HPLC檢測食品中的四種磺胺類獸藥

1、高效液相色譜法檢測四種磺胺類高效液相色譜法檢測四種磺胺類獸藥殘留獸藥殘留磺胺類藥物磺胺類藥物 主要用于抗菌消炎，如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧主要用于抗菌消炎，如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺瞇、菌得清、新諾明等。近年來，磺胺類啶、磺胺瞇、菌得清、新諾明等。近年來，磺胺類藥物在動物性食品中的殘留超標現(xiàn)象，在所有獸藥藥物在動物性食品中的殘留超標現(xiàn)象，在所有獸藥當中是最嚴重的。長期攝入含磺胺類藥物殘留的動當中是最嚴重的。長期攝入含磺胺類藥物殘留的動物性食品后，藥物可不斷在體內蓄積物性食品后，藥物可不斷在體內蓄積。磺胺類藥物的毒性作用磺胺類藥物的毒性作用p損害泌尿系統(tǒng)損害泌尿系統(tǒng) 磺胺類藥主要經腎臟排出，在尿

2、中濃度較高，其溶解度又較低，尤其當磺胺類藥主要經腎臟排出，在尿中濃度較高，其溶解度又較低，尤其當尿液偏酸性時，可在腎盂、輸尿管或膀胱內析出結晶，產生刺激和阻塞，尿液偏酸性時，可在腎盂、輸尿管或膀胱內析出結晶，產生刺激和阻塞，造成泌尿系統(tǒng)損傷，引起結晶尿、血尿、管型尿。造成泌尿系統(tǒng)損傷，引起結晶尿、血尿、管型尿。 p引起過敏反應引起過敏反應 p抑制造血系統(tǒng)抑制造血系統(tǒng) p導致細菌產生抗藥性導致細菌產生抗藥性磺胺類藥物結構磺胺類藥物結構 磺胺類藥物的基本結構為對氨苯磺酰胺，簡稱磺胺的衍生物，磺胺類藥物的基本結構為對氨苯磺酰胺，簡稱磺胺的衍生物， 具有芳具有芳氨基和磺酰胺基，多為兩性化合物氨基和磺酰

3、胺基，多為兩性化合物 。 常用的磺胺類藥物的化學結構式：常用的磺胺類藥物的化學結構式： H2NSOONHRsulfonamide backboneRRR14Hsulfanilamide (SAN)NSsulfathiazole (STZ)NOsulfisozole (SIZ)NOH3CCH3sulfisoxazole(SIX)sulfamethoxazole (SMX)NOCH3NOCH3CH3Sulfatroxazole (STX)NNsulfadiazine (SDZ)NNsulfamerazine (SMR)CH3NNCH3CH3sulfamethazine (SMZ)or sulfad

4、imidine (SDD)NNOCH3sulfamethoxypyridazine (SPMX)NNOCH3sulfameter (SME)NNOCH3sulfamonomethoxine (SMMX)NNH3COOCH3sulfadoxine (SD)Nsulfapyridine (SP)NNOCH3OCH3sulfadimethoxine (SDMX)NNOCH3OCH3sulfadimethoxine (SDMX)磺胺類藥物的分子結構磺胺類藥物的分子結構 p磺胺類藥物在獸醫(yī)臨床上的應用磺胺類藥物在獸醫(yī)臨床上的應用 磺胺藥對大多數(shù)革蘭氏陽性和陰性細菌都有抑制作用，在食源性動物磺胺藥對大多數(shù)

5、革蘭氏陽性和陰性細菌都有抑制作用，在食源性動物的飼養(yǎng)中，磺胺類藥物不僅作為獸藥被廣泛用于獸醫(yī)臨床對細菌感染的飼養(yǎng)中，磺胺類藥物不僅作為獸藥被廣泛用于獸醫(yī)臨床對細菌感染性疾病的防治，有時也被用作飼料添加劑。性疾病的防治，有時也被用作飼料添加劑。p磺胺藥的藥代動力學磺胺藥的藥代動力學 磺胺藥主要在肝臟中代謝，常見的方式是在對位氨基處發(fā)生乙?；前匪幹饕诟闻K中代謝，常見的方式是在對位氨基處發(fā)生乙?；浯问橇u基化作用。有的磺胺藥其乙酰代謝物的水溶性低，易在腎小其次是羥基化作用。有的磺胺藥其乙酰代謝物的水溶性低，易在腎小管內析出結晶，而有些代謝物雖水溶性較高，但在酸性尿中也容易結管內析出結晶，而有

