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文檔簡介
1、第六節(jié) 結(jié)核分枝桿菌實驗活動風(fēng)險評估報告1、 生物因子 (一)一般特性 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis),于1882年由德國微生物學(xué)家Koch發(fā)現(xiàn)并證實為結(jié)核病的病原菌。1886年,Lehman和Neuman正式將其命名為結(jié)核分枝桿菌,又稱結(jié)核菌。1.形態(tài)與染色結(jié)核分枝桿菌細(xì)長略彎曲,端極鈍圓,大小約(14)m×(0.30.6)um ,呈單個或分枝狀排列,有時呈V、Y、人字型排列,無鞭毛和芽孢。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌無莢膜。結(jié)核分枝桿菌常用萋-尼氏(Ziehl- Neelsen)抗酸性染色法染色,染色后結(jié)核分枝桿菌呈現(xiàn)紅色,其他非抗酸性細(xì)菌呈藍(lán)色
2、。結(jié)核分枝桿菌除正常典型桿狀形態(tài)外,在陳舊的病灶和培養(yǎng)物中,形態(tài)常不典型,可呈顆粒狀,串球狀,短棒狀,長絲形等;或受物理因素、化學(xué)因素,以及藥物等因素的影響,而呈現(xiàn)異常變化;另外,還有可通過在內(nèi)在電鏡下觀察細(xì)菌濾膜的濾過型、細(xì)胞壁缺損或喪失的細(xì)胞壁缺陷L型,以及存在于結(jié)核病灶、漿液性滲出液等樣品可看到的革蘭染色陽性顆粒的球狀微粒型。2.生長特性和培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌為緩慢生長細(xì)菌,較普通細(xì)菌生長十分緩慢,在動物體內(nèi)繁殖代時約為15h,在家兔角膜中約需要2022h,在巨噬細(xì)胞內(nèi)月需要1520h。體外生長時營養(yǎng)要求高,可在含有蛋黃、馬鈴薯、甘油和天門冬素或動物血清等的固體培養(yǎng)基上生長。最適PH6.47
3、.0,在3540可生長,最適溫度為3537。常用的培養(yǎng)基有羅氏培養(yǎng)基、小川培養(yǎng)基、油酸血清(白蛋白)瓊脂培養(yǎng)基和蘇通液體培養(yǎng)基等,在良好的培養(yǎng)條件下,生長代時約1824h,培養(yǎng)24周才出現(xiàn)肉眼可見的菌落。在固體培養(yǎng)基上菌落呈顆粒、結(jié)節(jié)或花菜狀,乳白色或米黃色,不透明;而在液體蘇通培養(yǎng)基內(nèi)呈粗糙皺紋狀菌膜生長。3.生化反應(yīng)結(jié)核分枝桿菌能夠產(chǎn)生硝酸鹽還原酶,可使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽;在酸性條件下,亞硝酸鹽與氨基苯磺胺、N-甲萘基乙烯二銨鹽酸鹽形成紅色偶氮化合物。牛分枝桿菌和部分非結(jié)核性分枝桿菌不能產(chǎn)生硝酸鹽還原酶,因此可用于結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌的鑒別。結(jié)核分枝桿菌缺乏煙酸酶,故不能分解代謝過程
4、中產(chǎn)生的煙酸,在培養(yǎng)中,結(jié)核分枝桿菌生長時的煙酸聚集量較牛分枝桿菌及其他分枝桿菌高。煙酸砒啶環(huán)的氮與聯(lián)苯胺及溴化氰作用后,呈現(xiàn)桃紅色或紅色沉淀反應(yīng)。通過煙酸試驗可以將結(jié)核分枝桿菌同其他分枝桿菌區(qū)分。4.免疫學(xué)特性抗結(jié)核免疫反應(yīng)在結(jié)核分枝桿菌感染中起著根本作用,免疫系統(tǒng)能有效地抵抗大多數(shù)感染,感染結(jié)核分枝桿菌的大多數(shù)人(約90%)在其一生中并不能發(fā)展成患有結(jié)核病。然而,當(dāng)與免疫系統(tǒng)疾病同時存在時,如合并感染人類免疫缺陷病毒(HIV),發(fā)展為結(jié)核病的機會就會大大增加。結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)感染菌,其免疫主要是以T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌侵入人體內(nèi),被巨噬細(xì)胞吞噬后,未活化的巨噬細(xì)胞的抗菌活性
