第三章酶的分離純化-華工(1)

1、第二章第二章 酶的分離純化酶的分離純化酶分離純化的特點(diǎn)酶分離純化的特點(diǎn) 酶分離純化的目的是使酶制劑產(chǎn)品達(dá)到所需的純度。酶分離純化的目的是使酶制劑產(chǎn)品達(dá)到所需的純度。包括包括4個(gè)基本步驟：預(yù)處理、粗提、精制、成品加工個(gè)基本步驟：預(yù)處理、粗提、精制、成品加工。在分離純化中必須注意：在分離純化中必須注意：1、防止酶的變性失活；、防止酶的變性失活；2、在分離純化過(guò)程中的每一步都應(yīng)檢測(cè)酶的活性，、在分離純化過(guò)程中的每一步都應(yīng)檢測(cè)酶的活性，確定酶的純化程度和回收率。確定酶的純化程度和回收率。主要內(nèi)容主要內(nèi)容 第一節(jié)第一節(jié) 發(fā)酵液預(yù)處理發(fā)酵液預(yù)處理 第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 第三節(jié)第三節(jié) 酶的提取酶的

2、提取 第四節(jié)第四節(jié) 酶分離純化的方法酶分離純化的方法 (一一) 沉淀分離沉淀分離 (二二) 離心分離離心分離 (三三) 過(guò)濾與膜分離過(guò)濾與膜分離 (四四) 層析分離層析分離 (五五) 電泳分離電泳分離 (六六) 萃取分離萃取分離 第五節(jié)第五節(jié) 酶的結(jié)晶酶的結(jié)晶 第六節(jié)第六節(jié) 酶的濃縮干燥酶的濃縮干燥 第七節(jié)酶的制劑與保存第七節(jié)酶的制劑與保存第一節(jié)第一節(jié) 發(fā)酵液的預(yù)處理發(fā)酵液的預(yù)處理 預(yù)處理目的預(yù)處理目的 a 改變發(fā)酵液物理性質(zhì)改變發(fā)酵液物理性質(zhì) b 產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相中產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相中 c 除去發(fā)酵液中部分雜質(zhì)除去發(fā)酵液中部分雜質(zhì) 發(fā)酵液中的發(fā)酵液中的雜質(zhì)雜質(zhì)如高價(jià)無(wú)機(jī)離子如高價(jià)無(wú)機(jī)離子(Ca2+、M

3、g2+、Fe3+)和和蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)在離子交換的過(guò)程中對(duì)提煉影響甚大，在離子交換的過(guò)程中對(duì)提煉影響甚大，不利于樹(shù)脂對(duì)酶的吸附。如用溶媒萃取法提煉時(shí)，不利于樹(shù)脂對(duì)酶的吸附。如用溶媒萃取法提煉時(shí)，蛋白質(zhì)的存在會(huì)產(chǎn)生乳化，使溶媒和水相分層困難。蛋白質(zhì)的存在會(huì)產(chǎn)生乳化，使溶媒和水相分層困難。1、發(fā)酵液相對(duì)純化、發(fā)酵液相對(duì)純化（1）無(wú)機(jī)離子的去除）無(wú)機(jī)離子的去除 Ca2+ 草酸草酸 Mg2+ 三聚磷酸鈉三聚磷酸鈉 Fe3+ 黃血鹽黃血鹽 對(duì)高價(jià)離子的去除，可采用對(duì)高價(jià)離子的去除，可采用草酸或磷酸草酸或磷酸。加草酸則它與鈣離子生成的草酸鈣還能促使蛋加草酸則它與鈣離子生成的草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固以提高發(fā)酵濾

4、液的質(zhì)量。白質(zhì)凝固以提高發(fā)酵濾液的質(zhì)量。加磷酸加磷酸(或磷酸鹽或磷酸鹽)，則既能降低鈣離子濃度，也易于，則既能降低鈣離子濃度，也易于去除鎂離子。去除鎂離子。 Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+ 加黃血鹽及硫酸鋅，則前者有利于去除鐵離子，后加黃血鹽及硫酸鋅，則前者有利于去除鐵離子，后者有利于凝固蛋白質(zhì)。此外，這二者還有協(xié)同作用。者有利于凝固蛋白質(zhì)。此外，這二者還有協(xié)同作用。它們所產(chǎn)生的復(fù)鹽對(duì)蛋白質(zhì)有吸附作用。它們所產(chǎn)生的復(fù)鹽對(duì)蛋白質(zhì)有吸附作用。2K4Fe(CN)6+3ZnSO4K2Zn3Fe(CN)62+3K2SO4 （2）蛋白質(zhì)去除）蛋白質(zhì)去除加熱加熱調(diào)調(diào)pH (草酸，

5、無(wú)機(jī)酸或堿草酸，無(wú)機(jī)酸或堿)凝集凝集/絮凝絮凝/混凝混凝添加助濾劑添加助濾劑添加反應(yīng)劑添加反應(yīng)劑 凝聚：凝聚：膠體粒子膠體粒子(10-100nm)中性鹽促進(jìn)下脫穩(wěn)相中性鹽促進(jìn)下脫穩(wěn)相 互聚集成大粒子（互聚集成大粒子（1mm）機(jī)理：機(jī)理：a 中和粒子表面電荷中和粒子表面電荷 b 消除雙電層結(jié)構(gòu)消除雙電層結(jié)構(gòu) 絮凝：絮凝：大分子聚電解質(zhì)將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)狀，成大分子聚電解質(zhì)將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)狀，成形絮凝團(tuán)的過(guò)程形絮凝團(tuán)的過(guò)程機(jī)理：架橋作用機(jī)理：架橋作用（3）色素及其他物質(zhì)的去除）色素及其他物質(zhì)的去除2、發(fā)酵液的固液分離、發(fā)酵液的固液分離 （1）影響發(fā)酵液過(guò)濾的因素）影響發(fā)酵液過(guò)濾的因素 菌種：真菌

