激光掃描共聚焦顯微鏡操作流程詳解

1、激光川描共聚焦顯微鏡(laserscanningconfocalmicroscope)激光掃描共聚共顯微tft(lascrscanningconfocalmicroscope).英文簡寫LSCM,俗稱confbcaLLSCM足一神高科技顯微或，屬J,最先進(jìn)的細(xì)飽生物學(xué)分析儀曙.我們學(xué)院便用的是瑞上供K公司(Leica)的TCSSP5型號的LSCM.使用流程1、登陸即W10.31.60.139或5號樓606室公用電腦卜我激光共聚焦預(yù)約使用審核表，打印并填寫。2、聯(lián)系盧劍清(手機(jī)審核井卷名。3,持已簽名的激光共聚焦開(約使用審核表至5號樓610室預(yù)約使用時(shí)間，及領(lǐng)取鑰匙,

2、聯(lián)系人:竇凱飛(手機(jī).4 .在熟練使用者的指導(dǎo)下，進(jìn)行實(shí)驗(yàn).5 .實(shí)聆結(jié)束,及時(shí)歸還餌匙儀器構(gòu)造和原理LSCM的柒木結(jié)構(gòu)上要包括熒尤顯微俄系統(tǒng)及樣品臺、激光發(fā)射如掃描得、依測SS、圖像"儲(chǔ)處理和輸出設(shè)備,計(jì)算機(jī)控慟系統(tǒng).激光光源：激光掃描束轉(zhuǎn)質(zhì)明柱孔形成點(diǎn)光源,普通顯微健來用的白然光或燈光是一種場光源.M本上每一點(diǎn)的圖像都會(huì)受到鄰近點(diǎn)的衍射光或散見光的擾c向LSCM以激光為光源,激光具有單色性強(qiáng).方向性好.高亮度.相干性好等優(yōu)點(diǎn)，可以避免普通顯微鏡的塊點(diǎn).一般常用的氣體激光器加總(Ar).找(Kr)、加Nc).illuminatingpinhole(照明針孔

3、):使激光經(jīng)過照明針孔后形成點(diǎn)光源，點(diǎn)光源II有光源方向性強(qiáng)、發(fā)散小、亮度高、高度的空間和時(shí)間相干性以及平面偏振激發(fā)等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。且與deleterpinhole(探沌器針孔)及焦平面形成共聚悠裝花.分光值(BeamSpHttcrh點(diǎn)光源發(fā)出的光勢分光鏡反射后,通過物儻在樣品聚出.對標(biāo)本內(nèi)愈平而上的衍一點(diǎn)進(jìn)行掃描,Focalplane(保平面)s激光點(diǎn)光源制射物體在焦平面處聚£"激發(fā)熒光標(biāo)記的樣木發(fā)射熒光，形成焦點(diǎn)光斑.該光應(yīng)經(jīng)過物盤和分光慷等一系列裝置的處理，分別在1M此CL及探測針孔兩處聚焦。共聚焦的含義由此向來。昧本上的被照射點(diǎn)所發(fā)射的熒光沿同一光路進(jìn)入物鏡，穿過分光

4、信后在探到骨孔處成像.該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋.然后經(jīng)探測針孔后的光電信炳管(PMT)或冷電感件合爆件(cCCD)逐點(diǎn)或逐城接收,將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，傳箱至?jì)算機(jī)，迅速在屏幕上形成熒光圖像。PMTD«KtorDiciwoteConfocdA|»nuieSourceLSCM是在熒光院微儻的基礎(chǔ)上用激光作掃描光源.逐點(diǎn).逐行、逐血快速掃描成像掃描的激光1熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的康點(diǎn)即掃描激光的聚集點(diǎn).也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn).由于激光束的波長較短，光束於弱，所以共聚焦激光掃描顯做俄口較高的分辨力.大約是普通光學(xué)顯微值的3倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限儲(chǔ)在樣品的一個(gè)平面內(nèi)