5、弱,不能防止所吞噬的結(jié)核分枝桿菌生長,但可遞呈抗原,使周圍T淋巴細(xì)胞致敏。致敏淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生多種淋巴因子,如IL-2、IL-6、INF-。這些因子與TNF-的共同作用可殺死結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌的免疫屬于感染免疫,又稱有菌免疫,即只有當(dāng)結(jié)核分枝桿菌或其組分存在體內(nèi)時才有免疫力。一旦體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌或其組分全部消失,則免疫也隨之不存在。5.遺傳特性 結(jié)核分枝桿菌基因序列有4400多萬bp,包含了4000多個基因,有很高的鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)含量。結(jié)核分枝桿菌基因組在進(jìn)化過程中形成了不同的分枝,主要有北京家族、東非-印度分枝、中亞或德里家族、哈勒姆家族、拉丁美洲和地中海家族等,其中北京
6、家族有高毒力和高致病性。6. 耐藥性 結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐性的機制主要是靶編碼基因的突變所致。結(jié)核分枝桿菌的自然耐藥突變率為10-1010-5之間。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌的編碼基因發(fā)生突變后,其對耐藥的敏感性表型發(fā)生改變,這樣的突變是隨機、自發(fā)的,并和是否與藥物接觸無關(guān)。在一個菌群中,耐藥個體的出現(xiàn)是以一定頻率產(chǎn)生的,并隨著藥物對敏感菌體殺滅的選擇作用,耐藥菌體的比例逐漸增加,直至成為耐藥菌優(yōu)勢菌群。耐藥結(jié)核分枝桿菌可以分為原發(fā)耐藥、初始耐藥和繼發(fā)耐藥,但結(jié)核分枝桿菌會出現(xiàn)交叉耐藥的情況,即對一種藥物產(chǎn)生耐藥后,同時又對另一個藥物也產(chǎn)生敏感性的改變。(2) 來源 結(jié)核桿菌可侵犯全身各器官,但以肺結(jié)核為最
7、多見。結(jié)核病是一種古老的疾病,也許有了人類之后,不久就有了它的存在。1965年,法國學(xué)者Sylvius根據(jù)解剖了死于所謂“消耗病”或“癆病”人的尸體,發(fā)現(xiàn)肺臟及其他器官有顆粒狀的病變,根據(jù)其形態(tài)特征稱之為“結(jié)核”。1973年,湖南長沙馬王堆漢墓出土的2100年前的女尸身上發(fā)現(xiàn)左上肺門均有結(jié)核病灶。因而,結(jié)核的名稱就此被應(yīng)用至今。(3) 傳染性因結(jié)核病病變進(jìn)展的患者痰中帶有大量的結(jié)核桿菌,故這類患者是結(jié)核病的主要傳染源,痰中的結(jié)核桿菌越多,傳播的危險性就越大。病人出現(xiàn)痰涂片陽性,若1mL痰液中含菌量為100010000,則其痰涂片陽性率為40%50%。病人排菌量越大,其密切接觸者的感染率也就越高
8、。結(jié)核桿菌菌株之間毒力有較大差異,不同類型的病人排出結(jié)核桿菌不僅在數(shù)量上不同,其毒力也不同,因而其傳染性亦不同。感染的結(jié)核桿菌活力越強,數(shù)量越大,傳染性也越強。 感染藥物敏感菌的結(jié)核病患者在未治療時的相對傳染性為100%。通常,結(jié)核病患者經(jīng)一段時間治療后,結(jié)核桿菌對人的感染能力減弱,相對傳染性降為25%;感染耐藥菌的病人未治療時相對傳染性為100%,在治療時則降為27.3%。(4) 傳播途徑結(jié)核分枝菌主要通過呼吸道傳播,傳染源主要是排菌的肺結(jié)核病人(尤其是痰涂片陽性,未經(jīng)治療者)的痰。飛沫感染為最常見的方式,健康人吸入患者咳嗽、打噴嚏時噴出的飛沫而受感染。直徑小于10um的痰滴可進(jìn)入肺泡腔,或
9、因其重量輕而漂浮于空氣中較長時間,在室內(nèi)通風(fēng)不良環(huán)境中的帶菌飛沫,亦可被吸入引起感染。感染的次要途徑是經(jīng)消化道進(jìn)入體內(nèi)。少量、毒力弱的結(jié)核分枝桿菌多能被人體免疫防御機制所殺滅。僅當(dāng)受大量毒力強的結(jié)核菌侵襲而機體免疫力不足時,感染后可能發(fā)病。其他感染途徑,如經(jīng)皮膚、消化道、泌尿生殖系統(tǒng)等均少見。(五)易感性1.宿主范圍 結(jié)核分枝桿菌的宿主包括人、牛、犬、豬、猴、羊等。人、畜、禽類被結(jié)核桿菌感染后,在感染個體的機體多種組織內(nèi)形成肉芽腫和干酪樣鈣化灶為特征的慢性傳染病。2.易感人群 結(jié)核病主要是人群之間傳播的傳染病,發(fā)生結(jié)核桿菌傳播主要取決于傳染源排菌情況。在受到結(jié)核菌感染的人群中只有4%5%的人發(fā)
10、生結(jié)核病,其余90%以上的人并不發(fā)病。3.易感者的自身因素 結(jié)核桿菌進(jìn)入人體,引起易感者機體的復(fù)雜反應(yīng)。易感者的身體和心理等狀況均可影響機體的反應(yīng)過程和結(jié)果。機體的自然免疫力強、接種過卡介苗(Bacillus calmette guérin,BCG)或受過感染后獲得了免疫力,則能將入侵的結(jié)核桿菌殺死或嚴(yán)密包圍,制止其擴散,使病灶愈合。(六)潛伏期潛伏期尚不明確,可能為數(shù)天、數(shù)月、數(shù)年。(七)劑量效應(yīng)關(guān)系傳染源排出的飛沫受壓力和黏度的影響而大小不一。飛沫核直徑為110um者在空氣中漂浮的時間長。進(jìn)入人體末梢氣管內(nèi)越多,越容易傳播。豚鼠通過氣溶膠途徑接觸15個結(jié)核分枝桿菌感染就可造成肺部