6、，放線菌，細(xì)菌菌種：真菌，放線菌，細(xì)菌 培養(yǎng)基：黃豆，花生，淀粉，后期加油，培養(yǎng)基未培養(yǎng)基：黃豆，花生，淀粉，后期加油，培養(yǎng)基未用完用完 發(fā)酵時(shí)間：菌絲自溶前放罐發(fā)酵時(shí)間：菌絲自溶前放罐（2）改善過(guò)濾方法）改善過(guò)濾方法 助濾劑助濾劑：質(zhì)地堅(jiān)硬不可壓縮性固體：質(zhì)地堅(jiān)硬不可壓縮性固體機(jī)理：機(jī)理：表面吸附膠體及不可壓縮型格子結(jié)構(gòu)表面吸附膠體及不可壓縮型格子結(jié)構(gòu)使用方法：使用方法：a 預(yù)先制成濾餅預(yù)先制成濾餅b 助濾劑混入懸浮液中一起過(guò)濾助濾劑混入懸浮液中一起過(guò)濾 常用助濾劑常用助濾劑：硅藻土，珍珠巖，活性炭：硅藻土，珍珠巖，活性炭應(yīng)用優(yōu)化因素應(yīng)用優(yōu)化因素 a 單位質(zhì)量助濾劑的濾液最大產(chǎn)量單位質(zhì)量助濾

7、劑的濾液最大產(chǎn)量 b 使用周期使用周期 c 流速流速 第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞破壁細(xì)胞破壁 生物細(xì)胞產(chǎn)酶有兩類生物細(xì)胞產(chǎn)酶有兩類 胞內(nèi)酶：大多為水解酶類胞內(nèi)酶：大多為水解酶類 胞外酶：數(shù)量較多胞外酶：數(shù)量較多細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破首先需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。碎處理。1）機(jī)械破碎）機(jī)械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化學(xué)破碎）化學(xué)破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超聲波超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞破碎珠細(xì)胞破碎珠高壓細(xì)胞破碎機(jī)高壓細(xì)胞破碎機(jī)DY89-I型型 電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)機(jī)械破碎機(jī)械破

8、碎搗碎法搗碎法研磨法研磨法勻漿法勻漿法 物理破碎物理破碎溫度差破碎法溫度差破碎法壓力差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法超聲波破碎法 化學(xué)破碎化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮甲苯、丙酮丁醇、氯仿丁醇、氯仿表面活性劑：表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎酶促破碎自溶法自溶法外加酶制劑法外加酶制劑法通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。力，使組織、細(xì)胞破碎。通過(guò)各種物理因素的作用，通過(guò)各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。壞，而使細(xì)胞破碎。通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎膜的作用

9、，而使細(xì)胞破碎通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理細(xì)胞破碎方法及其原理本章本章目錄目錄細(xì)胞破碎的方法細(xì)胞破碎的方法A 機(jī)械破碎法機(jī)械破碎法 1、機(jī)械搗碎法：高速組織搗碎機(jī)、機(jī)械搗碎法：高速組織搗碎機(jī) 2、研磨破碎法：高速球磨機(jī)，研缽研磨、研磨破碎法：高速球磨機(jī)，研缽研磨 3、勻漿破碎法：玻璃、勻漿破碎法：玻璃、Teflon研缽勻漿器研缽勻漿器 B 物理破碎法物理破碎法 1、溫度差、溫度差 2、壓力差：高壓沖擊法、壓力差：高壓沖擊法 降壓法降壓法 滲透壓

10、變化法滲透壓變化法 3、超聲波、超聲波 4、其它：凍融法、干燥法、其它：凍融法、干燥法壓擠高壓勻漿凍融法凍融法 生物組織經(jīng)冰凍后，細(xì)胞胞液結(jié)成冰晶，生物組織經(jīng)冰凍后，細(xì)胞胞液結(jié)成冰晶，使細(xì)胞壁漲破。使細(xì)胞壁漲破。 需在凍融液中加入蛋白酶抑制劑。需在凍融液中加入蛋白酶抑制劑。干燥法干燥法 經(jīng)干燥后的菌體，其細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生經(jīng)干燥后的菌體，其細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生變化，同時(shí)部分菌體會(huì)產(chǎn)生自溶，然后用變化，同時(shí)部分菌體會(huì)產(chǎn)生自溶，然后用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理時(shí)，胞內(nèi)丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就會(huì)被抽提出來(lái)。物質(zhì)就會(huì)被抽提出來(lái)。 干燥法屬于較激烈的一種破碎方法，容易干燥法屬于較激烈的

11、一種破碎方法，容易引起蛋白質(zhì)或其它組分變性。引起蛋白質(zhì)或其它組分變性。 C 化學(xué)破碎法化學(xué)破碎法 1、添加有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿、添加有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿 2、添加表面活性劑：特里頓、吐溫、添加表面活性劑：特里頓、吐溫D 酶促破碎法酶促破碎法 1、自溶法、自溶法 2、外加酶制劑法、外加酶制劑法 在眾多的細(xì)胞破碎方法中高壓均漿和珠磨兩種機(jī)械在眾多的細(xì)胞破碎方法中高壓均漿和珠磨兩種機(jī)械破碎方法，處理量大，速度非常快，目前在工業(yè)生破碎方法，處理量大，速度非?？?，目前在工業(yè)生長(zhǎng)上應(yīng)用最廣泛。長(zhǎng)上應(yīng)用最廣泛。 但在機(jī)械法破碎過(guò)程中，容易產(chǎn)生大量的熱量，使但在機(jī)械法破碎過(guò)程中，容易產(chǎn)

12、生大量的熱量，使料液溫度升高，而易造成生化物質(zhì)的破壞。料液溫度升高，而易造成生化物質(zhì)的破壞。 非機(jī)械法一般僅適用于小規(guī)模應(yīng)用。非機(jī)械法一般僅適用于小規(guī)模應(yīng)用。 超聲波處理容易使料液溫度升高。因此，超聲波振超聲波處理容易使料液溫度升高。因此，超聲波振蕩法主要適用于實(shí)驗(yàn)室或小規(guī)模的細(xì)胞破碎。蕩法主要適用于實(shí)驗(yàn)室或小規(guī)模的細(xì)胞破碎。 滲透壓沖擊和凍結(jié)滲透壓沖擊和凍結(jié)-融解法都屬于較溫和的方法，但融解法都屬于較溫和的方法，但破碎作用較弱它們常與酶解法結(jié)合起來(lái)使用，提高破碎作用較弱它們常與酶解法結(jié)合起來(lái)使用，提高破碎效果。破碎效果。 干燥法屬于較激烈的一種破碎方法，容易引起蛋白干燥法屬于較激烈的一種破碎

