GB∕T 41234-2022 水生動物RNA病毒核酸檢測參考物質(zhì)質(zhì)量控制規(guī)范 假病毒

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中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準

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水生動物犚犖犃病毒核酸檢測參考物質(zhì)質(zhì)量控制規(guī)范 假病毒

犛狆犲犮犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狇狌犪犾犻狋狔犮狅狀狋狉狅犾狅犳狉犲犳犲狉犲狀犮犲犿犪狋犲狉犻犪犾狊犳狅狉犚犖犃狏犻狉狌狊犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犪狇狌犪狋犻犮犪狀犻犿犪犾狊—犃狉犿狅狉犲犱犚犖犃

２０２０３０９發(fā)布 ２０２１００１實施

發(fā)布

國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會

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前 言

本文件按照ＧＢ／Ｔ１．１—２０２０《標準化工作導則第１部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。

本文件由全國水產(chǎn)標準化技術(shù)委員會（ＳＡＣ／ＴＣ１５６）歸口。

本文件起草單位：中國檢驗檢疫科學研究院、連云港海關(guān)、北京海關(guān)。

本文件主要起草人：張、林祥梅、王娜、吳紹強、景宏麗、鄧俊花、周毅、谷強、任彤、江育林。

Ⅰ

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水生動物犚犖犃病毒核酸檢測參考物質(zhì)質(zhì)量控制規(guī)范 假病毒

１范圍

本文件給出了作為水生動物ＲＮＡ病毒核酸檢測參考物質(zhì)的假病毒，其質(zhì)量控制規(guī)范的術(shù)語和定義、縮略語、原理、試劑或材料、儀器設(shè)備，規(guī)定了假病毒的質(zhì)量控制、假病毒的保存、假病毒的驗證，以及假病毒質(zhì)量評價方法。

本文件適用于水生動物ＲＮＡ病毒核酸檢測中假病毒（裝甲ＲＮＡ）類參考物質(zhì)的質(zhì)量控制。

２規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

ＧＢ／Ｔ６８２分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

３術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

３．１

３．２３．３３．４３．５３．６

變異系數(shù)犮狅犲犳犻犮犻犲狀狋狅犳狏犪狉犻犪狋犻狅狀

概率分布離散程度的一個歸一化量度，其定義為數(shù)據(jù)標準差與數(shù)據(jù)平均值之比。

初始樣犳狉狅狀狋狊犪犿狆犾犲

按照制備先后順序，最先制備的１／３批次產(chǎn)品。

假病毒犪狉犿狅狉犲犱犚犖犃

外膜蛋白包裹病毒ＲＮＡ片段形成的病毒樣粒子。

均勻性狌狀犻犳狅狉犿犻狋狔

同一生產(chǎn)批次的假病毒，每支含有等量目的基因的狀態(tài)。

溯源性狋狉犪犮犲犪犫犻犾犻狋狔

假病毒中目的基因序列與病原參考毒株序列的一致性。

穩(wěn)定性狊狋犪犫犻犾犻狋狔

假病毒在特定保存條件和保存時間范圍內(nèi)，保證檢測結(jié)果為陽性的能力。

１

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３．７

陽性參考物質(zhì)狆狅狊犻狋犻狏犲狉犲犳犲狉犲狀犮犲犿犪狋犲狉犻犪犾

與病原擁有某些完全相同的特征，如相同的目的基因序列、抗原性、敏感性等，用于該病原檢測一定會得出理想的陽性檢測結(jié)果，通常作為陽性對照判定待測樣品是否為病原陽性。

３．８

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３．９３．１０

中間樣 犿犻犱犾犲狊犪犿狆犾犲

按照制備先后順序，中間制備的１／３批次產(chǎn)品。

終止樣犳犻狀犪犾狊犪犿狆犾犲

按照制備先后順序，最后制備的１／３批次產(chǎn)品。

最小有效取樣量 犿犻狀犻犿狌犿犲犳犲犮狋犻狏犲狊犪犿狆犾犲狏狅犾狌犿犲

使用病原檢測方法，可檢測出陽性結(jié)果的最小陽性參考物質(zhì)的量。

４縮略語

下列縮略語適用于本文件。Ａｍｐ：氨芐青霉素（ａｍｐｉｃｉｌｉｎ）Ｃｔ：擴增循環(huán)數(shù)（ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）