11、感染并導(dǎo)致死亡。小鼠對結(jié)核分枝桿菌少見天然感染,靜脈注射標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv2501000萬個菌量,可于半月左右發(fā)病死亡。而雜種小鼠則需要更大的劑量。不同小鼠株系也有耐受和敏感性程度上的差異。(八)致病性結(jié)核分枝桿菌不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素。其致病性可能與細(xì)菌在組織細(xì)胞內(nèi)大量繁殖引起的炎癥、菌體成分和代謝物質(zhì)的毒性,以及機體對菌體成分產(chǎn)生的免疫損傷有關(guān)。結(jié)核分枝桿菌可通過呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入易感機體,引起多種組織器官的結(jié)核病,其中以通過呼吸道引起肺結(jié)核為多見。因腸道中有大量正常菌群寄居,結(jié)核分枝桿菌必須通過競爭才能生存并和易感細(xì)胞黏附。肺泡中無正常菌群,結(jié)核分枝桿菌可通過飛沫微滴或含菌塵埃的方式
12、被吸入,故肺結(jié)核較為多見。1. 肺部感染 由于感染菌的毒力、數(shù)量、機體的免疫狀態(tài)不同,肺結(jié)核可以有以下兩類表現(xiàn)。(1) 原發(fā)感染:多發(fā)生于兒童。肺泡中有大量巨噬細(xì)胞,少數(shù)活的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入肺泡即被巨噬細(xì)胞吞噬。該菌有大量脂質(zhì),可抵抗溶菌酶而繼續(xù)繁殖,使巨噬細(xì)胞遭受破壞,釋放出的大量菌在肺泡內(nèi)引起炎癥,稱為原發(fā)灶。(2) 原發(fā)后感染:病灶亦以肺部為多見。病菌可以是外來的(外源性感染)或原來潛伏在病灶內(nèi)(內(nèi)源性感染)。由于機體已有特異性細(xì)胞免疫,因此,原發(fā)后感染的特點是病灶多局限。一般不累及鄰近的淋巴結(jié),被纖維素包圍的干酪樣壞死灶可鈣化而痊愈。若干酪樣結(jié)節(jié)破潰,排入鄰近支氣管,則可形成空洞并釋放
13、大量結(jié)核分枝桿菌至痰中。2. 肺外感染 部分患者體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌可進(jìn)入血液循環(huán)引起肺內(nèi)、外播散,如腦、腎結(jié)核,痰菌被咽入消化道也可引起腸結(jié)核、結(jié)核性腹膜炎等。結(jié)核分枝桿菌缺乏明確的外毒素、侵襲性酶和內(nèi)毒素。其毒力與素狀因子、硫脂、脂阿拉伯甘露聚糖、磷脂、某些分泌性蛋白等有關(guān)。但在整體水平和細(xì)胞水平仍未得到可滿意的解釋病原性毒力因子。其致病性可能與在宿主體內(nèi)頑強增殖和引起機體的病理性免疫反應(yīng)有關(guān)。結(jié)核感染和發(fā)病時間之間存在著很大的個體差異,感染后數(shù)月至數(shù)十年發(fā)病,甚至可終身無病。歐美在20世紀(jì)報道一代感染者中約有5%10%發(fā)病。日本在20世紀(jì)3040年代統(tǒng)計表明年內(nèi)發(fā)病率為30%,近年報告降低
14、為10%。我國無確切統(tǒng)計數(shù)字可依據(jù)。在發(fā)病者中近半數(shù)在感染后半年至兩年內(nèi)于機體抵抗力低時發(fā)病。90%的結(jié)核菌感染者可保持終生不發(fā)病。(九)變異性結(jié)核分枝桿菌可發(fā)生形態(tài)、菌落、毒力、免疫原性和耐藥性等變異??ń槊纾˙CG)就是Calmette和Guerin 2人(1908年)將牛結(jié)核分枝桿菌在含甘油、膽汁、馬鈴薯的培養(yǎng)基中經(jīng)13年230次傳代而獲得的減毒活疫苗株。結(jié)核分枝桿菌的耐藥性變異隨著化療藥物的應(yīng)用而產(chǎn)生,耐藥利福平藥物結(jié)核分枝桿菌多聯(lián)系ropB基因突變,而異煙肼、吡嗪酰胺多聯(lián)系katG和inhA、pncA基因的突變。一株結(jié)核分枝桿菌可以發(fā)生多到對十幾種藥物的耐藥,印度等國家就陸續(xù)報道了全
15、耐藥結(jié)核分枝桿菌(TDR-TB)。(十)穩(wěn)定性1.在自然環(huán)境中的穩(wěn)定性與對溫度的敏感性 在自然條件下結(jié)核分枝桿菌在室內(nèi)陰暗潮濕處能存活半年;在干燥的痰中于陰暗處可存活68個月;在隨塵土飛揚的空氣中可保持傳染性810d;在污染的圖書上可存活3個月;3條件下存活1年,68環(huán)境下可存活45年。另有資料表明,室內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌微滴核約60%71%,可存活3h,48%56%中存活6h,28%32%中存活9h以上。2.化學(xué)滅活 結(jié)核分枝桿菌直接接觸70%75%乙醇530min可被殺死,因此可用于皮膚消毒。但由于乙醇能凝固蛋白,使痰表面形成一層把菌體包裹起來的膜,短時間內(nèi)不能殺死細(xì)菌,通常乙醇不用于痰標(biāo)本的