13、方法，容易引起蛋白質(zhì)或其它組分變性。質(zhì)或其它組分變性。 破碎率的評(píng)價(jià)破碎率的評(píng)價(jià) 直接計(jì)數(shù)直接計(jì)數(shù) （1）計(jì)數(shù)器）計(jì)數(shù)器 （2）平板計(jì)數(shù)）平板計(jì)數(shù) （3）顯微鏡）顯微鏡 間接計(jì)數(shù)間接計(jì)數(shù) （1） 活性測(cè)定活性測(cè)定 （2） 電導(dǎo)率測(cè)定電導(dǎo)率測(cè)定 破碎率定義為被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞數(shù)量破碎率定義為被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞數(shù)量的百分比數(shù)，即：的百分比數(shù)，即： Y(%)=(N0-N)/N0100 N0原始細(xì)胞數(shù)量原始細(xì)胞數(shù)量N經(jīng)經(jīng)t時(shí)間操作后保留下來(lái)的未損害完整細(xì)胞數(shù)時(shí)間操作后保留下來(lái)的未損害完整細(xì)胞數(shù)量量 目前目前N0和和N主要通過(guò)下面的方法獲得主要通過(guò)下面的方法獲得 ： 直接計(jì)數(shù)直接計(jì)數(shù)法在

14、血球計(jì)數(shù)板用顯微鏡觀察，直接對(duì)適當(dāng)稀釋法在血球計(jì)數(shù)板用顯微鏡觀察，直接對(duì)適當(dāng)稀釋后的樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)。后的樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)。 間接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法是在細(xì)胞破碎后，測(cè)定懸間接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法是在細(xì)胞破碎后，測(cè)定懸浮液中細(xì)胞釋放出來(lái)的化合物的量。浮液中細(xì)胞釋放出來(lái)的化合物的量。 酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砻傅奶崛∈侵冈谝欢ǖ臈l件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇┗蛉芤褐械倪^(guò)程。也稱為含酶原料，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過(guò)程。也稱為酶的抽提。酶的抽提。 酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜苊傅慕Y(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇﹦Ｒ话?/p>

15、說(shuō)來(lái)，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)。一般說(shuō)來(lái)，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。 酶都能溶解于水，通?？擅付寄苋芙庥谒?，通?？捎盟蛳∷帷⑾A、稀鹽溶液等用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等進(jìn)行提取進(jìn)行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用則可用有機(jī)溶劑提取有機(jī)溶劑提取。 第三節(jié)酶溶液的提取第三節(jié)酶溶液的提取1、提取的主要方法：、提取的主要方法：提取方法提取方法使用的溶劑或溶液使用的溶

16、劑或溶液提取對(duì)象提取對(duì)象鹽溶液提取鹽溶液提取0.020.020.5mol/L0.5mol/L的鹽溶的鹽溶液液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶較大的酶酸溶液提取酸溶液提取PH2PH26 6的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取堿溶液提取PH8PH81212的水溶液的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有

17、較多非極性基團(tuán)的酶有較多非極性基團(tuán)的酶大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象鹽溶現(xiàn)象。 提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。 為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過(guò)程中還要注意控制好溫度、在提取過(guò)程中還要注意控制

18、好溫度、pH值值等提取條件。等提取條件。2 2、酶提取過(guò)程的注意事項(xiàng)、酶提取過(guò)程的注意事項(xiàng) (1)鹽的選擇：鹽的選擇：大多數(shù)酶在低濃度的鹽溶液中有較、大多數(shù)酶在低濃度的鹽溶液中有較、大的溶解度，一般選擇等滲鹽溶液，如大的溶解度，一般選擇等滲鹽溶液，如0.02-0.05 mol/L的磷酸緩沖液或的磷酸緩沖液或0.15 mol/L的的NaCl等。等。(2) 溫度的選擇溫度的選擇：一般控制在：一般控制在0-10 0C，如果酶比較穩(wěn)如果酶比較穩(wěn)定可以例外。定可以例外。(3) pH的選擇的選擇 ：首先考慮酶的穩(wěn)定性；其次應(yīng)遠(yuǎn)離首先考慮酶的穩(wěn)定性；其次應(yīng)遠(yuǎn)離等電點(diǎn)；一般選擇等電點(diǎn)；一般選擇pH4-6為宜。

19、為宜。(4) 抽提液用量抽提液用量：常采用原料體積的：常采用原料體積的1-5倍。倍。第四節(jié)第四節(jié) 酶分離純化的基本過(guò)程酶分離純化的基本過(guò)程酶分離純化方法的選擇酶分離純化方法的選擇 目前酶的分離純化方法都是根據(jù)酶與雜蛋白的性質(zhì)差異目前酶的分離純化方法都是根據(jù)酶與雜蛋白的性質(zhì)差異而建立的，在選擇分離純化方法時(shí)，要考慮以下幾個(gè)方面：而建立的，在選擇分離純化方法時(shí)，要考慮以下幾個(gè)方面：1、首先對(duì)待純化的酶的理化性質(zhì)有比較全面的了解；、首先對(duì)待純化的酶的理化性質(zhì)有比較全面的了解；2、以酶活力和比活力為標(biāo)準(zhǔn)，判斷所選擇的方法是、以酶活力和比活力為標(biāo)準(zhǔn)，判斷所選擇的方法是 否得當(dāng)；否得當(dāng)；3、嚴(yán)格控制操作條

20、件，防止酶的變性失活。、嚴(yán)格控制操作條件，防止酶的變性失活。層析法層析法 電泳法電泳法 超離心法超離心法 透析和超濾透析和超濾鹽析（鹽析（硫酸銨鹽析硫酸銨鹽析）等點(diǎn)電沉淀等點(diǎn)電沉淀有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑沉淀離心離心前處理前處理 粗分級(jí)粗分級(jí) 細(xì)分級(jí)細(xì)分級(jí) 材料選擇與處理材料選擇與處理細(xì)胞破碎（機(jī)械破碎、細(xì)胞破碎（機(jī)械破碎、溶漲和自溶、酶解、化溶漲和自溶、酶解、化學(xué)處理）學(xué)處理）有效成分的抽提有效成分的抽提生物組織生物組織 提取液提取液 粗產(chǎn)品粗產(chǎn)品結(jié)晶結(jié)晶分子大小分子大小溶解度溶解度電荷性質(zhì)電荷性質(zhì)吸附性質(zhì)吸附性質(zhì)生物親和力生物親和力依據(jù)原理依據(jù)原理酶分離純化方法：酶分離純化方法： 根據(jù)根據(jù)分子