ｃＤＮＡ：互補脫氧核糖核酸（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）

ＤＥＰＣ：焦碳酸二乙酯（ｄｉｅｔｈｙｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）ＤＮＡ：脫氧核糖核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）

ｄＡＴＰ：三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）

ｄＣＴＰ：三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｄＧＴＰ：三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｄＮＴＰ：脫氧核糖核苷三磷酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｄＴＴＰ：三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ＥＢ：溴化乙錠（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）

ＩＰＴＧ：異丙基硫代βＤ半乳糖苷（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβＤ１ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）

ＬＢ：營養(yǎng)肉湯（ｌｕｒｉａｂｅｒｔａｎｉｂｒｏｔｈ）

ＰＣＲ：聚合酶鏈式反應(yīng)（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）ＲＮＡ：核糖核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）

ＲＴＰＣＲ：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）

ＲＴｑＰＣＲ：逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）

犜犪狇：水生嗜熱菌（犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌狊）

Ｘｇａｌ：５溴４氯３吲哚βＤ半乳糖苷（５ｂｒｏｍｏ４ｃｈｌｏｒｏ３ｉｎｄｏｌｙｌβＤｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）

５原理

假病毒為一種病毒樣粒子，外膜蛋白為ＭＳ２噬菌體蛋白，包裹用于檢測病毒的目的ＲＮＡ片段。假病毒與ＭＳ２噬菌體類似，能夠耐受核酸酶的降解，具有較好的穩(wěn)定性，且不具備自我復制能力和感染能力。

２

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假病毒表達載體含有ＭＳ２噬菌體的成熟蛋白編碼基因、衣殼蛋白編碼基因和衣殼蛋白編碼基因下游影響噬菌體包裝的１９ｂｐ發(fā)夾結(jié)構(gòu)（見附錄Ａ）；在多克隆位點中插入病毒目的ｃＤＮＡ片段后形成重組假病毒表達載體；該載體在蛋白表達系統(tǒng)中能夠?qū)⒉迦氲耐庠雌无D(zhuǎn)錄成ＲＮＡ，同時合成的ＭＳ２噬菌體蛋白能夠選擇性包裹ＲＮＡ，自組裝成病毒樣粒子，成為假病毒。目前假病毒的制備方法主要為：先利用酶切連接法制備表達載體，再利用原核或真核表達系統(tǒng)組裝假病毒粒子，制備流程按照附錄Ｂ進行。作為ＲＮＡ病毒檢測參考物質(zhì)的假病毒，應(yīng)具備以下特征：包含有病毒ＲＮＡ，可利用ＲＴＰＣＲ、ＲＴｑＰＣＲ等核酸檢測方法特異性檢測到病毒ＲＮＡ；具有良好的核酸酶耐受性，保護病毒目的ＲＮＡ不被核

