中，為濃縮膠留足夠的空間，輕輕在頂層加中，為濃縮膠留足夠的空間，輕輕在頂層加入幾毫升去離子水復蓋，以阻止空氣中氧對入幾毫升去離子水復蓋，以阻止空氣中氧對凝合的抑制作用。剛加入水時可看出水與膠凝合的抑制作用。剛加入水時可看出水與膠液之間有界面，后漸漸消失，不久又出現(xiàn)界液之間有界面，后漸漸消失，不久又出現(xiàn)界面，這表明凝膠已聚合。再靜置片刻使聚合面，這表明凝膠已聚合。再靜置片刻使聚合完全。完全。 ！注意：為避免凝膠過快聚合，配膠用的無！注意：為避免凝膠過快聚合，配膠用的無離子水、離

42、子水、30%的凝膠液及的凝膠液及Tris-HCl緩沖液應緩沖液應事先于事先于4或冰上放置或冰上放置,以下同。以下同。3. 濃縮膠的制備：先吸去已聚合好的分離膠上濃縮膠的制備：先吸去已聚合好的分離膠上層的水，用水洗界面一次，再用濾紙吸干殘層的水，用水洗界面一次，再用濾紙吸干殘留的水液。按下列配方制備留的水液。按下列配方制備5毫升濃縮膠溶液。毫升濃縮膠溶液?；旌虾髮⑵渥⑷敕蛛x膠上端，插入梳子應小混合后將其注入分離膠上端，插入梳子應小心避免氣泡。心避免氣泡。 去離子水去離子水 3.2mL 30% 凝膠液凝膠液 0.83mL 0.5M Tris-HCl(pH6.8) 0.75mL 10% SDS 0.

43、050mL 10% AP 0.050mL TEMED 0.005mL4. 在濃縮膠聚合的同時，將樣品與在濃縮膠聚合的同時，將樣品與5樣品緩沖樣品緩沖液（液（16L 4L）混合，）混合，100加熱加熱3分鐘以分鐘以變性蛋白質(zhì)。變性蛋白質(zhì)。Sample1,2用用600L起始緩沖液起始緩沖液懸浮，取懸浮，取16L同上操作。同上操作。5. 濃縮膠聚合完全后，小心地拔出梳子，用無濃縮膠聚合完全后，小心地拔出梳子，用無離子水沖洗梳孔，將凝膠模板放入電泳槽上離子水沖洗梳孔，將凝膠模板放入電泳槽上固定好，上下槽均加入固定好，上下槽均加入1X電泳緩沖液，檢查電泳緩沖液，檢查有無漏液，除去兩玻璃板間凝膠底部的氣泡

44、，有無漏液，除去兩玻璃板間凝膠底部的氣泡，上樣前用上槽緩沖液沖洗梳子孔。上樣前用上槽緩沖液沖洗梳子孔。6. 按次序上樣：用微量進樣器往凝膠梳孔中加按次序上樣：用微量進樣器往凝膠梳孔中加樣品混合液，樣品混合液，20L/孔，一孔加一個樣品，同孔，一孔加一個樣品，同時安排已知分子量的標準物作對照。時安排已知分子量的標準物作對照。7. 電泳：開始時濃縮膠電壓為電泳：開始時濃縮膠電壓為80V，染料進入，染料進入分離膠后，將電壓增到分離膠后，將電壓增到120V，繼續(xù)電泳至染，繼續(xù)電泳至染料（溴酚藍）到分離膠底部，斷開電源。料（溴酚藍）到分離膠底部，斷開電源。8固定及染色：取下凝膠放入大培養(yǎng)皿，用考固定及染色：取下凝膠放入大培養(yǎng)皿，用考馬斯藍染色液