21、大小分子大小建立的分離純化方法建立的分離純化方法 根據(jù)根據(jù)溶解度溶解度建立的分離純化方法建立的分離純化方法 根據(jù)根據(jù)電荷性質(zhì)電荷性質(zhì)建立的分離純化方法建立的分離純化方法 根據(jù)根據(jù)親和作用親和作用建立的分離純化方法建立的分離純化方法 根據(jù)根據(jù)穩(wěn)定性差異穩(wěn)定性差異建立的分離純化方法建立的分離純化方法酶分離純化過(guò)程中一些數(shù)據(jù)的處理酶分離純化過(guò)程中一些數(shù)據(jù)的處理 在每一步都要測(cè)定在每一步都要測(cè)定3個(gè)數(shù)據(jù)：酶活力；個(gè)數(shù)據(jù)：酶活力；比活力；體積。比活力；體積。 性質(zhì)性質(zhì) 方法方法v分子大小分子大小 離心分離、凝膠過(guò)濾、透析、超濾離心分離、凝膠過(guò)濾、透析、超濾v溶解度溶解度 改變離子強(qiáng)度（鹽析）；改變離子強(qiáng)

22、度（鹽析）； 改變改變pH（等電點(diǎn)沉淀）或溫度；（等電點(diǎn)沉淀）或溫度； 改變介電常數(shù)（有機(jī)溶劑沉淀）改變介電常數(shù)（有機(jī)溶劑沉淀） 萃取分離萃取分離v電荷電荷 電泳（紙電泳、薄層電泳、薄膜電泳、電泳（紙電泳、薄層電泳、薄膜電泳、 凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳）凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳） 吸附法（物理吸附法、離子交換層析、吸附法（物理吸附法、離子交換層析、 羥基磷灰石層析）羥基磷灰石層析）v對(duì)配體分子對(duì)配體分子 親和層析親和層析 親和力親和力v穩(wěn)定性差異穩(wěn)定性差異 熱變性、酸堿變性、表面變性熱變性、酸堿變性、表面變性酶分離純化方法的選擇根據(jù)穩(wěn)定性的差異建立的分離純化方法根據(jù)穩(wěn)定性的差異建立的分

23、離純化方法1、熱變性法：熱變性法：根據(jù)目的酶與雜蛋白熱穩(wěn)定性差異根據(jù)目的酶與雜蛋白熱穩(wěn)定性差異 ，可以在較高溫度下，使雜蛋白變性沉淀，而酶則，可以在較高溫度下，使雜蛋白變性沉淀，而酶則保持可溶狀態(tài)。保持可溶狀態(tài)。2、酸堿變性法：酸堿變性法：與熱變性原理類似，目的酶與雜與熱變性原理類似，目的酶與雜蛋白的酸堿穩(wěn)定性不同，可以調(diào)整不同的蛋白的酸堿穩(wěn)定性不同，可以調(diào)整不同的pH使雜蛋使雜蛋白變性沉淀。白變性沉淀。3、表面變性法：表面變性法：可將酶溶液與惰性液體混合，振可將酶溶液與惰性液體混合，振蕩造成表面變性；如在酶液中加入氯仿，振蕩后通蕩造成表面變性；如在酶液中加入氯仿，振蕩后通?？煞譃槌？煞譃?層

24、：上面為未變性的酶，中層為乳濁狀層：上面為未變性的酶，中層為乳濁狀的變性蛋白，下層為氯仿。的變性蛋白，下層為氯仿。(一一) 沉淀分離沉淀分離 沉淀分離是通過(guò)改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的沉淀分離是通過(guò)改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降溶解度降低低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。沉淀分離方法沉淀分離方法分離原理分離原理 鹽析沉淀法鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過(guò)在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出過(guò)在酶液中添加一定濃度

25、的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pHpH值，使酶或雜值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過(guò)添加一定利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過(guò)添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜

26、質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離離復(fù)合沉淀法復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來(lái)，從在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來(lái)，從而使酶與雜質(zhì)分離而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉法選擇性變性沉法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離1、鹽析鹽析(Salting Out)沉淀法（改變離子強(qiáng)度）沉淀法（改變離子強(qiáng)度）在鹽濃度達(dá)到某一界限在鹽濃度達(dá)到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為度升高而降低，這稱為鹽析現(xiàn)象鹽析現(xiàn)

27、象。 最常用的是硫酸銨。鹽濃度以飽和度表示，飽和最常用的是硫酸銨。鹽濃度以飽和度表示，飽和鹽溶液的飽和度為鹽溶液的飽和度為100%。調(diào)整鹽濃度有兩種方法：。調(diào)整鹽濃度有兩種方法：加入飽和硫酸銨溶液（蛋白質(zhì)溶液體積不大時(shí)）和直加入飽和硫酸銨溶液（蛋白質(zhì)溶液體積不大時(shí)）和直接加入固體硫酸銨（蛋白質(zhì)溶液體積較大時(shí)）。接加入固體硫酸銨（蛋白質(zhì)溶液體積較大時(shí)）。（1 1） KsKs鹽析鹽析：固定：固定pH, pH, 溫度，溫度， 改變鹽濃度改變鹽濃度（2 2） 鹽析：鹽析：固定離子強(qiáng)度，固定離子強(qiáng)度， 改變改變pH pH 及溫度。及溫度?；驹砘驹?有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)(

28、(酶酶),),核酸核酸, ,多糖和多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用, ,是較早使用是較早使用的沉淀方法之一的沉淀方法之一. .其原理主要是其原理主要是: :降低水溶液的介電常數(shù)降低水溶液的介電常數(shù), , 導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀低而沉淀. . （ F=QF=Q1 1Q Q2 2/r/r2 2 ）由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶, ,它們?cè)谌芙庥谒鼈冊(cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水水的同時(shí)從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子分子, ,破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜, ,因而發(fā)生沉淀作因而發(fā)

29、生沉淀作用用. .2、有機(jī)溶劑沉淀法（改變介電常數(shù)）、有機(jī)溶劑沉淀法（改變介電常數(shù)）常用：乙醇常用：乙醇, ,甲醇和丙酮甲醇和丙酮. .分辨能力比鹽析法高分辨能力比鹽析法高, ,即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀. .沉淀不用脫鹽沉淀不用脫鹽, ,過(guò)濾比較容易過(guò)濾比較容易( (如有必要如有必要, ,可用透可用透析袋脫有機(jī)溶劑析袋脫有機(jī)溶劑).).因而在生化制備中有廣泛的應(yīng)因而在生化制備中有廣泛的應(yīng)用用. .有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是: :有機(jī)溶劑沉淀法的缺點(diǎn)：有機(jī)溶劑沉淀法的缺點(diǎn)：對(duì)某些具有

