免疫印跡試驗報告——westerblot

1、Westernblot 實驗報告摘要：目的：學習并掌握 westernblot 分離蛋白及觀察方法方法：westernblot結(jié)果：見后文結(jié)論：westernblot 能很好地分離蛋白關鍵詞：westernblot、分離、小鼠組織、蛋白WesternblottestreportAbstract:objective:LearnandmasterthewesternblotproteinisolatedandobservationmethodMethods:westernblot:,sds-pageandelectrictransferResults:seebelowKeywords:Wester

2、nblot、separate、mousetissues、protein前百：免疫印跡又稱 Western 印跡（Westernblotting）,與 DNA 的 Southern 印跡技術相對應，兩種技術均把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相載體（通常為 NC 膜）,然后用探針檢測特異性組分。 不同的是， Westernblotting 所檢測的是抗原類蛋白質(zhì)成分，所用的探針是抗體，它與附著于固相載體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應。該技術結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測定特異敏感等諸多優(yōu)點，具有從復雜混合物中對特定抗原進行鑒別和定量檢測，以及從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體的優(yōu)越性。該

3、技術的靈敏度能達到標準的固相放射免疫分析的水平而無需對靶蛋白進行放射性標記。目前，Westernblotting 廣泛用于蛋白質(zhì)研究、基礎研究和臨床醫(yī)學的研究。免疫印跡可分成兩個步驟：蛋白質(zhì)由凝膠轉(zhuǎn)移至固相基質(zhì)；特異性抗體檢測。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移通常由電泳實現(xiàn)，現(xiàn)常用的方法有二：1 半干法：將凝膠和固相基質(zhì)似三明治樣夾在緩沖液濕潤的濾紙中間，通電 10-30 分鐘可完成轉(zhuǎn)移；2 濕法:將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，通電 45 分鐘或過夜課完成轉(zhuǎn)移。本試驗采用濕法轉(zhuǎn)移。免疫印跡用膜通常有硝酸纖維素膜和尼龍膜兩種。大多數(shù)應用前者。本實驗也用硝酸纖維素膜進行轉(zhuǎn)移。1 試劑與儀器1.1

4、 試劑（所有試劑均供兩組用）1.1.18%電泳分離膠的配制H2O6.9ml30%丙烯酰胺 4.0ml1.5mol/LTris3.8ml10%SDS0.15ml10%過硫酸胺溶液 0.15mlTEMED0.015ml1.1.25%濃縮膠配制H2O5.5ml30%丙烯酰胺 1.3ml1.0mol/LTris1.0ml10%SDS0.08ml10%過硫酸胺溶液 1.08mlTEMED0.015ml1.2 儀器夾心式電泳槽，電泳儀，硝酸纖維素膜，直徑 9cm 培養(yǎng)皿，剪刀，鑲子，刀片，微量移液槍，普通濾紙2 試驗步驟5.1 蛋白質(zhì)的提取取小鼠組織 0.2g,用生理鹽水洗去表面毛發(fā)等雜物，剪碎，加入生理

5、鹽水 2ml;移入勻漿器，勻碎用移液槍移取 1ml 勻漿液入 1 號 EP 管中；離心 12000 轉(zhuǎn)，10min取 1 號 EP 管中層清液入 2 號 EP 管SDS-PAGE 電泳分離2 片玻璃片以清水洗凈，再以衛(wèi)生紙擦干，欲做膠的那一面以酒精洗凈，再以拭鏡紙擦干凈，最彳爰符 2 片玻璃片貼好。2 片玻璃片放入造膠臺中，注意 2 片玻璃片的底部需相當平整，再符水加滿，觀察 5 分鐘后水外漏的比率，若外漏速率太快，則拆掉重新擺放。倒掉 2 片玻璃片間的水，用濾紙符水吸除，盡量完全吸干，避免膠體濃度不足使用塑膠滴管符配好的溶液加入裂膠臺中，余勺加到綠色橫捍下緣，盡量不要太多，否 JW 齒梳曾直

6、接刺到下層膠（上膠預留 2cm 空）,在上面鋪一層水，與空氣隔絕，加速凝固。倒掉 H2O,用濾紙符水吸干，但不要碰到膠，用塑膠滴管吸取上膠的溶液，滴入至玻璃片全漏的位置，符齒梳插入，含有 acrylamide 之溶液有毒，避免接觸到身體，此畤液體可能會噴出等待 20 分鐘，可以觀察燒杯留下一些剩余液體，可以判斷凝固程度，如果燒杯中的殘留液體凝固，則代表膠體已經(jīng)凝固，拆除齒梳。缸色在左遏，黑色在右遏，小格之 runningbuffer 需加到全漏;；大格的 runningbuffer之需要加到淹謾白金線即可。蓋上上羞，轉(zhuǎn)到電壓那部分，上膠跑 90V/70V；下膠跑 110V/100V。（看到 m

7、arker 顏色分 H 即轉(zhuǎn)至 110V）,跑 80min。轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到硝酸纖維素膜上（電轉(zhuǎn)移）切割與膠尺寸相符的硝酸纖維素膜，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡 5min 使沒有氣泡。剪 2 張濾紙與膠尺寸大小相符，將其與海綿一起浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中。打開轉(zhuǎn)移槽的膠板， 依次放入： a.一張浸濕的海綿； b.一張用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙；c.用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗過的膠，并小心的趕走濾紙和膠之間的氣泡；d.硝酸纖維素膜，正面對著膠，在膠和膜的右下角剪一小角，以標明方向；e.一張用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙；f.一張浸濕后的海綿。小心的合上膠板，并立即放入轉(zhuǎn)移電泳槽中。加轉(zhuǎn)移緩沖液至滿。插好電極，注意正負極方向，膠側(cè)為負，NC

8、 膜側(cè)為正。打開電泳儀開關調(diào)至穩(wěn)壓 60v,電泳 2h,轉(zhuǎn)移結(jié)束后打開膠板取出硝酸纖維素薄膜。染色、脫色轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出塑料支架，依次去掉各層用鉛筆或剪刀在NC膜的上緣作好標記， 將NC膜放入盛有麗春紅的培養(yǎng)皿中8分鐘，再經(jīng)自來水脫色，觀察轉(zhuǎn)移結(jié)果。將轉(zhuǎn)移后的凝膠放入氨基黑染液中染色1分鐘，再經(jīng)洗脫液脫色，觀察轉(zhuǎn)移結(jié)果。（注意電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖?要回收）3 實驗結(jié)果3.1 顯色后的凝膠及印跡膜圖1:顯色后的凝膠及印跡膜4 討論從實驗結(jié)果我們可以看到，凝膠上的有幾個樣品的蛋白分離程度還可以，但是中間大部分都模糊不清，甚至是沒有跑出多少蛋白。為什么一樣的實驗條件卻做出不一樣的結(jié)果呢？可能的原因有：沒有處理好樣品，導致提取的蛋白量不多，或者不純；加樣時意外打到電泳液中等本實驗所用的免疫印跡方法，其方法簡單，方便迅速，特異性強。ELISA 是由抗原（抗體）先結(jié)合在周相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當偶聯(lián)物與周相載體上的抗原（抗體）反應后，