16、消毒,1%甲醛處理結(jié)核分枝桿菌5min,可使細(xì)菌死亡。5%甲醛和痰液等量混合,處理12h以上才能達(dá)到殺菌作用。在房間密閉性好、相對濕度60%80%的條件下,使用810g/m3甲醛熏蒸12h以上,可有效殺滅空氣中和光滑表面物品上的結(jié)核分枝桿菌。對結(jié)核分枝桿菌污染的室內(nèi)空氣,可用甲醛氣體熏蒸的方法進(jìn)行終末消毒。3.物理滅活 干熱180可達(dá)到殺菌目的,殺死痰中的結(jié)核菌則需3h以上。結(jié)核分枝桿菌對濕熱敏感,65 30min或95 1min可殺滅結(jié)核分枝桿菌純培養(yǎng)物;100煮沸5min可殺死痰中結(jié)核分枝桿菌。65巴氏消毒法可用于牛奶中結(jié)核分枝桿菌的滅活。用600W微波滅菌器照射4min,可將玻璃表面污染
17、的牛型結(jié)核分枝桿菌完全殺滅。121壓力蒸汽30min,132預(yù)真空壓力蒸汽3min均可殺滅動物臟器、痰或培養(yǎng)基中的結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌對日光敏感,日光照射2h以上可殺死結(jié)核分枝桿菌,紫外線對結(jié)核分枝桿菌有一定殺滅作用,用輻射強度在100w/cm2以上的30w紫外線燈,在相對濕度50%70%的條件下,照射40min以上,對空氣中結(jié)核分枝桿菌的殺滅效果可達(dá)99.9%以上。(十一)預(yù)防和治療1.免疫 結(jié)核病是結(jié)核桿菌所致的慢性傳染病,具有抗感染免疫的特征,包括先天性免疫和獲得性免疫。先天性免疫是抗結(jié)核的天然抵抗力,由體表和體內(nèi)防御系統(tǒng)租成,是非特異性免疫,如體表屏障、呼吸道的纖毛上皮、肺泡巨噬
18、細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的吞噬作用、溶菌酶的殺菌作用等。獲得性免疫是機體受結(jié)核桿菌免疫原刺激后產(chǎn)生的針對該病原體的抵抗力,是特異性免疫。細(xì)胞免疫起決定性作用,體液免疫無重要影響。目前使用的卡介苗接種可以獲得部分免疫性保護(hù),對預(yù)防和減少兒童結(jié)核病,特別是結(jié)核性腦膜炎等的發(fā)生起著重要作用,但是對于青少年和成人的保護(hù)效果差異較大,不同的人群和不同地區(qū)的保護(hù)力在0%80%不等,尤其是對HIV感染者,無法接種卡介苗以提供保護(hù)。2.預(yù)防 藥物預(yù)防的目的,主要是對那些已經(jīng)感染結(jié)核菌并有較高發(fā)病可能的人進(jìn)行預(yù)防性服藥以減少結(jié)核病的發(fā)生。因為健康人受到結(jié)核菌感染后不一定發(fā)病,是否發(fā)病主要受到兩種因
19、素的影響,即感染結(jié)核菌毒力的大小和身體抵抗力的強弱。對已感染結(jié)核菌但沒有發(fā)生結(jié)核病的人進(jìn)行抗結(jié)核藥物治療,其目的是為了盡可能殺死體內(nèi)感染的結(jié)核菌,減少菌量,防止產(chǎn)生或減少已感染結(jié)核菌者發(fā)生結(jié)核病的機會。常用藥物預(yù)防方法有:利福噴叮加異煙肼,每周服藥2次,3個月;單服異煙肼每日1次,6個月。在進(jìn)行“預(yù)防性治療”時,必須有專業(yè)醫(yī)生指導(dǎo),排除活動性結(jié)核病的存在,服藥要進(jìn)行管理,防止不良反應(yīng)發(fā)生,在知情同意基礎(chǔ)上進(jìn)行。3.診斷 結(jié)核病的診斷分為臨床診斷和實驗室診斷(1)臨床診斷肺結(jié)核病的診斷參照肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(ws288-2008);肺外結(jié)核的診斷依據(jù)臨床癥狀和實驗室結(jié)果進(jìn)行判斷。(2)實驗室診斷細(xì)菌
20、學(xué)檢測 細(xì)菌學(xué)檢測包括涂片顯微鏡檢查、分離培養(yǎng)和藥敏試驗。標(biāo)本的選擇根據(jù)感染部位,可取痰、支氣管灌洗液、尿、糞、腦脊液或胸、腹水。其他肺外感染可取血或相應(yīng)部位分泌液或組織細(xì)胞。涂片顯微鏡檢查是指對獲取標(biāo)本進(jìn)行染色后顯微鏡檢查,通過形體發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌,診斷結(jié)核病。該檢查簡便易行,準(zhǔn)確性較高,從痰中查出結(jié)核菌,就能確診患了結(jié)核病,但敏感性低(050%)。分離培養(yǎng)是指對獲取的標(biāo)本經(jīng)堿性處理后接種于培養(yǎng)基上,觀察生長情況,診斷結(jié)核病。分離培養(yǎng)的結(jié)果可信度高,一般23周內(nèi)肉眼可見菌落,但個別菌需68周,檢測時間長使得應(yīng)用受到限制。藥敏試驗是指對分離后的結(jié)核分枝桿菌在耐藥培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),以獲得結(jié)核分支桿