5、。調(diào)你深度不一樣時(shí),就可以獲得樣品不同深度層次的圖像.這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi).通過計(jì)算機(jī)分析和模擬就能顯示細(xì)闌樣枯的立體結(jié)構(gòu).Bi'尤Q人=«*»蘇M儀器用途1.原位簽定細(xì)胞或組織內(nèi)生物大分子,觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)：在細(xì)胞原位檢測核驗(yàn)原位依測蛋白時(shí)抗體及其他分子檢測細(xì)胞凋亡細(xì)胞器觀察及測定依測細(xì)胞融合觀察細(xì)胞骨架檢測細(xì)胞內(nèi)脂肪2、活體細(xì)胞或組統(tǒng)功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測：實(shí)時(shí)定所測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化測定細(xì)胞內(nèi)PH變化e測膜電位的變化檢測細(xì)胞內(nèi)活性加物種的產(chǎn)生愴測藥物等胎膜進(jìn)入組織或細(xì)胞過程及其定位檢測熒光共振能年轉(zhuǎn)移(FRET)檢測熒光漂白恢復(fù)(FRAP)樣品制

6、備1 .組織切片林本實(shí)收標(biāo)本要求單層，并能很好地貼附在樣M池中©所以，邠織標(biāo)本無論是石蛾切片還是濃凍切片，均為越薄越好.2 .細(xì)胞標(biāo)本細(xì)胞種類和純度，細(xì)胞密度和形態(tài)。3 .承載細(xì)胞的器皿Petri皿和玻片.操作步驟一、開機(jī)1 .依次打開電腦桌右蝴'PCMicroscope"、"SeannsPower"及"LaserPower”二個(gè)圓形按鈕，然后將“LaserPower，按鈕右費(fèi)|的激光開關(guān)鑰匙(LaserEmission)順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90度至3加1”位置.記錄開機(jī)時(shí)間.2 .打開顯微境電源,及熒光電源。3 .雙擊電眄顯示屏里面上的“LAS

7、AF閨標(biāo)啟動(dòng)株卡共聚焦軟件。4 .如需使用快掃系統(tǒng)，在“ActivateResonantScanner'選項(xiàng)前打勾©5 .點(diǎn)擊PK,以打開軟件.打開后顯示LASAF密"界面.三、在顯微餓卜觀察樣品1 .選界合適的物境,可通過顯微位主機(jī)在伽的物位軋換按鈕，或軟件中的Pbjectives”健進(jìn)行選抨.2 .將樣品置于我物臺匕在明場條件卜選擇合適的視野。通過顯微能上機(jī)右側(cè)的按鈕進(jìn)行調(diào)焦，以及顯微鏡主機(jī)左便的TN功能鍵調(diào)節(jié)光強(qiáng).3 .按叮I/L”功能鍵轉(zhuǎn)換至熒光觀察方法，通過顯微鏡前面板的按鈕選擇介適的熒光口蟻，進(jìn)行樣M的熒光觀察。4 .觀察兌華后，按顯微值而面板上的熒光S

8、HUTTER,健以保護(hù)樣品.一八采集共聚焦圖像1 .點(diǎn)擊T具欄卜方的PonGguraiiofT.再點(diǎn)擊“Laser用對勾打開所需激光.如需使用Ar離子激光，拖動(dòng)滑塊溫節(jié)激光輸出功率.激光激發(fā)波長405Diode405nmAigou458.476.488.514mnHeNe543543nmDPSS561561nmHeNe633633mu2 .點(diǎn)擊“Aquire”進(jìn)行光路設(shè)置。調(diào)用已有的設(shè)置：選擇“Load/Savesinglesettin葭下拉菜單中已有的設(shè)置(激光及其摘出功率.分光信,檢測波長范圍、PMT的gain及。附el),常用的熒光染料都已包含在內(nèi).選擇某一設(shè)置后,可按樣從的實(shí)際常要對參