30、生物活性的大分子容易引起變性失活對(duì)某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活, ,操操作需在低溫下進(jìn)行作需在低溫下進(jìn)行. .1) 1) 溫度溫度: :酶在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度特別敏感酶在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度特別敏感, ,溫度稍溫度稍高就會(huì)引起變性高就會(huì)引起變性, ,且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng)反應(yīng), ,因此有機(jī)溶劑必須預(yù)冷因此有機(jī)溶劑必須預(yù)冷, ,操作要在冰鹽浴中進(jìn)操作要在冰鹽浴中進(jìn)行行. .一般都要在低溫下進(jìn)行（一般都要在低溫下進(jìn)行（0011）2) 2) 樣品濃度樣品濃度: :低濃度樣品回收率低低濃度樣品回收率低, ,要使用比例更要使用比例更大的有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀大的有機(jī)

31、溶劑進(jìn)行沉淀. .高濃度樣品高濃度樣品, ,可以節(jié)省有機(jī)可以節(jié)省有機(jī)溶劑溶劑, ,減少變性的危險(xiǎn)減少變性的危險(xiǎn), ,但雜蛋白的共沉淀作用大但雜蛋白的共沉淀作用大. .選擇適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度才能達(dá)到較好的分離效果。選擇適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度才能達(dá)到較好的分離效果。通常使用通常使用5 5mg/mLmg/mL20mg/mL20mg/mL的蛋白質(zhì)初濃度為宜的蛋白質(zhì)初濃度為宜. . 有機(jī)溶劑沉淀的影響因素有機(jī)溶劑沉淀的影響因素3、等電點(diǎn)沉淀法（改變、等電點(diǎn)沉淀法（改變pH值）值） 利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低以利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性及不同的兩性電解質(zhì)有

32、不同的等電點(diǎn)這一特性, ,通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而實(shí)現(xiàn)酶與雜質(zhì)分離的方法而實(shí)現(xiàn)酶與雜質(zhì)分離的方法. . 可以利用此法進(jìn)行初步的沉淀分離可以利用此法進(jìn)行初步的沉淀分離. . 由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近, ,而且而且?guī)в兴さ拿傅壬锎蠓肿尤杂幸欢ǖ娜芙舛葞в兴さ拿傅壬锎蠓肿尤杂幸欢ǖ娜芙舛? ,不能完全沉淀析出不能完全沉淀析出, ,因此因此, ,單獨(dú)使用此法分辨率單獨(dú)使用此法分辨率較低較低, ,因而此法常與鹽析法因而此法常與鹽析法, ,有機(jī)溶劑沉淀法或有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用其他沉淀劑一

33、起配合使用, ,以提高沉淀能力和以提高沉淀能力和分離效果分離效果. . 此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白白, ,而不用于沉淀目的物而不用于沉淀目的物. .4、復(fù)合沉淀法：復(fù)合沉淀法：有些多聚電解質(zhì)可以在極低濃度有些多聚電解質(zhì)可以在極低濃度下選擇性地與某些酶結(jié)合而形成沉淀。如聚丙烯下選擇性地與某些酶結(jié)合而形成沉淀。如聚丙烯酸（酸（PAA）可以與某些蛋白酶，溶菌酶和磷酸酯可以與某些蛋白酶，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分離過(guò)程如下：酶等形成沉淀。分離過(guò)程如下： PAA+酶酶 PAA-酶酶 PAA-酶酶+Ca 2+ PAA- Ca 2+ + 酶酶 PAA- C

34、a 2+ + SO4 2- CaSO4 + PAA5 選擇性沉淀法選擇性沉淀法 1 1）常速離心機(jī)）常速離心機(jī)q又稱低速離心機(jī)又稱低速離心機(jī)q最大轉(zhuǎn)速：最大轉(zhuǎn)速：8000r/min 主要用途：分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基主要用途：分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锛按纸Y(jié)晶等較大的顆粒。殘?jiān)裙绦挝锛按纸Y(jié)晶等較大的顆粒。 （二）離心分離（二）離心分離（1 1）離心機(jī)的選擇）離心機(jī)的選擇2 2）高速離心機(jī)）高速離心機(jī)轉(zhuǎn)速：轉(zhuǎn)速：11042.5104 r/min主要用途：分離各種沉淀物、細(xì)胞碎主要用途：分離各種沉淀物、細(xì)胞碎片、較大的細(xì)胞器等片、較大的細(xì)胞器等高速冷凍離心機(jī)高速冷凍離心機(jī)3 3）超

35、速離心機(jī)）超速離心機(jī)轉(zhuǎn)速：轉(zhuǎn)速：2.510412104 r/min主要用途：分離主要用途：分離DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化。以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化。超速離心機(jī)的精密相當(dāng)高。為了防止樣品液油出，一超速離心機(jī)的精密相當(dāng)高。為了防止樣品液油出，一般附有離心帽；為了防止溫度升高，均有冷凍裝置和般附有離心帽；為了防止溫度升高，均有冷凍裝置和溫度控制系統(tǒng)；為了減少空氣阻力和摩擦，設(shè)置有真溫度控制系統(tǒng)；為了減少空氣阻力和摩擦，設(shè)置有真空系統(tǒng)。此外還有一系列安全保護(hù)系統(tǒng)、制動(dòng)系統(tǒng)及空系統(tǒng)。此外還有一系列安全保護(hù)系統(tǒng)、制動(dòng)系統(tǒng)及指示儀表等。指示儀表等。原

36、理原理：采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使不同沉降速：采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法，稱為差速離心法。度的顆粒分批分離的方法，稱為差速離心法。當(dāng)以一定離心力在一定的離心時(shí)間內(nèi)進(jìn)行離心時(shí)，在當(dāng)以一定離心力在一定的離心時(shí)間內(nèi)進(jìn)行離心時(shí)，在離心管底部就會(huì)得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上離心管底部就會(huì)得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在大離心力的條件下進(jìn)行離心，又得到第二部分較清液在大離心力的條件下進(jìn)行離心，又得到第二部分較大、較重顆粒的大、較重顆粒的“沉淀沉淀”，如此，多次離心處理，即能，如此，多次離心處理，即能把液體中的不同沉降速度的顆粒分批分離出來(lái)。把液體中