21、菌對抗結(jié)核藥物的敏感情況。藥敏試驗是診斷耐藥結(jié)核病的主要方法,但傳統(tǒng)藥敏試驗需要4周,影響了耐藥結(jié)核病的及時診斷。免疫學(xué)檢測 結(jié)核菌素試驗是應(yīng)用結(jié)核菌素進(jìn)行皮膚來測定機體對結(jié)核分枝桿菌是否能引起超敏反應(yīng)的一種試驗。該方法可以用于結(jié)核病篩查,但不能區(qū)分自然感染和人工接種感染。細(xì)胞免疫介導(dǎo)的結(jié)核菌干擾素釋放試驗(T-cell interferon gamma release assays,TIGRA又稱IFMGRA或GRA)是近年來采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)法定量檢出受檢者全血或外周血單個核細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的IFN-檢出釋放反應(yīng),用于結(jié)核菌潛伏感
22、染的診斷。結(jié)核分枝桿菌檢測是檢測體液中的抗結(jié)核分枝桿菌的抗體,可以使用ELISA、膠體金等方法,但特異性和敏感性都不高,僅可作為結(jié)核病輔助診工具。分子檢測 通過檢測結(jié)核分枝桿菌或耐藥結(jié)核分枝桿菌特異的基因片段從而推斷結(jié)核病,有熒光定量PCR、恒溫擴增等方法。該類方法檢測周期短,能及時提供檢測結(jié)果,但需要進(jìn)行進(jìn)一步的應(yīng)用評價。3. 治療 結(jié)核分枝桿菌是能侵襲機體任何組織、器官引起進(jìn)行性疾病的致病菌。人型結(jié)核分枝桿菌是人類結(jié)核病的病原菌,結(jié)核分枝桿菌的致病作用可能與細(xì)菌在組織細(xì)胞內(nèi)頑強增殖引起炎癥反應(yīng),以及誘導(dǎo)機體產(chǎn)生遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)性損傷有關(guān)。結(jié)核分枝桿菌可通過呼吸道、消化道和破損的皮膚黏膜進(jìn)入機
23、體,侵犯多種組織器官,引起相應(yīng)器官的結(jié)核病,其中以肺結(jié)核最常見。臨床上肺結(jié)核大致可分為四種類型:原發(fā)性肺結(jié)核、粟粒性肺結(jié)核、浸潤性肺結(jié)核和空洞性肺結(jié)核。結(jié)核分枝桿菌對一般抗生素不敏感。對鏈球菌素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇等藥物敏感。對于非耐藥結(jié)核病有WHO推薦的DOTS發(fā)現(xiàn)治療和管理策略。按照標(biāo)準(zhǔn)的DOT規(guī)定,及時就診、及時確診、規(guī)范治療和管理,均能治愈。耐藥結(jié)核病的診斷復(fù)雜,治療困難,往往療程很長,耐多藥病人一般需要1824個月,而且醫(yī)藥費用是治療一般病人的100倍左右。因此,耐藥結(jié)核病的治療對個人、家庭以及社會均造成巨大的經(jīng)濟壓力。耐藥結(jié)核病的臨床表現(xiàn)與普通結(jié)核病無明顯差別,臨床癥狀多種多
24、樣,輕重不等,與患者的年齡、機體的免疫狀態(tài)、營養(yǎng)狀態(tài)、并存疾病,入侵的結(jié)核分枝桿菌的毒力、菌量及病變部位及嚴(yán)重程度等均有關(guān)系。臨床可表現(xiàn)發(fā)熱、不同程度的咳嗽、咳痰,部分患者可有咯血,病變廣泛時可有呼吸困難等。肺外耐藥結(jié)核病的臨床表現(xiàn)據(jù)不同發(fā)病部位而不同。耐藥結(jié)核病的診斷和治療需到市級以上的專業(yè)或定點結(jié)核病醫(yī)療機構(gòu)進(jìn)行診治,通過標(biāo)準(zhǔn)化治療方案、個體治療方案和經(jīng)驗治療方案的結(jié)合,以及特殊治療措施的實施能達(dá)到較好的治療效果。(二)事故分析1.實驗室本身事故 BSL-2及BSL-3實驗室中尚未發(fā)生過結(jié)核分枝桿菌感染事故。2.有關(guān)實驗室已發(fā)生的事故 迄今為止未見有關(guān)證實是由于在實驗室操作結(jié)核桿菌而感染人