9、數(shù)進(jìn)行優(yōu)化(如后述)，并以新的名稱保。修改已有設(shè)置：可改變所選激光、調(diào)節(jié)激光輸出功率、改變分光鏡、改變所選PMT、調(diào)節(jié)PMT檢測的圍、調(diào)節(jié)PMT的gain或offset等。建立新的設(shè)甘：也可從零開始建立新的設(shè)置.選界所需激光及其功率、適宜的分光鏡、PMT及檢測波長范困。對雙重或多重染色的樣品，可選擇同時(shí)采圖或序列采圖的方式。推薦使用后者，因其可避免染料交叉激發(fā)和串色導(dǎo)致的結(jié)果不準(zhǔn)確。進(jìn)行序列掃描而，需分別設(shè)置用一通道的采圖參數(shù).3 .透射光檢測甥的選擇單曲,AdditionalChannel，”以顯示透射光檢測器LPMTTrans”)，選擇觀察方法(BF.DIC等)。4 .選擇掃描模式在“Ac

10、quire”菜單欄的“Acquisition”中選擇掃描模式("AcquisitionMode”)。默認(rèn)模式為xyz掃描，是最常用的掃描模式，可用于xy掃描和z軸層切(xyz掃描)。還可按樣品掃描需要在下拉菜單中選擇由x,y,2,t(時(shí)間)以及九(波長)組合而成的多維掃描模式,如xzy.xyt,xy人.xyzt,xyzX,xyzlt等.5 .設(shè)置掃描參數(shù)在“Acquire”菜單欄的“Acquisition”中設(shè)置掃描參數(shù),包拈分辨率pixelformats燈描速度(scanningspeed)>針孔大小(pinholesize)線平均(lineaveraging)而平均(fra

11、meaveraging)、累加(accumulation)及放大倍數(shù)(zoom)等.分辨率：默認(rèn)值為512x512。也可選擇更低或更高分辨率分辨率越高，所獲取的圖像文件也越大掃描速度：默認(rèn)值為400Hz,活細(xì)胞或運(yùn)動(dòng)的樣品成像可能需要更快的速度?？蛇x擇雙向掃描("bidirectionalscanning)來達(dá)到更高速度，這時(shí)可能需要進(jìn)行相位(母hase”)調(diào)節(jié),一/針孔大小：默認(rèn)值為lAiry.如果樣品的熒光非常如，可通過增大針孔直徑來增加信號強(qiáng)度，但所獲取圖像不是真正的共聚焦圖像，平均：用于降低背景噪音分為“Lineaveraging*5(線平均)和“Frameaveraging

12、”(面平均)，線平均較快，可在下拉菜單.中選擇平均的次數(shù)°兩種平均方式可結(jié)合使用°累加：僅用于熒光非常弱的樣品.6 .預(yù)覽圖像點(diǎn)擊“Liv/以設(shè)定的掃描參數(shù)預(yù)覽圖像，圖像將顯示在右側(cè)的顯示屏上。7 .優(yōu)化掃描參數(shù)預(yù)覽圖像時(shí)，調(diào)節(jié)z軸位宜找到最適合觀察的焦平面，并調(diào)節(jié)PMT的電壓(PMTgam)及偏移(PMT。抵et),或激光愉出功率使圖像達(dá)到最佳,可通過控制面板上相應(yīng)旋鈕調(diào)節(jié)以上參數(shù).理想的熒光圖像中應(yīng)該只有少數(shù)象素點(diǎn)達(dá)到飽和(即灰階為255),可通過位于圖像左便的LUT按鈕進(jìn)行觀察LUT按鈕可在LUT(即指定的熒光顏色)、“GlowOverUnder(GlowOU)”和灰