37、的不同沉降速度的顆粒分批分離出來(lái)。常用于分離大小和密度相差較大的顆粒常用于分離大小和密度相差較大的顆粒。1 1）差速離心法）差速離心法（2 2）離心方法的選用）離心方法的選用2 2）密度梯度離心）密度梯度離心原理：樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，原理：樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)分離的一種使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)分離的一種區(qū)帶分離方法。區(qū)帶分離方法。 梯度介質(zhì)選擇標(biāo)準(zhǔn)：梯度介質(zhì)選擇標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)具有足夠大的溶解度，以形成所需的密度梯度范圍；應(yīng)具有足夠大的溶解度，以形成所需的密度梯度范圍；不與樣品不與樣品 中的組分發(fā)生反應(yīng)；中的組分發(fā)生反應(yīng)；不會(huì)引起樣品中組分的凝集、變性或失活

38、。不會(huì)引起樣品中組分的凝集、變性或失活。q常用介質(zhì)：蔗糖、甘油常用介質(zhì)：蔗糖、甘油q蔗糖：濃度蔗糖：濃度5%5%-60%-60%，密度，密度1.021.02-1.30g/cm-1.30g/cm2 23 3）等密度梯度離心）等密度梯度離心 當(dāng)預(yù)分離的不同顆粒的密度范圍處于離心當(dāng)預(yù)分離的不同顆粒的密度范圍處于離心介質(zhì)的密度范圍內(nèi)時(shí)，每種蛋白質(zhì)顆粒沉介質(zhì)的密度范圍內(nèi)時(shí)，每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各自在離心管中被分離即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨(dú)立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管成獨(dú)立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底

39、刺一個(gè)小孔逐滴放出，分步收集。底刺一個(gè)小孔逐滴放出，分步收集。超速離心機(jī)按照其用途可以分為超速離心機(jī)按照其用途可以分為制備制備用超速離心機(jī)用超速離心機(jī)、分析用超速離心機(jī)分析用超速離心機(jī)和和分析分析- -制備兩用超速離心機(jī)制備兩用超速離心機(jī)3 3種種 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子在分子在離心離心時(shí)，時(shí)，其其 分子量、分子密度分子量、分子密度、組成組成、形形狀狀 等，均等，均會(huì)會(huì)影響影響其沉降速率，其沉降速率，沉降沉降係係系數(shù)系數(shù) 即用來(lái)描述此沉即用來(lái)描述此沉降降性質(zhì)性質(zhì)； 其其單位為單位為 S (Svedberg unit)。每一每一種種的沉降的沉降系數(shù)與系數(shù)與其其分子密度或分子量成正分子密度或分子量成正比

40、。比。 不同沉降不同沉降系數(shù)系數(shù)的的蛋蛋白質(zhì)白質(zhì)，可利用超高速，可利用超高速離離心心法，在密度梯度中作法，在密度梯度中作分離。分離。（3）離心條件的選擇）離心條件的選擇1）離心力）離心力2）離心時(shí)間）離心時(shí)間3）溫度和）溫度和pH（三）過(guò)濾與膜分離（三）過(guò)濾與膜分離過(guò)濾是借助于過(guò)濾是借助于過(guò)濾介質(zhì)過(guò)濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。過(guò)濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金過(guò)濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。過(guò)濾過(guò)濾非膜過(guò)

41、濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過(guò)濾介質(zhì)非膜過(guò)濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過(guò)濾介質(zhì) 膜過(guò)濾：采用各種高分子膜為過(guò)濾介質(zhì)膜過(guò)濾：采用各種高分子膜為過(guò)濾介質(zhì) 過(guò)濾的分類及其特性過(guò)濾的分類及其特性( (根據(jù)過(guò)濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同根據(jù)過(guò)濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同 ) ) 類別類別截留顆粒大小截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)截留的主要物質(zhì)過(guò)濾介質(zhì)過(guò)濾介質(zhì)粗濾粗濾 2m 2m酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等屬等微濾微濾0.20.22m2m細(xì)菌、灰塵等細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷微濾膜、微

42、孔陶瓷超濾超濾20200.2m0.2m病毒、生物大分子等病毒、生物大分子等超濾膜超濾膜反滲透反滲透 2020 (40,000) 壓力差，壓力差，100kPa 篩分篩分 超濾超濾UF 120 (10,000-40,000) 壓力差，壓力差，100kPa 篩分篩分 納濾納濾NF 1 (1001000) 壓力差，壓力差，100) 壓力差，壓力差，1000kPa 優(yōu)先吸附、溶解優(yōu)先吸附、溶解擴(kuò)散擴(kuò)散 四種常用膜分離技術(shù)的基本特征四種常用膜分離技術(shù)的基本特征 加壓膜分離：微濾加壓膜分離：微濾 超濾超濾 反滲透反滲透 電場(chǎng)膜分離：電滲析電場(chǎng)膜分離：電滲析 離子交換膜電滲析離子交換膜電滲析 擴(kuò)散膜分離：透析

43、擴(kuò)散膜分離：透析1）透）透 析析(Dialysis)法：法：4過(guò)程過(guò)程：4透析袋類型透析袋類型： 再生纖維素膜透析袋和纖維素酯透析袋再生纖維素膜透析袋和纖維素酯透析袋。4透析袋的預(yù)處理透析袋的預(yù)處理： 1 1、用前只要浸泡濕潤(rùn)和蒸餾水洗滌即可使用、用前只要浸泡濕潤(rùn)和蒸餾水洗滌即可使用 2 2、必要時(shí)可用、必要時(shí)可用1010mmolmmol/L /L 碳酸氫鈉，碳酸氫鈉，50%50%乙醇和乙醇和1010mmolmmol/L/L EDTA EDTA處理后，再用蒸餾水洗滌。處理后，再用蒸餾水洗滌。2）超過(guò)濾）超過(guò)濾(Ultrafiltration)法：法： 利用壓力或離心力強(qiáng)行使溶質(zhì)按大小形狀利用壓

44、力或離心力強(qiáng)行使溶質(zhì)按大小形狀的差異分開(kāi)，將所需的酶分子被濾膜截留，的差異分開(kāi)，將所需的酶分子被濾膜截留，而其它較小的分子隨溶劑被壓到膜的另一側(cè)。而其它較小的分子隨溶劑被壓到膜的另一側(cè)。超濾膜：超濾膜：制備超濾膜的材料多是高分子聚合物制備超濾膜的材料多是高分子聚合物 （如聚砜類，聚四氟乙烯等）。（如聚砜類，聚四氟乙烯等）。透析袋酶溶液蒸餾水加壓酶溶液超濾膜支持柵板超濾液圖3-1 透析裝置圖3-2 超濾裝置（四）層析分離（四）層析分離 利用混合液中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的利用混合液中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的不同，使各組分以不同比例分部布在兩相不同，使各組分以不同比例分部布在兩相中中固定相和流動(dòng)相。當(dāng)