酸酶降解；不含有病毒ｃＤＮＡ。

６試劑或材料

６．１本文件中所有化學試劑，除特別注明外，全部為分析純試劑。

６．２水：符合ＧＢ／Ｔ６８２中一級水規(guī)定。

６．３ＤＥＰＣ水：商品化試劑。

６．４ＲＴＰＣＲ試劑和ＲＴｑＰＣＲ試劑：商品化試劑。

６．５病毒目的ＤＮＡ的擴增引物：可參照相應(yīng)的國家標準、行業(yè)標準合成。

６．６Ｔｒｉｚｏｌ：商品化試劑。

６．７ＲＮａｓｅ：商品化試劑。

６．８ＲＮａｓｅ滅活處理的ＥＰ管、試管、ＰＣＲ管、移液器槍頭：商品化耗材。

６．９假病毒載體：由商品化載體構(gòu)建。

６．１０制備假病毒所需的其他試劑：按照附錄Ｃ配制。

７儀器設(shè)備

７．１超凈工作臺。７．２冷凍高速離心機。７．３電子天平。

７．４高壓滅菌鍋。

７．５ＰＣＲ儀。

７．６電泳儀。

７．７熒光定量ＰＣＲ儀。７．８紫外分光光度計。７．９凝膠成像系統(tǒng)。７．１０移液器。

８假病毒的質(zhì)量控制

８．１假病毒中病毒目的犚犖犃片段的檢測和溯源性

８．１．１病毒目的犚犖犃片段的犚犜犘犆犚檢測

以所制備的假病毒溶液作為待測樣品，定性檢測樣品中是否含有病毒目的ＲＮＡ片段。

ａ）提取假病毒的ＲＮＡ。

ｂ）以ＲＮＡ為模板，使用相應(yīng)病毒檢測方法推薦的引物和實驗條件進行ＲＴＰＣＲ擴增。設(shè)置以

３

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水為模板的陰性對照，以病毒ＲＮＡ為模板的陽性對照。

ｃ）反應(yīng)產(chǎn)物進行電泳觀察。

８．１．２擴增產(chǎn)物的溯源性分析

將８．１．１的擴增產(chǎn)物回收、測序。測序結(jié)果與相應(yīng)病毒參考毒株的序列進行比對。

８．１．３假病毒中病毒目的犚犖犃片段的質(zhì)量判定

在ＲＴＰＣＲ陰性對照和陽性對照都成立的情況下，若同時滿足以下兩點，則說明病毒目的ＲＮＡ片段包裹入外膜蛋白：

ａ）假病毒ＲＮＡ的ＲＴＰＣＲ結(jié)果為陽性；

ｂ）擴增產(chǎn)物序列比對結(jié)果顯示與相應(yīng)病毒的參考毒株序列同源性不低于９％。

若假病毒ＲＮＡＲＴＰＣＲ產(chǎn)物為陰性，則表明假病毒未包裹病毒目的ＲＮＡ片段，或假病毒提純失敗，應(yīng)重新制備假病毒或提純假病毒。

８．２假病毒中病毒犮犇犖犃雜質(zhì)的檢測

８．２．１犘犆犚或狇犘犆犚檢測

分別以未抽提的假病毒溶液和抽提的假病毒ＲＮＡ為模板，使用相應(yīng)病毒檢測方法推薦的引物和實驗條件進行ＰＣＲ或ｑＰＣＲ擴增。設(shè)置以水為模板的陰性對照，以假病毒重組質(zhì)粒為模板的陽性對照。

８．２．２結(jié)果判定

在陰性對照和陽性對照都成立的情況下：

ａ）未抽提的假病毒溶液或假病毒ＲＮＡ，ＰＣＲ或ｑＰＣＲ結(jié)果為陽性，則表明溶液或外膜蛋白中有病毒來源的ｃＤＮＡ雜質(zhì)，則假病毒不能作為ＲＮＡ參考物質(zhì)使用，應(yīng)重新消化去除ｃＤＮＡ；

ｂ）未抽提的假病毒溶液和假病毒ＲＮＡ，ＰＣＲ或ｑＰＣＲ結(jié)果為陰性，則說明病毒ｃＤＮＡ已全部

去除。

８．３假病毒中病毒目的犚犖犃片段的定量

使用ＲＴｑＰＣＲ方法，對假病毒中病毒目的ＲＮＡ片段進行定量。所使用的ＲＴｑＰＣＲ方法應(yīng)為針對該病毒目的ＲＮＡ片段設(shè)計建立的方法。

標準品可以為病毒ＲＮＡ，或病毒ｃＤＮＡ，或含有病毒目的ＤＮＡ片段的重組質(zhì)粒，使用紫外分光光

度計測定標準品濃度。

將標準品１０倍梯度稀釋至少５個梯度，分別以每個梯度的標準品溶液為模板，進行ＲＴｑＰＣＲ反應(yīng)，根據(jù)各梯度標準品的Ｃｔ值和濃度制定標準曲線和公式。

根據(jù)假病毒ＲＮＡ的Ｃｔ值，利用標準曲線和公式計算出假病毒溶液中病毒目的ＲＮＡ片段的濃度。

也可以先計算假病毒ＲＮＡ和標準品的Ｃｔ值的差，再根據(jù)公式（１）計算出假病毒ＲＮＡ和標準品之間的濃度比。

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式中：

犡＝１０（ΔＣｔ／３．３） （１）

ΔＣｔ——標準品Ｃｔ值和假病毒ＲＮＡＣｔ值的差；

犡 ——假病毒ＲＮＡ和標準品之間的濃度比。

４

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８．４假病毒最小有效取樣量的確證

８．４．１取樣量的設(shè)定和犚犜犘犆犚、犚犜狇犘犆犚確證

８．４．１．１分別取１０μＬ、２０μＬ、５０μＬ、１０μＬ、２０μＬ和５０μＬ假病毒。

８．４．１．２分別提取６組假病毒的ＲＮＡ。

８．４．１．３以８．４．１．２為模板，使用相應(yīng)病毒檢測方法推薦的引物和實驗條件，進行ＲＴＰＣＲ或ＲＴｑＰＣＲ擴增。設(shè)置以水為模板的陰性對照，以病毒ＲＮＡ為模板的陽性對照。