25、的報道。二、風(fēng)險評估與風(fēng)險控制(一)實驗活動1.實驗活動的分險評估 所有實驗活動根據(jù)中華人民共和國傳染病防治法 病原微生物實驗室生物安全管理條例和結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊。2.實驗操作過程(1)菌株的傳代操作過程1) 在磨菌管上標(biāo)記好樣品編號,于生物安全柜中是用無菌吸管吸取無菌生理鹽水后。加幾滴到磨菌管中。2) 打開菌株培養(yǎng)管,用滅菌的接種環(huán)輕輕刮取菌落,置于磨菌管中。3) 使用磨菌棒將菌落制成均勻的菌液。4) 靜置10min后,用吸管接種約0.1ml至中改良羅氏培養(yǎng)基斜面上。5) 傳代后的培養(yǎng)基放置36培養(yǎng),每周1次觀察菌落生長情況,于肉眼可見菌落出現(xiàn)后23周進(jìn)
26、行藥敏試驗。風(fēng)險因素(見表8-20)。表8-20 菌株的傳代過程中可能出現(xiàn)的風(fēng)險及控制措施序號實驗操作可能風(fēng)險風(fēng)險發(fā)生概率風(fēng)險控制措施殘留風(fēng)險1開蓋啟開液體濺出較低整個活動中動作輕柔,勿劇烈操作,以防止液體濺出低風(fēng)險2刮取菌落菌落濺出中整個活動中動作輕柔,勿劇烈操作,以防止菌落濺出低風(fēng)險3磨菌磨菌管破碎較低整個活動中動作輕柔,以防止磨菌管破裂低分險4接種產(chǎn)生氣溶膠較低吸管動作輕柔低分險(3) 菌懸液制備操作過程1) 在磨菌管上標(biāo)記好樣品編號,于生物安全柜中使用無菌吸管吸取含10%吐溫80無菌生理鹽水后,加幾滴到磨菌管中。2) 用一次性接種棒(環(huán))刮取23周德新鮮菌落,置于磨菌管中。3) 注意盡
27、可能刮取斜面各個部位的菌落,避免挑取1、2個單獨菌落進(jìn)行試驗,刮取菌的量以半環(huán)或一環(huán)(510mg)為宜。4) 使用磨菌棒將菌落制成均勻度菌液。5) 逐漸滴加滅菌生理鹽水,直至菌液濁度與麥?zhǔn)?號標(biāo)準(zhǔn)比濁管一致,即得到1mg/mL的菌液。風(fēng)險因素(見表8-21)。表8-21 菌懸液制備過程中可能出現(xiàn)的風(fēng)險及控制措施序號實驗操作可能風(fēng)險風(fēng)險發(fā)生概率風(fēng)險控制措施殘留風(fēng)險1開蓋啟開液體濺出較低動作輕柔,勿劇烈操作,以防止液體濺出低風(fēng)險2刮取菌落菌落濺出中動作輕柔,勿劇烈操作,以防止菌落濺出低風(fēng)險3磨菌磨菌管破碎較低動作輕柔,防止磨菌管破裂低分險(4)菌液稀釋和接種操作過程1) 菌液稀釋:在無菌、帶有螺旋
28、蓋的試管中以無菌吸管加入2ml滅菌生理鹽水備用,每株待測菌準(zhǔn)備2管;菌液靜置,待顆?;蚓鷫K沉淀;用22 SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)取2滿環(huán)1mg/mL的菌液,平移至2ml 滅菌生理鹽水中,即稀釋10-2mg/mL菌液;用同樣方法再進(jìn)行100倍稀釋,即成10-4mg/mL菌液。2) 接種:用22 SWG 標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)分別取1滿環(huán)(即0.01mL)10-2mg/mL和10-4mg/mL的菌液,用劃線法均勻接種至作為對照的中性改良羅氏培養(yǎng)基及含藥培養(yǎng)基表面,應(yīng)注意使菌液盡可能均勻分散于培養(yǎng)基斜面;最終接種菌量為10-4mg和10-6mg。風(fēng)險因素(見表8-22)。表8-22 菌懸液稀釋和接種過程中可能出現(xiàn)的風(fēng)險
29、及控制措施序號實驗操作可能風(fēng)險風(fēng)險發(fā)生概率風(fēng)險控制措施殘留風(fēng)險1稀釋吸管吹動產(chǎn)生氣溶膠中吸管操作輕柔,勿劇烈操作,以防止氣溶膠的產(chǎn)生低風(fēng)險2接種液體濺出較高接種環(huán)移動的活動中動作平穩(wěn),勿劇烈操作,以防止液體濺出低風(fēng)險(4) 培養(yǎng)操作過程1) 接種后的培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)內(nèi),直立放置(36±1)培養(yǎng)。2) 培養(yǎng)4周后報告結(jié)果。風(fēng)險因素(見表8-23)。表8-23 菌懸液培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)的風(fēng)險及控制措施序號實驗操作可能風(fēng)險風(fēng)險發(fā)生概率風(fēng)險控制措施殘留風(fēng)險1移送培養(yǎng)管培養(yǎng)管滑落破碎低移送培養(yǎng)管時動作謹(jǐn)慎低風(fēng)險(二)設(shè)施設(shè)備設(shè)備的風(fēng)險評估按計劃進(jìn)行,實驗人員進(jìn)入實驗室應(yīng)檢查實驗室壓力是否正常