45、流動(dòng)相流經(jīng)固定固定相和流動(dòng)相。當(dāng)流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，各組分以不同的速度移動(dòng)，從而使相時(shí)，各組分以不同的速度移動(dòng)，從而使不同的組分分離純化。不同的組分分離純化。 層析方法：層析方法：吸附層析、分配層析、離子吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層析、層析聚交換層析、凝膠層析、親和層析、層析聚焦焦層析分離方法層析分離方法 層析方法層析方法分離依據(jù)分離依據(jù)吸附層析吸附層析利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力吸附力不同而使混合不同而使混合物中各組分分離物中各組分分離分配層析分配層析利用各組分在兩相中的利用各組分在兩相中的分配系數(shù)分配系數(shù)不同，而使各不同，而使各組分分離組分分離離

46、子交換層析離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的對(duì)各種離子的親和力親和力不同而達(dá)到分離目的不同而達(dá)到分離目的凝膠層析凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離不同而達(dá)到物質(zhì)分離親和層析親和層析利用生物分子與配基之間所具有的利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可專一而又可逆的親和力逆的親和力，使生物分子分離純化，使生物分子分離純化層析聚焦層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性等電點(diǎn)特性與離子交換層析與離子交換層

47、析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離吸附層析是利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附層析是利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術(shù)中的方法。吸附層析是各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來(lái)源豐富、應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡(jiǎn)單。價(jià)格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡(jiǎn)單。吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱吸附層析柱。層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加入，層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入

48、吸附層析柱后，再加當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過(guò)程。附、再解吸、再吸附的過(guò)程。 （1）吸附層析：）吸附層析： 1）原理：）原理： 2 2）洗脫方法：溶劑洗脫法）洗脫方法：溶劑洗脫法 置換洗脫法置換洗脫法 前緣洗脫法前緣洗脫法 3 3）吸附劑、洗脫劑的選擇）吸附劑、洗脫劑的選擇4 4）分類：）分類：根據(jù)吸附機(jī)制的不同可分為根據(jù)吸附機(jī)制的不同可分為2 2種：種：物理吸附物理吸附 法，羥基磷灰石法法，羥基磷灰石法；都是利用樣品中不同分子與吸附劑之間的吸都是利用樣品中不同分

49、子與吸附劑之間的吸附和解吸性質(zhì)不同而達(dá)到分離的目的；附和解吸性質(zhì)不同而達(dá)到分離的目的；操作過(guò)程包括：吸附劑的平衡與活化，加樣操作過(guò)程包括：吸附劑的平衡與活化，加樣吸附，洗滌和洗脫。吸附，洗滌和洗脫。 物理吸附法：物理吸附法：常用的吸附劑有硅藻土，活性氧常用的吸附劑有硅藻土，活性氧化鋁，淀粉和活性炭等；預(yù)先洗滌和活化后，在化鋁，淀粉和活性炭等；預(yù)先洗滌和活化后，在低鹽，弱酸或近中性條件下加樣吸附，再在弱堿低鹽，弱酸或近中性條件下加樣吸附，再在弱堿條件下進(jìn)行洗脫。條件下進(jìn)行洗脫。 羥基磷灰石法：羥基磷灰石法：羥基磷灰石是一種微晶型磷酸羥基磷灰石是一種微晶型磷酸鈣；一般認(rèn)為其表面的鈣離子和磷酸根離子

50、與蛋鈣；一般認(rèn)為其表面的鈣離子和磷酸根離子與蛋白質(zhì)帶相反電荷的基團(tuán)發(fā)生相互作用；也是在低白質(zhì)帶相反電荷的基團(tuán)發(fā)生相互作用；也是在低鹽和弱酸或中性條件下進(jìn)行吸附鹽和弱酸或中性條件下進(jìn)行吸附 ；洗脫時(shí)提高；洗脫時(shí)提高離子強(qiáng)度。離子強(qiáng)度。（2）分配層析）分配層析 1）定義：）定義：分配層析是利用各組分在兩相中的分配分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。 2）分配系數(shù)：）分配系數(shù)：是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩項(xiàng)溶劑中的濃劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩項(xiàng)溶劑中的濃度的比值。在層析條件

51、確定后，層析系數(shù)是一常度的比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。數(shù)。 3）種類：紙上層析）種類：紙上層析 薄層層析薄層層析 氣相層析氣相層析 （3 3）離子交換層析）離子交換層析 利用帶電荷的離子交換劑為載體，將帶相反電荷利用帶電荷的離子交換劑為載體，將帶相反電荷的蛋白質(zhì)吸附，然后在一定條件下洗脫下來(lái)。的蛋白質(zhì)吸附，然后在一定條件下洗脫下來(lái)。 離子交換劑離子交換劑是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過(guò)在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入物質(zhì)。通過(guò)在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。 按活性基團(tuán)的

52、性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽(yáng)陽(yáng)離子交換劑離子交換劑和和陰離子交換劑陰離子交換劑。 過(guò)程：離子交換劑的預(yù)處理及平衡、裝柱及加樣過(guò)程：離子交換劑的預(yù)處理及平衡、裝柱及加樣吸附、洗脫、洗脫液收集與相應(yīng)檢測(cè)、離子交換吸附、洗脫、洗脫液收集與相應(yīng)檢測(cè)、離子交換劑的再生。劑的再生。離子交換劑類型的選擇：離子交換劑類型的選擇：應(yīng)考慮以下幾個(gè)因素：應(yīng)考慮以下幾個(gè)因素：參考電泳結(jié)果：參考電泳結(jié)果：在中性或偏堿性條件下進(jìn)行電泳，向陽(yáng)在中性或偏堿性條件下進(jìn)行電泳，向陽(yáng)極移動(dòng)較快的酶，可選用陰離子交換劑；向陰極移動(dòng)較極移動(dòng)較快的酶，可選用陰離子交換劑；向陰極移動(dòng)較快的酶可被陽(yáng)