８．４．１．４ＲＴＰＣＲ產(chǎn)物電泳，或ＲＴｑＰＣＲ產(chǎn)物讀數(shù)。

８．４．２最小有效取樣量的確證

在陰性對照和陽性對照都成立的情況下，樣品擴增產(chǎn)物可同時滿足以下三點要求的最小有效取樣量：

ａ）取樣量可保證ＲＮＡ提取過程正常完成；

ｂ）ＲＴＰＣＲ擴增出的目的ＤＮＡ條帶亮度不低于分子量標準（上樣量５μＬ，濃度約５０ｎｇ／μＬ）的條帶亮度；

ｃ）ＲＴｑＰＣＲ檢測結(jié)果的Ｃｔ值介于２５±３．３之間。

８．５假病毒均勻性檢測

８．５．１檢測方法

８．５．１．１以初始樣、中間樣、終止樣三階段分別隨機抽取共１０份假病毒樣品。

８．５．１．２依據(jù)同人同機原則，分別提?。保胺輼悠返模遥危?。

８．５．１．３分別以１０份假病毒ＲＮＡ為模板，使用相應(yīng)病毒檢測方法推薦的引物和實驗條件進行ＲＴＰＣＲ或ＲＴｑＰＣＲ擴增，每份樣品做３個平行對照，取平均Ｃｔ值。

８．５．１．４ＲＴＰＣＲ產(chǎn)物電泳，或ＲＴｑＰＣＲ產(chǎn)物讀數(shù)并計算變異系數(shù)。

８．５．２假病毒均勻性判定

判定標準如下：

ａ）１０份假病毒樣品的檢測結(jié)果全部為陽性，且ＲＴＰＣＲ擴增的１０條ＤＮＡ條帶亮度相同；或

ＲＴｑＰＣＲ得出的１０份樣品Ｃｔ值變異系數(shù)≤１０％，則表明假病毒樣品均勻性良好；

ｂ）ＲＴＰＣＲ有樣品為弱陽性或陰性；或ＲＴｑＰＣＲ１０份樣品Ｃｔ值變異系數(shù)＞１０％，則表明假病毒樣品均勻性不良，需重新混勻分裝。

８．６假病毒穩(wěn)定性檢測

８．６．１假病毒溫度穩(wěn)定性檢測

設(shè)置２組假病毒樣品，分別放置于４℃和－２０℃保存。分別在第１天、第３天、第５天、第７天、第２周、第３周、第１月和第１年時間段，每組各?。持悠?，１個樣品應(yīng)至少設(shè)三個重復，?。担唉蹋碳俨《救芤禾崛。遥危粒褂孟鄳?yīng)病毒檢測方法推薦的引物和實驗條件進行檢測。

８．６．２假病毒犚犖犪狊犲耐受性檢測

根據(jù)假病毒中病毒ＲＮＡ的濃度，取假病毒溶液，含病毒ＲＮＡ約１０μｇ；加入１０ＵＲＮａｓｅ，孵育１ｈ，孵育溫度根據(jù)ＲＮａｓｅ說明書設(shè)置。取５０μＬ假病毒溶液提?。遥危?，進行ＲＴＰＣＲ或ＲＴｑＰＣＲ

５

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檢測。

８．６．３假病毒穩(wěn)定性判定

假病毒經(jīng)以下３種方法平行處理后，ＲＴＰＣＲ或ＲＴｑＰＣＲ檢測結(jié)果仍為陽性，說明穩(wěn)定性良好，否則需重新制備假病毒：

ａ）４℃至少保存７ｄ；ｂ）－２０℃至少保存１年；ｃ）ＲＮａｓｅ處理１ｈ。

９假病毒的保存

低于－２０℃條件下保存時間不超過１年，避免反復凍融；４℃條件下保存時間不超過７ｄ。

１０假病毒的驗證

假病毒作為水生動物ＲＮＡ病毒核酸檢測參考物質(zhì)，經(jīng)過至少５家具備核酸提取和分子生物學檢測能力的水生動物檢測實驗室平行測定。測定內(nèi)容包括病毒目的ＲＮＡ片段的特異性、定性檢測、定量檢測等。定性檢測要求檢測結(jié)果為陽性，定量檢測要求Ｃｔ值誤差不超過±３．３。測定結(jié)果都合格后，才能投入使用。