6、些代謝物雖水溶性較高，但在酸性尿中也容易結晶析出，容易引起結晶尿和腎并發(fā)癥。晶析出，容易引起結晶尿和腎并發(fā)癥?；前奉愃幬飳κ称返奈廴净前奉愃幬飳κ称返奈廴緋使用過磺胺類藥物的動物，如果不遵守適當?shù)男菟幤冢浼∪饨M織、蛋使用過磺胺類藥物的動物，如果不遵守適當?shù)男菟幤冢浼∪饨M織、蛋和奶中就會被殘留的磺胺類藥物污染；短期大劑量或長期小劑量給藥，和奶中就會被殘留的磺胺類藥物污染；短期大劑量或長期小劑量給藥，很容易造成磺胺類藥物在動物各組織中蓄積；很容易造成磺胺類藥物在動物各組織中蓄積；p當飼料或飲水被磺胺類藥物污染后，也可導致動物性食品中磺胺類藥物當飼料或飲水被磺胺類藥物污染后，也可導致動物性食品中

7、磺胺類藥物殘留量嚴重超標；殘留量嚴重超標；p很多研究表明豬肉及其制品中磺胺藥物超標現(xiàn)象時有發(fā)生，特別是致癌很多研究表明豬肉及其制品中磺胺藥物超標現(xiàn)象時有發(fā)生，特別是致癌性的磺胺二甲基嘧啶殘留給人類的健康帶來了威脅。性的磺胺二甲基嘧啶殘留給人類的健康帶來了威脅。食品中磺胺類藥物的最高殘留限量食品中磺胺類藥物的最高殘留限量p英、美等國家對磺胺類藥物在肉類及乳品中的允許殘留量限制為英、美等國家對磺胺類藥物在肉類及乳品中的允許殘留量限制為100 gkg-1；p歐盟第歐盟第675/92675/92號令中規(guī)定了，在肉類及牛奶中磺胺的最大殘留總量不得號令中規(guī)定了，在肉類及牛奶中磺胺的最大殘留總量不得超過超過

8、100 gkg-1；p日本要求的最高殘留限量更嚴格，單個磺胺殘留限量為日本要求的最高殘留限量更嚴格，單個磺胺殘留限量為20 g20 gkgkg-1 -1 ，最大殘留總量不得超過最大殘留總量不得超過100 gkg-1；p我國對磺胺類藥物在肉類及乳品中的允許殘留量限制為我國對磺胺類藥物在肉類及乳品中的允許殘留量限制為100 gkg-1。提取和凈化方法提取和凈化方法 p磺胺類藥物不易溶于非極性溶劑，而在極性較大的溶磺胺類藥物不易溶于非極性溶劑，而在極性較大的溶劑中溶解性較好，一般常用乙睛、氯仿、二氯甲烷、劑中溶解性較好，一般常用乙睛、氯仿、二氯甲烷、丙酮、或乙酸乙酯提取。丙酮、或乙酸乙酯提取。p凈化

9、方法主要有柱色譜，凈化方法主要有柱色譜，TLCTLC，液液萃?。?，液液萃?。↙LELLE），固），固相萃?。ㄏ噍腿。⊿PESPE）和基質固相分散萃?。ǎ┖突|固相分散萃?。∕SPDMSPD）等。）等。 磺胺類藥物的磺胺類藥物的HPLC法色譜條件法色譜條件p常采用反相硅膠柱對待測物進行分離，主要有常采用反相硅膠柱對待測物進行分離，主要有C18C18，C8C8或者或者C4C4柱，柱，有時也采用離子對色譜柱。有時也采用離子對色譜柱。p流動相主要由乙睛流動相主要由乙睛- -水，甲醇水，甲醇- -水或者乙睛水或者乙睛- -甲醇甲醇- -水按不同比例組水按不同比例組成，也有文獻報道采用乙醇成，也有文獻報道

10、采用乙醇- -水系統(tǒng)。在以上流動相系統(tǒng)中加入適水系統(tǒng)。在以上流動相系統(tǒng)中加入適量乙酸或者十二烷基磺酸鈉（量乙酸或者十二烷基磺酸鈉（SDSSDS）常用于提高分離效率。）常用于提高分離效率。目前常用磺胺類獸藥的檢測方法目前常用磺胺類獸藥的檢測方法1.分光光度法2.氣相色譜法3.高效液相色譜法4.酶聯(lián)免疫吸附分析法 5.高效液相色譜與質譜聯(lián)用分析法實驗目的實驗目的了解檢測磺胺類獸藥殘留的方法，掌握高效液相了解檢測磺胺類獸藥殘留的方法，掌握高效液相色譜法檢測磺胺類獸藥殘留的方法；色譜法檢測磺胺類獸藥殘留的方法；了解高效液相色譜法測定獸藥多殘留的方法；了解高效液相色譜法測定獸藥多殘留的方法；了解建立高效