53、離子交換劑吸附?？斓拿缚杀魂?yáng)離子交換劑吸附。待分離酶的穩(wěn)定性：待分離酶的穩(wěn)定性：待分離酶如果在低于待分離酶如果在低于pI的條件下穩(wěn)的條件下穩(wěn)定，則選用陽(yáng)離子交換劑；待分離酶如果在高于定，則選用陽(yáng)離子交換劑；待分離酶如果在高于pI的條的條件下穩(wěn)定，則選用陰離子交換劑。件下穩(wěn)定，則選用陰離子交換劑。待分離酶的待分離酶的pI： pI9時(shí)選時(shí)選用陽(yáng)離子交換劑；用陽(yáng)離子交換劑； pI在在6-9之間選用陽(yáng)性和陰性均可。之間選用陽(yáng)性和陰性均可。 1、原理、原理：是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而

54、達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。（4）凝膠層析：）凝膠層析： 凝膠層析又稱為凝膠層析又稱為凝膠過(guò)濾凝膠過(guò)濾，分子排阻層分子排阻層析析，分子篩層析分子篩層析等。是指以各種多孔凝等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。的一種層析技術(shù)。凝膠層析柱中裝有凝膠層析柱中裝有多孔凝膠多孔凝膠，當(dāng)含有各，當(dāng)含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進(jìn)入大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進(jìn)入凝膠的微孔，只

55、能分布于凝膠顆粒的間凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過(guò)凝膠柱。較小隙中，以較快的速度流過(guò)凝膠柱。較小的分子能進(jìn)入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進(jìn)的分子能進(jìn)入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進(jìn)出于一個(gè)個(gè)顆粒的微孔內(nèi)外，這就使出于一個(gè)個(gè)顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小小分子物質(zhì)向下移動(dòng)的速度比大分子的速分子物質(zhì)向下移動(dòng)的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對(duì)分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層對(duì)分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。析柱，而達(dá)到分離的目的。2、凝膠的類型與選擇、凝膠的類型與選擇： 葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠 Sephadex G: 是

56、葡聚糖微網(wǎng)狀是葡聚糖微網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)的干膠。結(jié)構(gòu)的干膠。 有有SephadexG-10G-200共共8種型號(hào)；種型號(hào)；G后面的數(shù)字后面的數(shù)字表示交聯(lián)度，數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，吸水量越表示交聯(lián)度，數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，吸水量越大，其數(shù)值約為吸水量的大，其數(shù)值約為吸水量的10倍。倍。瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠: 有有Sepharose, Superose和和 Bio-Gel A三種，每三種，每種又有各種不同的型號(hào)；種又有各種不同的型號(hào)； 凝膠的孔徑大小是通過(guò)瓊脂糖濃度來(lái)控制的；凝膠的孔徑大小是通過(guò)瓊脂糖濃度來(lái)控制的； 分級(jí)范圍很寬；但對(duì)溫度要求嚴(yán)格（分級(jí)范圍很寬；但對(duì)溫度要求嚴(yán)格（2-30），），40以上時(shí)

57、易融化，低于以上時(shí)易融化，低于0時(shí)易堵塞。時(shí)易堵塞。聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠: 包括凝膠的吸水平衡，裝柱，加樣，洗脫，流出液，包括凝膠的吸水平衡，裝柱，加樣，洗脫，流出液，酶活檢測(cè)和部分收集。酶活檢測(cè)和部分收集。 層析結(jié)果常以洗脫曲線來(lái)表示（圖層析結(jié)果常以洗脫曲線來(lái)表示（圖2-3），即以洗脫），即以洗脫液中蛋白質(zhì)含量（液中蛋白質(zhì)含量（A280）或酶活力對(duì)洗脫體積（或酶活力對(duì)洗脫體積（Ve)作圖。作圖。 衡量分離效果的標(biāo)準(zhǔn)是：分辨率高，回收率高，稀衡量分離效果的標(biāo)準(zhǔn)是：分辨率高，回收率高，稀釋倍數(shù)小，流速快。釋倍數(shù)小，流速快。 分辨率分辨率Rs = 兩峰間距離兩峰間距離/峰寬；要求峰寬；要求

58、Rs 1.2； Rs 與與柱長(zhǎng)柱長(zhǎng)L有關(guān)，有關(guān)， Rs 與與L 呈正比。呈正比。 3）凝膠柱層析的基本過(guò)程與要求）凝膠柱層析的基本過(guò)程與要求A2800.40.30.2 0.1酶活力 蛋白質(zhì)酶活力 800 900 1000 1100 洗脫體積Ve（ml） 圖圖2-3 凝膠過(guò)濾洗脫曲線凝膠過(guò)濾洗脫曲線（5）親和層析法：親和層析法：定義：定義：親和層析是利用生物分子與配基之間所具有親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)?；募夹g(shù)。親和層析法的四項(xiàng)要素：親和層析法的四項(xiàng)要素： 固相基質(zhì)固相基質(zhì)（solid ma

59、trix） 特異聯(lián)接的物質(zhì)特異聯(lián)接的物質(zhì)（specific binding substance） 耦合反應(yīng)耦合反應(yīng)（coupling reaction） 洗脫洗脫（elution） 親親和和層層析法的四析法的四項(xiàng)項(xiàng)要素：要素：(2)SpecificBindingSubstance (B)洗脫Elution(4)配 體Ligand (A)耦合反應(yīng) (3)Coupling Reaction雜質(zhì)BBBB(1)Solid MatrixB親和層析的核心是親和層析的核心是親和吸附劑親和吸附劑，它是由固相，它是由固相 載體和能與目的酶專一可逆結(jié)合的配體共價(jià)結(jié)載體和能與目的酶專一可逆結(jié)合的配體共價(jià)結(jié)合而成的。

60、合而成的。將親和吸附劑填充層析柱，讓酶液流過(guò)層析將親和吸附劑填充層析柱，讓酶液流過(guò)層析柱，則目的酶就能迅速而選擇性地吸附在親和柱，則目的酶就能迅速而選擇性地吸附在親和吸附劑上；吸附劑上；用適當(dāng)?shù)娜芤哼M(jìn)行洗滌，除去一些非專一性用適當(dāng)?shù)娜芤哼M(jìn)行洗滌，除去一些非專一性的雜蛋白后，再用濃度高的或親和力更強(qiáng)的配的雜蛋白后，再用濃度高的或親和力更強(qiáng)的配體溶液進(jìn)行親和洗脫目的酶便可被洗脫出來(lái)。體溶液進(jìn)行親和洗脫目的酶便可被洗脫出來(lái)。機(jī)理：機(jī)理： 親親和和層層析法的作用析法的作用機(jī)機(jī)理：理：固相載體(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB親和基團(tuán)配體XBAA載體載體配體配體臂臂待分離