１ 假病毒質(zhì)量評價方法

經(jīng)８．１～８．６步驟檢測，假病毒應(yīng)同時滿足以下７點要求，才能作為水生動物ＲＮＡ病毒核酸檢測參考物質(zhì)使用：

ａ）外膜蛋白包裹病毒目的ＲＮＡ片段，擴增片段序列與相應(yīng)病毒的參考毒株序列同源性不低于９％；

ｂ）假病毒溶液中和外膜蛋白里都不含有病毒ｃＤＮＡ；

ｃ）最小有效取樣量能同時滿足ＲＮＡ提取和ＲＴＰＣＲ或ＲＴｑＰＣＲ的需求；

ｄ）同批次樣品均勻性良好，檢測結(jié)果基本一致；

ｅ）４℃保存７ｄ，－２０℃保存１年，檢測結(jié)果仍為陽性；ｆ）擁有一定的核酸酶耐受性，ＲＮａｓｅ處理１ｈ后仍可使用；

ｇ）經(jīng)過至少５家水生動物疫病研究實驗室的平行測定，且測定結(jié)果全部合格。

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附 錄犃

（資料性）

基因序列

假病毒載體中插入的ＭＳ２基因（ＧｅｎＢａｎｋＭＫ２１３７９５，成熟蛋白編碼基因、衣殼蛋白編碼基因和衣殼蛋白編碼基因下游影響噬菌體包裝的１９ｂｐ發(fā)夾結(jié)構(gòu)），全長１７０６ｂｐ。

１ＣＴＡＴＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＣＴＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＣＴＴＴＴＡＧＴＡＣＣＴＴＧＡＴ

７１ＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＣＴＴＣＧＴＣＣＴＣＧＴＴＣＧＣＧＴＴＴＡＣＧＣＧＧＡＣＧＧＴＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧＡＴＡＡＣＴＣＡＴＴＣＴ１４１ＣＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＧＴＣＧＴＴＴＴＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＧＧＧＣＡＡＡＡＣＧＡＡＡＣＡＧＴＧＧＣＡ２１ＣＴＡＣＣＴＣＴＣＧＴＡＴＴＣＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＴＴＡＡＧＴＧＴＣＡＣＡＴＣＧＡＴＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＡＣＡＡＧＣＧＡＡＧＴ２８１ＧＧＧＴＣＡＴＣＧＴＧＧＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＣＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＴＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＧＡＣＧＣＡＣＧＣＴＣＴＧＣＴ３５１ＡＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＣＣＡＡＡＡＣＴＴＧＡＣＴＴＡＣＡＴＣＧＡＡＧＴＧＣＧＣＡＧＡＡＣＧＴＴＧＣＧＡＡＣＧＧＧＣＧＴＣ４２１ＧＡＣＧＡＡＧＴＣＣＴＧＣＡＡＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧＴＡＡＴＴＴＴＡＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＴＴＴＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＧ４９１ＡＣＡＧＣＴＣＡＣＡＡＣＴＣＧＣＧＡＣＧＣＡＡＡＣＡＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＣＧＴＡＣＡＣＴＧＣＧＣＴＣＧＴＣＧＣＧＧＴＡＡＴＴ５６１ＧＧＣＧＣＡＧＧＣＧＣＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＧＣＣＴＡＡＡＣＧＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＧＡＴＣＡＡＡＡＣＡＣＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧ６３１ＧＴＧＧＴＴＧＧＡＧＴＴＧＣＡＧＴＴＣＧＧＴＴＧＧＴＴＡＣＡＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＡＧＧＧＴＧＣＡＴＡＴＧＡＧＡＴＧＣＴＴＡＣＧ７０１ＡＡＧＧＴＴＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＴＴＴＣＴＴＣＴＡＴＧＡＧＡＧＣＧＴＡＣＧＴＣＡＧＧＴＣＧＧＴＡＣＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＡＧＡＴＧ７１ＧＣＧＴＣＴＧＴＣＧＴＡＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＡＣＴＴＣＡＧＡＣＡＡＣＧＴＧＣＡＡＣＡＴＡＴＣＧＣＧＡＣＧＴＡＴＣＧＴＧＡＴＡＴＧＧＴＴ８４１ＴＴＡＣＡＴＡＡＡＣＧＡＴＧＣＡＣＧＴＴＴＧＧＣＡＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＣＴＣＴＡＧＧＴＡＴＣＴＴＧＡＡＣＣＡＣＴＡＧＧＴＡＴＡＧＴＧＴＧＧ９１ＧＡＡＡＡＧＧＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＡＴＴＣＧＴＴＧＴＣＧＡＣＴＧＧＣＴＣＴＡＣＣＴＧＴＡＧＧＴＡＡＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＧＧ９８１ＣＣＣＧＴＧＧＧＡＴＧＣＴＣＴＡＣＡＴＧＴＣＡＧＧＡＡＣＡＧＴＴＡＣＴＧＡＣＧＴＡＡＴＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＣＡＴＣＡＴＡＡＧＣＧＴ１０５１ＴＧＡＣＧＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＡＡＧＧＣＣＡＡＡＴＣＴＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＴＣＧＡ１２１ＧＧＧＧＴＡＣＡＡＴＣＧＴＡＴＧＧＣ ＡＡＣＡＡＣＴＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧＴＡＡＡＧＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＧＡＴＧＧＴＣＣＡＴＡＣＴＴＡＧ１９１ＡＴＧＣＧＴＴＡＧＣＡＴＴＡＡＴＣＡＧＧＣＡＡＣＧＧＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＡＣＧＧＡＧＴＴＴＧＡＡＧＣＡＴＧＧＣＴＴＣＴ１２６１ＡＡＣＴＴＴＡＣＴＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＣＴＧＴＣＧＣＣＡＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧ１３１ＣＴＡＡＣＧＧＧＧＴＣＧＣＴＧＡＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＡＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＴＡＡＣＴＧＴＡＧＣＧＴＴＣＧ１４０１ＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧＣＡＧＡＡＴＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＴＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＣＴＧＴＴ１４７１ＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＴＧＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＡＡＣＡＴＴＣＡＡＴＴＴＴＣＧ１５４１ＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＴＧＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＡＴＴＣ１６１ＣＴＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧＡＣＧＣＧＧＣＡＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＡＴＧ１６８１ＴＣＧＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＴＣＴ

