免疫細(xì)胞的分離技術(shù)

1、免疫細(xì)胞的分離免疫細(xì)胞的分離2022-4-81免疫細(xì)胞的分離免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞v1、概念、概念 直接參與免疫應(yīng)答及與免疫應(yīng)答相關(guān)的所有細(xì)胞。直接參與免疫應(yīng)答及與免疫應(yīng)答相關(guān)的所有細(xì)胞。v2、分類(lèi)、分類(lèi) 單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)：?jiǎn)魏送淌杉?xì)胞系統(tǒng)：?jiǎn)魏思?xì)胞單核細(xì)胞 / / 巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞 樹(shù)突狀細(xì)胞（樹(shù)突狀細(xì)胞（DCsDCs) ) 淋巴細(xì)胞系統(tǒng)：淋巴細(xì)胞系統(tǒng)：T T 淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 （ThTh / / TcTc) ) B B 淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 NK NK 細(xì)胞細(xì)胞 粒細(xì)胞系統(tǒng)粒細(xì)胞系統(tǒng): : 中性粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞 噬酸性粒細(xì)胞噬酸性粒細(xì)胞 噬堿性粒細(xì)胞噬堿性粒細(xì)胞2022-4-82免疫細(xì)胞的分離免疫細(xì)

2、胞的分離免疫細(xì)胞的分離v人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離v淋巴細(xì)胞的分離淋巴細(xì)胞的分離v免疫細(xì)胞亞群的分離免疫細(xì)胞亞群的分離2022-4-83免疫細(xì)胞的分離細(xì)胞分離原理細(xì)胞分離原理v細(xì)胞的大小和比重細(xì)胞的大小和比重v細(xì)胞表面標(biāo)志細(xì)胞表面標(biāo)志v細(xì)胞黏附于各種物質(zhì)表面的特性細(xì)胞黏附于各種物質(zhì)表面的特性2022-4-84免疫細(xì)胞的分離 一、人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離一、人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 Ficoll分層離心法人外周血單個(gè)核細(xì)胞人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC): Monocyte、Lymphocyte。血液中各細(xì)

3、胞成分的比重不同，經(jīng)離心血液中各細(xì)胞成分的比重不同，經(jīng)離心沉淀，即可在分層液與血漿之間獲得比較純沉淀，即可在分層液與血漿之間獲得比較純的單個(gè)核細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞占的單個(gè)核細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞占90%以上。以上。 2022-4-85免疫細(xì)胞的分離不同細(xì)胞密度不同不同細(xì)胞密度不同 紅細(xì)胞和多形核白細(xì)胞紅細(xì)胞和多形核白細(xì)胞 1.092 單個(gè)核細(xì)胞單個(gè)核細(xì)胞 1.070 分層液分層液 1.0772022-4-86免疫細(xì)胞的分離一、人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離一、人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 Ficoll分層離心法Ficoll分層液：蔗糖聚合物+泛影葡胺，密度1.077+0.001g/L。2022-4-87免疫細(xì)

4、胞的分離二、淋巴細(xì)胞的分離二、淋巴細(xì)胞的分離v尼龍棉柱法尼龍棉柱法vE花環(huán)分離法花環(huán)分離法v補(bǔ)體細(xì)胞毒法免疫熒光補(bǔ)體細(xì)胞毒法免疫熒光法法 2022-4-88免疫細(xì)胞的分離二、淋巴細(xì)胞的分離二、淋巴細(xì)胞的分離 尼龍棉柱法尼龍棉柱法：B細(xì)胞和單核細(xì)胞具有細(xì)胞和單核細(xì)胞具有易黏附易黏附的特性，的特性，將淋巴細(xì)胞懸液加至尼龍纖維柱上，將淋巴細(xì)胞懸液加至尼龍纖維柱上，37 作作用用12h后，洗脫的為非黏附性的后，洗脫的為非黏附性的T細(xì)胞。細(xì)胞。2022-4-89免疫細(xì)胞的分離PBMC尼龍纖尼龍纖維棉柱維棉柱B細(xì)胞細(xì)胞單核細(xì)胞單核細(xì)胞T細(xì)胞細(xì)胞 二、淋巴細(xì)胞的分離二、淋巴細(xì)胞的分離 E花環(huán)分離法（純化花環(huán)