11、液相色譜法測定獸藥多殘留的方法了解建立高效液相色譜法測定獸藥多殘留的方法步驟及需要測定的參數(shù)。步驟及需要測定的參數(shù)。p磺胺類藥物在紫外區(qū)（波長一般在250-280 nm）有吸收，可以選擇高效液相色譜（配紫外檢測器）對上述化合物進行分離，定性定量測定。 實驗原理實驗原理p 儀器：儀器：n島津高效液相色譜分析儀島津高效液相色譜分析儀 配有配有UV100UV100紫外檢測器紫外檢測器n隔膜真空抽濾器（津騰）隔膜真空抽濾器（津騰） n超聲波清洗器超聲波清洗器 n電子天平電子天平 nSHB- SHB- 循環(huán)水式多用真空泵循環(huán)水式多用真空泵 nGDYQ-701S GDYQ-701S 樣品提取儀樣品提取儀

12、n101-3101-3型型 電熱鼓風干燥箱電熱鼓風干燥箱 nPHS-25 PHPHS-25 PH計計 儀器與試劑儀器與試劑磺胺噻唑 純度99.9磺胺嘧啶 純度99.9磺胺甲基嘧啶 純度99.9磺胺二甲嘧啶 純度99.9色譜純甲醇儀器與試劑儀器與試劑溶液配制溶液配制 p標準樣品溶液配制n準確稱取四種SAs藥物標準品10 mg，置于10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配置成1 mg/ml的標準儲備液。p 混合標準溶液n準確稱取四種SAs的標準品10mg，共同置于25 ml容量瓶中，用甲醇定容，配置成400 mg/L的標準儲備液。 p色譜柱色譜柱 ：Symmetry Cl8反相色譜柱(46250

13、mm i.d)p檢測波長檢測波長：270 nm；p流動相流動相：甲醇：甲醇：1%（）乙酸 = 25：75p進樣量：進樣量：20 ulp流動相流速流動相流速: : 1 ml/min色譜條件色譜條件標準曲線的繪制 p由四種樣品混合標準液400 ppm,進行等度稀釋成質量濃度為8 ppm、6 ppm、4 ppm、2 ppm、1 ppm、0.4 ppm的標準系列，各取20 ul由高效液相色譜儀進樣分析，據峰面積與相應質量濃度進行線性回歸，繪制標準曲線。定性實驗定性實驗 p將標準樣品的四種單品及混合樣品溶液分別進行稀釋至8 ppm，并經HPLC進樣分析，根據四種單品各自出峰時間及混合樣品中四種單樣的出峰

14、時間比較進行定性 Minutes6810121416182022242628303234Volts-0.050-0.0250.0000.0250.0500.0750.1000.1250.1500.1750.2000.225Volts-0.050-0.0250.0000.0250.0500.0750.1000.1250.1500.1750.2000.225(SDZ)(STZ) SMR SMO SMTSDMD SMP SCP SDXSIA 水樣經過水樣經過0.45um 膜過濾后直接進樣膜過濾后直接進樣濃度計算濃度計算樣品的測定樣品的測定mABYC其中：C樣品中磺胺類獸藥的含量，mg L-1； A

15、標準曲線的斜率Y 測定樣品的峰面積；B標準曲線的截距；m 稱取樣品的量，L。液相色譜柱的使用和維護注意事項 樣品的前處理樣品的前處理最好使用流動相溶解樣品。使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質。使用0.45m的過濾膜過濾除去微粒雜質。避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節(jié)流速時應該緩慢進行，在閥進樣時，閥的轉動不能過緩。柱的使用和維護注意事項應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應從有機溶劑直接改變?yōu)樗?，反之亦然一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖

16、時，才可以反沖除去柱頭的雜質，否則反沖會迅速降低柱效 柱的使用和維護注意事項選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞有時可以連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠飽和，避免分析柱中的硅膠基質被溶解避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱保護柱一般是填有固定相的短柱保護柱可以而且應該經常更換柱的使用和維護注意事項經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質，在進行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，常規(guī)分析需要50-75L。柱的使用和維護注意事項p正相硅膠柱以正已烷（或庚烷），二氯甲烷（或氯仿）和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。p反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順