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犅．１試劑或材料

犅．１．１ＤＥＰＣ水：商品化試劑。

附 錄犅

（規(guī)范性）

假病毒制備方法

犅．１．２ＤＮＡ凝膠回收試劑、原核表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、真核表達系統(tǒng)：商品化試劑盒。

犅．１．３質(zhì)粒載體：Ｔ載體，商品化試劑。

犅．１．４假病毒質(zhì)粒載體：由使用實驗室自己合成，或采購其他實驗室已經(jīng)構(gòu)建的載體。載體多克隆位點中應(yīng)成功插入ＭＳ２蛋白基因片段，基因方向應(yīng)正確，也可再插入６×Ｈｉｓ基因，使表達出的假病毒外膜蛋白包含６×Ｈｉｓ標簽，可使用ＮｉＮＴＡ親和層析法純化。

犅．１．５ｄＮＴＰ：含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ，－２０℃保存，避免溫度劇烈變化。

犅．１．６犜犪狇ＤＮＡ聚合酶：５Ｕ／μＬ，－２０℃保存，避免溫度劇烈變化。

犅．１．７逆轉(zhuǎn)錄酶ＡＭＶ：１０Ｕ／μＬ，－２０℃保存，避免反復凍融和溫度劇烈變化。犅．１．８病毒目的ＤＮＡ的擴增引物：可參照相應(yīng)的國家標準或行業(yè)標準合成。犅．１．９Ｔ４ＤＮＡ連接酶：３５０Ｕ／μＬ，－２０℃保存，避免溫度劇烈變化。

犅．１．１０限制性內(nèi)切酶：－２０℃保存，避免溫度劇烈變化。

犅．１．１ＩＰＴＧ：２０％，按照Ｃ．１配制。犅．１．１２Ｘｇａｌ：２％，按照Ｃ．２配制。犅．１．１３ＬＢ培養(yǎng)基：按照Ｃ．３配制。

犅．１．１４Ｔｒｉｚｏｌ、ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅＡ、ＴｒｉｔｏｎＸ１０、Ａｍｐ：商品化試劑。