5、分離法（純化T細(xì)胞）細(xì)胞） 三、免疫細(xì)胞亞群的分離三、免疫細(xì)胞亞群的分離v免疫磁珠分離法免疫磁珠分離法v流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)2022-4-811免疫細(xì)胞的分離三、免疫細(xì)胞亞群的分離三、免疫細(xì)胞亞群的分離 免疫磁珠分離法免疫磁珠分離法將抗體交聯(lián)于磁珠表面形成免疫磁珠將抗體交聯(lián)于磁珠表面形成免疫磁珠 （Immunomagnetic bead，IMB），免疫磁），免疫磁珠直接或者間接偶聯(lián)在抗體上，從而與細(xì)胞珠直接或者間接偶聯(lián)在抗體上，從而與細(xì)胞相連，相連， 在高強(qiáng)度、梯度磁場(chǎng)中達(dá)到細(xì)胞磁性在高強(qiáng)度、梯度磁場(chǎng)中達(dá)到細(xì)胞磁性分離的目的。分離的目的。2022-4-812免疫細(xì)胞的分離 三、免疫細(xì)胞亞群的分

6、離三、免疫細(xì)胞亞群的分離 免疫磁珠分離法免疫磁珠分離法v1. 直接法： 抗細(xì)胞表面分子抗體+磁性微球 免疫磁珠免疫磁珠+細(xì)胞懸液 與免疫磁珠結(jié)合的細(xì)胞v2. 間接法： 第二抗體+磁性微粒 第一抗體+細(xì)胞 特定細(xì)胞免疫磁珠法分選裝置免疫磁珠法分選裝置三、免疫細(xì)胞亞群的分離三、免疫細(xì)胞亞群的分離 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）FCM將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細(xì)胞儀，對(duì)單個(gè)細(xì)胞的表面標(biāo)將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細(xì)胞儀，對(duì)單個(gè)細(xì)胞的表面標(biāo)志（抗原或受體）進(jìn)行快速、精確的分析和自動(dòng)檢測(cè)，并將志（抗原或受體）進(jìn)行快速、精確的分析和自動(dòng)檢測(cè)，并將不同類(lèi)型的細(xì)胞分選收集。不同類(lèi)型的細(xì)

7、胞分選收集。細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過(guò)高速流動(dòng)系統(tǒng)，細(xì)細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過(guò)高速流動(dòng)系統(tǒng)，細(xì)胞排成單行，逐個(gè)流經(jīng)檢測(cè)區(qū)。當(dāng)細(xì)胞從流動(dòng)室噴胞排成單行，逐個(gè)流經(jīng)檢測(cè)區(qū)。當(dāng)細(xì)胞從流動(dòng)室噴嘴處流出時(shí)，超聲震動(dòng)液流，使液流段裂成一連串嘴處流出時(shí)，超聲震動(dòng)液流，使液流段裂成一連串的均勻小滴，每個(gè)小滴內(nèi)最多含一個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)的均勻小滴，每個(gè)小滴內(nèi)最多含一個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)激光束照射產(chǎn)生熒光和散射光，由光電倍增管接收，激光束照射產(chǎn)生熒光和散射光，由光電倍增管接收，轉(zhuǎn)換成脈沖信號(hào)，數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理，分辨細(xì)胞類(lèi)型。轉(zhuǎn)換成脈沖信號(hào)，數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理，分辨細(xì)胞類(lèi)型。2022-4-817免疫細(xì)胞的分離流式細(xì)胞儀工作原理流式細(xì)胞儀工作原理2022-4-818免疫細(xì)胞的分離流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀2022-4-819免疫細(xì)胞的分離免疫細(xì)胞的分離免疫細(xì)胞的分離v人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離Ficoll分層離分層離 心法心法v淋巴細(xì)胞的分離淋巴細(xì)