30、,以確保壓力處于正常狀態(tài)。實驗室安排專業(yè)公司定期維護(hù)保養(yǎng),建立日常維護(hù)計劃,每年進(jìn)行年檢;對于生物安全柜和壓力蒸汽滅菌器,每年有專人維護(hù)、檢測;每年舉辦兩次周期性培訓(xùn),確保人員掌握生物安全柜、壓力蒸汽滅菌器的使用規(guī)程,以及出現(xiàn)意外事故的應(yīng)急培訓(xùn)。本實驗活動儀器設(shè)備相關(guān)風(fēng)險識別與控制見表8-24。表8-24 XXXBSL-3 實驗室結(jié)核分枝桿菌實驗操作儀器設(shè)備風(fēng)險識別與控制措施儀器名稱可能風(fēng)險發(fā)生可能性后果描述控制措施生物安全柜氣流異常、生物安全柜出現(xiàn)正壓不大可能對實驗人員及實驗室的高度危險操作培訓(xùn),設(shè)備定期維護(hù)。使用時,觀察窗不要抬得過高;柜內(nèi)盡量少放儀器和物品,不要阻塞后面氣口處的空氣流通;
31、禁止在柜內(nèi)使用酒精燈;在柜內(nèi)的所有工作都要在工作臺中央或后部進(jìn)行,并且通過觀察窗能看見柜內(nèi)的操作;盡量減少操作者后面的人員走動,操作者不要頻繁移動及揮動手臂以免破壞定向氣流,前面的空氣柵格不要被吸管或其他材料擋??;生物安全柜的風(fēng)扇在工作開始前及操作結(jié)束后至少要再運行5min。實驗開始前開啟安全柜排風(fēng),待壓力穩(wěn)定后再進(jìn)行實驗培養(yǎng)箱二氧化碳泄漏;電源短路;培養(yǎng)物產(chǎn)生氣溶膠可能性低人員接觸污染1. 每次使用二氧化碳培養(yǎng)箱時,注意觀察二氧化碳?xì)獗?,以及培養(yǎng)箱顯示是否正常,確保電源連接正常,電源線周圍無液體存在2. 定期更換二氧化碳培養(yǎng)箱的空氣濾膜3. 嚴(yán)格規(guī)范操作,定期檢查離心機離心管發(fā)生破裂氣溶膠釋
32、放可能性低人員接觸污染配備離心機有安全套筒,可轉(zhuǎn)移到生物安全柜內(nèi)處理振蕩器產(chǎn)生氣溶膠、泄露和容器破裂可能性低人員樣品接觸污染必須使用塑料的器皿,因為玻璃可能會破裂釋放出感染性物質(zhì),而且可能傷及操作者。在操作結(jié)束后,容器應(yīng)在生物安全柜里才能重新啟動冰箱保存管泄露可能性極低人員樣品接觸污染操作培訓(xùn),做好個人防護(hù)高壓滅菌器人員接觸高溫部位,發(fā)生燙傷可能性中等人員發(fā)生燙傷操作培訓(xùn),做好個人防護(hù)接種環(huán)滅菌器接種環(huán)滅菌器溫度過低,不能滅菌高度接種環(huán)滅菌不徹底定期檢修(三)人員1.健康監(jiān)護(hù)和健康狀況評估 BSL-3實驗室人員每年開展健康體檢,實驗操作前預(yù)留本底血清。BSL-3實驗室人員健康狀況良好。2.人員
33、資質(zhì)和培訓(xùn) 我中心具有開展此項實驗活動的技術(shù)和人員條件,技術(shù)上我中心結(jié)核病實驗室已經(jīng)開展了多年的常規(guī)結(jié)核病檢測工作,曾參與兩次WHO組織的全球結(jié)核病耐藥性監(jiān)測項目。工作人員多年從事結(jié)核病實驗室工作,具有扎實的理論技術(shù)和豐富的實踐經(jīng)驗。所有進(jìn)入BSL-3實驗室人員都需經(jīng)過考察,在近期內(nèi)均接受過微生物操作技術(shù)與實驗室安全的系統(tǒng)培訓(xùn),并經(jīng)考核確認(rèn)適合現(xiàn)崗位工作,簽署知情同意書。本實驗室根據(jù)我中心當(dāng)前及將來業(yè)務(wù)開展需要,組織制訂人員培訓(xùn)計劃。在常規(guī)微生物操作技術(shù)培訓(xùn)的基礎(chǔ)上,還需進(jìn)行消防和預(yù)備狀態(tài)、化學(xué)品安全、生物危險和傳染預(yù)防、救治、緊急醫(yī)學(xué)處理措施的培訓(xùn)。并通過理論和實際操作考核評估每個工作人員對
34、提供的信息的理解力。工作人員要充分了解其實驗工作的性質(zhì)和特點,并正確使用個人防護(hù)裝備。進(jìn)入BSL-3實驗室須得到實驗室負(fù)責(zé)人的批準(zhǔn),應(yīng)詳細(xì)登記出入時間,并保證兩名以上的人員同時進(jìn)入。實驗人員素質(zhì)可能存在的風(fēng)險及控制措施見表8-25.表8-25 XXXBSL-3實驗室結(jié)核分枝桿菌實驗操作人員風(fēng)險識別與控制明細(xì)表潛在風(fēng)險因素發(fā)生可能性后果嚴(yán)重性控制措施實驗人員技術(shù)水平技術(shù)培訓(xùn)不足或操作不熟練導(dǎo)致誤操作中實驗人員需接受相關(guān)技術(shù)培訓(xùn)并考核合格后方能上崗;定期進(jìn)行相關(guān)培訓(xùn)及演練人員健康水平實驗人員身體狀況不佳或患有基礎(chǔ)疾病嚴(yán)重實驗室工作人員每年參加體檢,預(yù)留本底血清標(biāo)本;實驗人員進(jìn)入BSL-3實驗室前需