犅．１．１５溴化乙錠：１０ｍｇ／ｍＬ，按照Ｃ．４配制，也可選擇商品化試劑。犅．１．１６５０×ＴＡＥ電泳緩沖液：按照Ｃ．５配制，也可選擇商品化試劑。犅．１．１７６×上樣緩沖液：按照Ｃ．６配制，也可選擇商品化試劑。

犅．１．１８ＲＮａｓｅ滅活處理的ＥＰ管、試管、ＰＣＲ管、移液器槍頭：商品化耗材。

犅．２儀器設(shè)備

犅．２．１水浴鍋。

犅．２．２恒溫搖床。

犅．２．３超凈工作臺。

犅．２．４冷凍高速離心機。

犅．２．５電子天平。犅．２．６高壓滅菌鍋。犅．２．７ＰＣＲ儀。

犅．２．８電泳儀。

犅．２．９熒光定量ＰＣＲ儀。犅．２．１０紫外分光光度計。犅．２．１ 凝膠成像系統(tǒng)。犅．２．１２移液器。

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犅．３假病毒參考物質(zhì)的制備

犅．３．１病毒總犚犖犃的提取

按照待檢目的病毒檢測的國家標準或行業(yè)標準中推薦的方法，從病毒液中提取總ＲＮＡ。對于還未建立檢測標準的病毒，可按照非標方法提取總ＲＮＡ。

犅．３．２目的犮犇犖犃的選擇、引物設(shè)計和擴增

犅．３．２．１目的ｃＤＮＡ的選擇：選擇該病毒檢測標準中推薦的目的ＤＮＡ序列。

犅．３．２．２引物設(shè)計：根據(jù)該病毒檢測標準中推薦的引物序列，在２條引物５′端分別加入酶切位點。酶切位點的選擇應(yīng)遵循以下原則：

ａ）應(yīng)從假病毒載體上的酶切位點中選擇；ｂ）２條引物所帶的酶切位點不能相同；ｃ）應(yīng)確保目的ＤＮＡ不含有該酶切位點；

ｄ）確保引入酶切位點后，引物也不易產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)；

ｅ）兩個酶切位點在載體上的位置，不能有重疊堿基。

針對傳染性造血器官壞死病毒、鯉春病毒血癥病毒、病毒性出血性敗血癥病毒和草魚呼腸孤病毒

（Ⅰ型和Ⅱ型）等重要水生動物ＲＮＡ病毒，根據(jù)ＯＩＥ水生動物疾病診斷手冊和相關(guān)國家標準推薦的病毒目的ＤＮＡ序列，可嘗試使用以下酶切位點：正向引物，ＮｏｔⅠ或ＫｐｎⅠ；反向引物，ＨｉｎｄⅢ。

犅．３．２．３使用犜犪狇酶和反轉(zhuǎn)錄酶，以總ＲＮＡ為模板進行ＲＴＰＣＲ擴增。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照相

應(yīng)病毒檢測標準進行。為增加ＤＮＡ的回收量，ＲＴＰＣＲ的總反應(yīng)體系至少為２０μＬ。

犅．３．３反應(yīng)產(chǎn)物的上樣和電泳

將５０×ＴＡＥ電泳緩沖液稀釋５０倍，再配制１％的瓊脂糖（含０．５μｇ／ｍＬＥＢ）凝膠平板。將全部ＰＣＲ擴增產(chǎn)物和１／５體積的上樣緩沖液混勻后加入樣品孔。在電泳時使用核酸分子量標準參照物作對照。５Ｖ／ｃｍ電泳２０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ，當溴酚藍到達凝膠平板２／３處時停止。

犅．３．４目的犇犖犃的回收

在紫外燈下觀察電泳后的凝膠，切下含目的ＤＮＡ的條帶，放入離心管中。根據(jù)商品化凝膠回收試劑盒說明書，提取目的ＤＮＡ。使用２０μＬ水溶解ＤＮＡ。

犅．３．５目的犇犖犃質(zhì)量檢測

取２μＬ目的ＤＮＡ溶液上樣和電泳，在紫外燈下觀察電泳結(jié)果：若ＤＮＡ分子量位置與檢測標準中規(guī)定的目的ＤＮＡ位置相同，則目的ＤＮＡ回收成功；若位置不同，或無明顯ＤＮＡ條帶出現(xiàn)，則目的ＤＮＡ提取失敗，應(yīng)重新擴增回收。

