第5章-胞外產(chǎn)電菌

1、LOGO第五章第五章 胞外產(chǎn)電菌胞外產(chǎn)電菌 李永峰李永峰 教授教授第五章第五章 胞外產(chǎn)電菌胞外產(chǎn)電菌5.1 簡介簡介15.2 電子轉(zhuǎn)移的機(jī)制電子轉(zhuǎn)移的機(jī)制25.3 細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理特點(diǎn)細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理特點(diǎn)35.4 群落分析群落分析45.5 將將MFC作為工具研究胞外產(chǎn)電菌作為工具研究胞外產(chǎn)電菌55.6 微生物馴化與鑒定微生物馴化與鑒定65.7微生物電解池產(chǎn)氫與傳統(tǒng)產(chǎn)氫方法的比較微生物電解池產(chǎn)氫與傳統(tǒng)產(chǎn)氫方法的比較75.1 簡介簡介 對(duì)對(duì)MFC而言，最令我們感興趣的而言，最令我們感興趣的是一些細(xì)菌能向細(xì)胞外傳遞電子，我們是一些細(xì)菌能向細(xì)胞外傳遞電子，我們把這些細(xì)菌叫做向細(xì)胞外直接轉(zhuǎn)移電子

2、把這些細(xì)菌叫做向細(xì)胞外直接轉(zhuǎn)移電子的產(chǎn)電菌（的產(chǎn)電菌（exoelectrogens），以下簡稱），以下簡稱“胞外產(chǎn)電菌胞外產(chǎn)電菌”?！癳xo-”表示胞外的，表示胞外的，且具有能將電子直接轉(zhuǎn)化給化合物或間且具有能將電子直接轉(zhuǎn)化給化合物或間接電子受體的能力。接電子受體的能力。5.2 電子轉(zhuǎn)移的機(jī)制電子轉(zhuǎn)移的機(jī)制5.2.1 納米導(dǎo)線納米導(dǎo)線細(xì)胞細(xì)胞-表面的電子傳遞表面的電子傳遞5.2.3 中介體中介體5.2.1納米導(dǎo)線納米導(dǎo)線 Gorgy及其同事發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了及其同事發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了Geobacter和和Shewanella菌屬的導(dǎo)電附菌屬的導(dǎo)電附屬物，他們將其稱為細(xì)菌的屬物，他們將其稱為細(xì)菌的“納米導(dǎo)納

3、米導(dǎo)線線”。使用傳導(dǎo)隧道顯微鏡（。使用傳導(dǎo)隧道顯微鏡（STM），），將樣品放在一個(gè)高度規(guī)則的熱解石墨表將樣品放在一個(gè)高度規(guī)則的熱解石墨表面（一個(gè)非常平的導(dǎo)電表面），在恒定面（一個(gè)非常平的導(dǎo)電表面），在恒定電流成像的條件下，使用一個(gè)導(dǎo)電的電流成像的條件下，使用一個(gè)導(dǎo)電的（Pt-Ir）尖端橫跨樣品進(jìn)行光柵掃描，）尖端橫跨樣品進(jìn)行光柵掃描，從而檢測(cè)附屬物的電導(dǎo)率。最終獲得的從而檢測(cè)附屬物的電導(dǎo)率。最終獲得的電壓電壓-電流曲線顯示出掃描的部分與石電流曲線顯示出掃描的部分與石墨表面之間具有導(dǎo)電性。墨表面之間具有導(dǎo)電性。5.2.2 細(xì)胞細(xì)胞-表面的電子傳遞表面的電子傳遞 納米導(dǎo)線的存在并不意味著電子只納米

4、導(dǎo)線的存在并不意味著電子只能通過納米線轉(zhuǎn)移，細(xì)菌也可以在沒有能通過納米線轉(zhuǎn)移，細(xì)菌也可以在沒有納米導(dǎo)線生成的時(shí)候?qū)崿F(xiàn)電子從細(xì)胞表納米導(dǎo)線生成的時(shí)候?qū)崿F(xiàn)電子從細(xì)胞表面到鐵或陽極的轉(zhuǎn)移。面到鐵或陽極的轉(zhuǎn)移。5.2.3 中介體中介體 化學(xué)中介體或電子中介體（化學(xué)中介體或電子中介體（shutle）經(jīng)常被加入到經(jīng)常被加入到MFC中，從而使細(xì)菌甚中，從而使細(xì)菌甚至酵母能傳遞電子。至酵母能傳遞電子。Rabaey和他的合和他的合作者發(fā)現(xiàn)，在作者發(fā)現(xiàn)，在MFC的培養(yǎng)基中電子中的培養(yǎng)基中電子中介體并不是必需的。這些自身產(chǎn)生的相介體并不是必需的。這些自身產(chǎn)生的相關(guān)化合物，可以將電子轉(zhuǎn)移到電極上，關(guān)化合物，可以將電子