35、測量體溫,體溫高于37者不能進(jìn)入未經(jīng)授權(quán)人員未經(jīng)授權(quán)人員進(jìn)入BSL-3實驗室中進(jìn)入BSL-3實驗室須得到相關(guān)部門和實驗室負(fù)責(zé)人的批準(zhǔn),應(yīng)詳細(xì)登記出入時間,并保證兩名以上的人員同時進(jìn)入(四)意外事件、事故帶來的風(fēng)險實驗室意外事件包括感染性物質(zhì)的破碎及在臺面、地面和其他表面溢出。感染性物質(zhì)濺入眼睛,皮膚刺傷、誤接觸污染物(如標(biāo)識不清、消毒不徹底等原因)、皮膚刺傷是發(fā)生概率比較高的感染原因。因此,在實驗過程中盡量避免使用利器、實驗時穿戴好N95口罩、眼罩及防護(hù)服,帶高質(zhì)量雙層手套,有接觸污染物時應(yīng)立即消毒并更換新的外層手套。同時,對工作臺面及發(fā)生濺灑的表面及時進(jìn)行可靠的消毒滅菌。(五)其他風(fēng)險控制其
36、他風(fēng)險控制包括對化學(xué)、物理、輻射、電器、水災(zāi)、火災(zāi)、自然災(zāi)害等的風(fēng)險進(jìn)行評估。1. 工作人員實驗活動的非生物風(fēng)險(化學(xué)、物理、輻射、電氣)(1) 電氣設(shè)備安全風(fēng)險。下列情況存在安全風(fēng)險。電氣設(shè)備的設(shè)計及制造不符合相關(guān)安全標(biāo)準(zhǔn)的要求。需要備用電源的設(shè)備未連接備用電源。新的、改裝過的或修理過的電氣設(shè)備在未經(jīng)專業(yè)人員(如有資質(zhì)的電工或生物醫(yī)學(xué)工程師)完成電氣安全測試和設(shè)備符合安全使用要求之前使用。電氣設(shè)備使用人員未接受正確操作培訓(xùn),操作方式不正確,降低電氣安全性。電氣設(shè)備使用人員未定期檢查設(shè)備的可能引起電氣故障的破損。非專業(yè)人員從事電氣設(shè)備和電路工作。未經(jīng)授權(quán)開展需要授權(quán)的工作。未采取措施對設(shè)備去污
37、染以減少維護(hù)人員受化學(xué)或生物性污染的風(fēng)險。對所有電器設(shè)備未定期進(jìn)行檢查和測試,包括接地系統(tǒng)。在實驗室電路中未配置斷路器和漏電保護(hù)器。斷路器不能保護(hù)人,只是用來保護(hù)線路不發(fā)生電流超負(fù)荷從而避免火災(zāi)。漏電保護(hù)器用于保護(hù)人員而避免觸電。實驗室的所有電器未接地,未采用三相插頭。實驗室的所有電器設(shè)備和線路不符合國家電氣安全標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范。(2) 化學(xué)風(fēng)險。 下列情況存在安全風(fēng)險可能通過下列方式暴露于危險性化學(xué)品:吸入,接觸,食入,針刺,通過破損皮膚?;瘜W(xué)品的毒性作用在操作某些化學(xué)品或吸入它們的蒸汽時會對人體健康產(chǎn)生不良影響。除了眾所周知的毒性物質(zhì)以外,已知許多化學(xué)品都有不同的毒性作用,可能對于呼吸系統(tǒng)、血液
38、、肺、肝臟、腎臟和胃腸道系統(tǒng),以及其他器官和組織造成不良影響或嚴(yán)重?fù)p害,而有些化學(xué)品具有致癌性或致畸性。有些可溶性蒸汽在吸入后是有毒性作用的。除了上面所提到的許多嚴(yán)重影響外,發(fā)生暴露時還可能導(dǎo)致一些不能被立即識別的對人體健康的損傷,其中可能包括協(xié)調(diào)性差、嗜睡及類似的癥狀,并使出現(xiàn)事故的可能性增大。長期反復(fù)接觸許多液態(tài)有機溶劑可能造成皮膚損害,這可能是由于有機溶劑的去脂效果,另外還可能出現(xiàn)過敏和腐蝕癥狀。實驗室未按要求保存滿足日常使用量的化學(xué)品。大量的化學(xué)品未儲存在專門指定的房間或建筑物內(nèi)。相容化學(xué)品未分類存放。爆炸性化學(xué)品如疊氮化物,通常用作溶液中的抗菌劑,由于輕微碰撞就可能造成疊氮化銅的猛烈
39、爆炸。因此,疊氮化物不應(yīng)該與銅或鉛(如污水管以及管道設(shè)施)接觸。乙醚老化和干燥形成結(jié)晶后極不穩(wěn)定,可能會爆炸。高氯酸如果在木制品、磚砌或纖維性物質(zhì)上干燥時,一旦碰撞,會發(fā)生爆炸并引起火災(zāi)??辔端岷涂辔端猁}在加熱和撞擊時會發(fā)生爆炸?;瘜W(xué)品可能溢出造成人員傷害,未能及時獲得化學(xué)品溢出處理的示意圖和工具盒。(3) 輻射風(fēng)險。 本實驗室不涉及此類風(fēng)險。(4) 物理風(fēng)險。 本實驗不涉及此類風(fēng)險。2. 防護(hù)屏障的風(fēng)險(正常運行、錯誤使用、功能失常、清潔、維護(hù)和關(guān)停期間)(1) 生物安全柜。 如果沒有按照設(shè)備操作規(guī)程或使用說明書進(jìn)行操作、維護(hù),可能使生物安全柜的氣溶膠防護(hù)效果明顯降低或消失,失去安全防護(hù)效果。如果設(shè)備因長時間使用不能及時更換HEPA,則使用期內(nèi)的功能
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