使用紫外分光光度計測量目的ＤＮＡ濃度。

犅．３．６目的犇犖犃連接入犜載體

根據(jù)分子量計算目的ＤＮＡ和Ｔ載體的濃度，載體連接外源基因體系應(yīng)符合表Ｂ．１要求。

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表犅．１載體連接外源基因體系

試劑

加入量

１０×Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅＢｕｆｅｒ

２．５μＬ

目的ＤＮＡ

０．３ｐｍｏｌ

Ｔ載體

０．０３ｐｍｏｌ

Ｔ４ＤＮＡ連接酶

１μＬ

ｄＨ２Ｏ

加水至總體積２５μＬ

反應(yīng)條件：１６℃，至少１２ｈ。

犅．３．７犜載體連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與藍白斑篩選

犅．３．７．１?。保唉蹋檀竽c桿菌ＤＨ５α感受態(tài)溶液于１．５ｍＬ離心管中，加入１０μＬ連接產(chǎn)物，將離心管置冰?。常埃恚椋?，４２℃水?。梗埃?，再冰?。担恚椋睿患尤耄梗唉蹋蹋蹋屡囵B(yǎng)液，混勻，３７℃振蕩培育１ｈ。

犅．３．７．２?。保唉蹋叹?，加入４０μＬＸｇａｌ溶液（２％）和７μＬＩＰＴＧ（２０％），混勻后，均勻涂布于含

１０μｇ／ｍＬＡｍｐ的ＬＢ平板（９０ｍｍ直徑）上；室溫放置５ｍｉｎ后，３７℃倒置培養(yǎng)１２ｈ～１６ｈ。

犅．３．７．３另取１０μＬ感受態(tài)溶液，不加連接產(chǎn)物，為陰性對照，操作方法見Ｂ．３．７．２。

犅．３．７．４培養(yǎng)結(jié)果觀察：藍色菌落攜帶空質(zhì)粒，乳白色菌落攜帶重組質(zhì)粒；若陰性對照也生長出菌落，說明培養(yǎng)基中Ａｍｐ失效，需重新制備平板進行藍白斑篩選。

犅．３．７．５將平板置于４℃保存?zhèn)溆茫４鏁r間不超過１個月。

犅．３．７．６Ｔ載體重組質(zhì)粒的提?。?/p>

ａ）挑白斑單菌落，放入３ｍＬ含１０μｇ／ｍＬＡｍｐ的ＬＢ液體培養(yǎng)基中，３７℃搖菌過夜。?。保担恚叹海础姹４妫４鏁r間不超過１個月。剩余１．５ｍＬ菌液用于提?。暂d體重組質(zhì)粒。

ｂ）使用商品化質(zhì)粒提取試劑盒提取菌液中的質(zhì)粒，加入５０μＬ超純水溶解，－２０℃保存?zhèn)溆谩?/p>

犅．３．８犜載體重組質(zhì)粒和假病毒空載體的雙酶切

雙酶切體系應(yīng)符合表Ｂ．２要求。

表犅．２酶切體系

試劑

加入量／μＬ

質(zhì)粒（Ｔ載體重組質(zhì)?；蚣俨《究蛰d體）

１０

５′端內(nèi)切酶

２

３′端內(nèi)切酶

２

Ｂｕｆｅｒ

５

ＢＳＡ

０．５

ｄＨ２Ｏ

３０．５

總體積５０μＬ（酶切體系可根據(jù)商品化內(nèi)切酶說明書進行調(diào)整）。反應(yīng)條件：３７℃，４ｈ。

酶切產(chǎn)物電泳，Ｔ載體重組質(zhì)粒應(yīng)當出現(xiàn)１條和空Ｔ載體大小相同的帶，以及１條和病毒目的

ＤＮＡ大小相同的帶；假病毒空質(zhì)粒酶切后應(yīng)當只出現(xiàn)１條ＤＮＡ條帶，大小與假病毒載體相同。

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犅．３．９酶切產(chǎn)物的回收與定量

按照Ｂ．３．４描述的方法，對酶切出的病毒ｃＤＮＡ和假病毒空載體ＤＮＡ進行回收，并使用紫外分光光度計進行定量。

犅