13、度圖三檔之間切換在GbwOU中.灰階為255的象素點(diǎn)以不為苣色，而灰階為0的軟素點(diǎn)顯不為綠色，調(diào)節(jié)PMT的電壓使圖像中僅少數(shù)象素點(diǎn)顯示藍(lán)色.應(yīng)使用較低的激光輸出功常和較高的PMT電壓值，這有助于保護(hù)樣品免受光漂白的影響.可通過調(diào)節(jié)PMT的偏移值來降低圖像的背景。熒光圖像PMT偏移的默認(rèn)把為0%,且調(diào)節(jié)過程中不應(yīng)使其大于(>%對透射光圖像.同樣可以調(diào)節(jié)透射光PMT的電壓和偏移值來進(jìn)行優(yōu)化，但時(shí)可將偏移位訓(xùn)至高0%以增加對比度©圖像調(diào)至滿意后，單擊“Stop”終止預(yù)覽過程.8 .采集圖像單擊。pturcImage”采集圖像在此之前可改變分辨率、線湎平均次數(shù)等掃描參數(shù)。通常情況卜，預(yù)

14、覽圖像時(shí)選擇512*512的分辨率，而采集圖像時(shí)可增加至1024x1024。四、序列掃描如果樣品采用兩種或以上熒光染料標(biāo)記，為避免申色對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，可采用序列掃描的方式.1 .單ilTAcqukition”中的teq”按鈕，軟件界而中將出現(xiàn)一個(gè)序列掃描菜單，可通過,ScanI”右側(cè)的，中誨加更多的掃描序列eScan20,Scan3M2 .調(diào)用所需的單一采圖設(shè)置，預(yù)覽并優(yōu)化參數(shù)至滿意后，點(diǎn)擊飛can1”將參數(shù)定義至笫一掃描序列.3 .同法定義“Scan2”及更多的序列。4 .掃描順序“bclwecnlincs”適合大多數(shù)的應(yīng)用，特別是活細(xì)胞成像。5 .調(diào)整分辨率、線/面平均次數(shù)等掃描參數(shù)后，

15、點(diǎn)擊“Start”進(jìn)行序列圖像的采集。6 .可保存序列掃描的設(shè)置以使將來調(diào)用。五.z軸層切（xyz掃描）z軸層切用于觀察樣品中目標(biāo)的空間分布。Lxyz掃描模式為默認(rèn)采圖模式.2 .選擇ZGalvo”，HfSupcrZ進(jìn)行z軸調(diào)節(jié)；或，Wkc”,用顯微鏡物價(jià)進(jìn)行z軸調(diào)節(jié)。3 .設(shè)置采圖參數(shù)，方法同前。4 .點(diǎn)擊“Live”進(jìn)行圖像預(yù)覽用控制而板的二PositiorT旋鈕調(diào)節(jié)z軸至層切所需的起點(diǎn)，點(diǎn)由“Begin”上方的果色箭頭定義層切起點(diǎn)（帶頭變?yōu)樽厣硎疽欢x）：調(diào)節(jié)z軸至層切所需的終點(diǎn)，點(diǎn)擊“End”上方的黑色箭頭定義層切終點(diǎn)。5 .點(diǎn)擊“stop"終止圖像/CIKY/SzSjnH

16、6 .此時(shí)xyz層切菜單中顯示的2Scpsize”（相鄰兩個(gè)光切面的間距）和“Nr.ofsteps”（層切數(shù)H）為系統(tǒng)的優(yōu)化值（"systemoptimized"）。也可點(diǎn)擊“Nr.ofsteps”左他的按鈕，然后對相鄰光切面間距或?qū)忧袛?shù)目進(jìn)行自定義.7 .點(diǎn)JTStart”進(jìn)行xyz圖像的采虬8 .采圖完畢后，應(yīng)點(diǎn)擊"BegnT和“End”上方的棕色箭頭，使其變?yōu)楹谏?，重新處于未定義狀態(tài).六、時(shí)間序列掃描（xyt掃描）時(shí)間序列掃描多用于活細(xì)胞成像,記求動(dòng)態(tài)過程。1 .在“Acquire”菜單欄的“Acquisition”中選擇xyt掃描模式后，將出現(xiàn)xyt掃描菜

17、根2 .設(shè)置采圖參數(shù)，方法同前。3 .定義FimcInicrvar,即采集相鄰兩幀圖像所需的時(shí)間間隔,也可選擇最小fTMinimizcL4 .按采圖需要選擇“Acquireimlilslopped"、“Duration'或"Frames'；若選擇“Acquireuntilstopped”，則圖血將持續(xù)采柒,直至手動(dòng)終止若選擇,DuratiotT,可定義采圖所需的總時(shí)間.若選擇“Frames"，可定義所需的圖像幀數(shù).5 .點(diǎn)擊“Apply”確定.6 .點(diǎn)擊“Start”進(jìn)行時(shí)間序列圖像的采集。七、波長掃描（iy入掃描）波長掃描常用T自發(fā)熒光或新染料發(fā)

18、射光譜的檢測o1 .選擇激發(fā)光，方法同前。2 .在“Acquire”菜單欄的“AcquisitiorT中選擇xy1掃描模式后，將出現(xiàn)波長掃描菜單3 .定義“Begin”（需檢測的發(fā)射譜起點(diǎn)）和“End”（擊檢測的發(fā)射譜終點(diǎn)）.起點(diǎn)所在波長應(yīng)大于激發(fā)波長。4 .定義“BandWidth”（接收的帶寬），通常為lOnnv5 .定義“No.ofsicps”（采集的幀數(shù)）或“LambdaSlcpsizc”（波長步進(jìn)）（波長步進(jìn)不應(yīng)大于接收帶寬。6 .選擇所用PMT。7 .點(diǎn)擊“Start”進(jìn)行波長圖像的采集八、關(guān)機(jī)1 .保存已采集的圖像2 .關(guān)閉顯微鏡汞燈電源.3 .若使用過油鏡，需用無水乙醛與無水乙

19、醇混合液（體積比7：3）或無水乙醉清潔鏡頭。4 .關(guān)閉LASAF軟件.5 .將電腦集右側(cè)“LaserPower”按鈕幾側(cè)的激光開關(guān)例匙（LaserEmission）逆時(shí)計(jì)旋轉(zhuǎn)90度至Pn（T位置。6 .關(guān)閉“ScannerPower”按鈿°7 .4電腦卜.進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)的輸出注意：使用空白光盤刻錄，而不得使用任何其他形式的移動(dòng)存儲(chǔ)介質(zhì)。8 .關(guān)閉電腦后，關(guān)閉“PCMicroscope”按鈿.9 .風(fēng)扇停止后（關(guān)閉激光開關(guān)鑰匙約15分鐘后），關(guān)閉“LaserPower”按鈕。記泉美機(jī)時(shí)間、儀踞狀況等信息。問題補(bǔ)充:一.如何提高圖像質(zhì)在I）.通過減慢掃描速度.2）,使用,平均，方法3）.增

20、加發(fā)射池鏡的帶寬4）、加大針孔直徑；注意：光學(xué)切片的厚度也會(huì)相應(yīng)地增大。5）、增大激發(fā)能（激光功率）；注意：漂白效應(yīng)、飽和效應(yīng)和光毒效應(yīng).6）、使用較高數(shù)值孔徑（NA）的物位7）、增加出大小”=每條線的像素侑十每幀的線條數(shù)。8）、優(yōu)化打描出距（Z）。9）、煙加動(dòng)態(tài)范困。11）、使用多軌.。12）、提供預(yù)定義配置。13）、可同時(shí)定義和使用任何形狀的多人研究區(qū)。二,避免或排除光滑交叉干擾的方法：1）、同時(shí)使用幾種熒光探針時(shí)，盡量選擇相互之間無光譜交叉的熒光探計(jì)。2）、降低標(biāo)記熒光強(qiáng)度。（采用降低標(biāo)記物濃度、縮短標(biāo)記時(shí)間、訓(xùn)整探針介質(zhì)等方法）.3）、采用順序掃描方法克服光譜交叉.4）、改變檢測儀器條件.5X熒光光錯(cuò)饕別法.三、八種觀察方式：明場觀察、喑場觀察、浮歌相襯、彼