5、轉(zhuǎn)移到電極上，從而在從而在MFC中產(chǎn)生電能。中產(chǎn)生電能。5.3 細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理特點(diǎn)細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理特點(diǎn)5.3.1 產(chǎn)電微生物的定義產(chǎn)電微生物的定義15.3.2產(chǎn)電微生物的類別產(chǎn)電微生物的類別25.3.3 MFC產(chǎn)電微生物的研究進(jìn)展產(chǎn)電微生物的研究進(jìn)展35.3.4微生物群落分析微生物群落分析45.3.5 MFC 產(chǎn)電微生物的電子傳遞機(jī)制產(chǎn)電微生物的電子傳遞機(jī)制55.3.6電池的電化學(xué)性能表征電池的電化學(xué)性能表征65.3.7陽極微生物的形態(tài)及電化學(xué)活性表征陽極微生物的形態(tài)及電化學(xué)活性表征75.3.1 產(chǎn)電微生物的定義產(chǎn)電微生物的定義產(chǎn)電微生物特指把有機(jī)物氧化過程中產(chǎn)生的電子通過電子傳遞鏈

6、產(chǎn)電微生物特指把有機(jī)物氧化過程中產(chǎn)生的電子通過電子傳遞鏈傳遞到電極上產(chǎn)生電流，同時(shí)自身在電子傳遞過程中獲得能量支持傳遞到電極上產(chǎn)生電流，同時(shí)自身在電子傳遞過程中獲得能量支持菌類的生長，又稱為電活性微生物或電極呼吸微生物。菌類的生長，又稱為電活性微生物或電極呼吸微生物。表表 5 5.1 MFC 在產(chǎn)電過程中不同類型微生物的比較在產(chǎn)電過程中不同類型微生物的比較微生物種類微生物種類庫倫效率（庫倫效率（%）是否獨(dú)立存活是否獨(dú)立存活是否需要外源性介是否需要外源性介體體是否用于開放環(huán)境是否用于開放環(huán)境發(fā)酵微生物發(fā)酵微生物10否否否否是是包含外源性介體的包含外源性介體的微生物微生物10否否是是否否Shewa

7、nella 屬屬90是是否否是是5.3.2 產(chǎn)電微生物的類別產(chǎn)電微生物的類別1希 瓦 氏 菌2鐵還原紅育菌3硫還原地桿菌4沼澤紅假單胞菌5人蒼白桿菌6銅綠假單胞菌7丁酸梭菌8其他產(chǎn)電菌種5.3.3 MFC產(chǎn)電微生物的研究進(jìn)展產(chǎn)電微生物的研究進(jìn)展234細(xì)細(xì)菌菌類類的的產(chǎn)產(chǎn)電電微微生生物物真真菌菌類類的的產(chǎn)產(chǎn)電電微微生生物物光光合合生生物物類類的的產(chǎn)產(chǎn)電電微微生生物物微微生生物物群群落落作作產(chǎn)產(chǎn)電電微微生生物物5.3.4 微生物群落分析微生物群落分析(1) 165rRNA基因文庫的構(gòu)建和分析方法基因文庫的構(gòu)建和分析方法 采用小量細(xì)菌采用小量細(xì)菌DNADNA抽提試劑盒從電極提取基因組抽提試劑盒從電極

8、提取基因組DNADNA。(2) 變性梯度凝膠電泳變性梯度凝膠電泳(DGGE) 采用采用BSF338/BSR534引物進(jìn)行引物進(jìn)行DGGE-PCR圖譜的電泳。圖譜的電泳。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5.3.5 MFC 產(chǎn)電微生物的電子傳遞機(jī)制產(chǎn)電微生物的電子傳遞機(jī)制據(jù)研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)電微生物向陽極傳遞電子分據(jù)研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)電微生物向陽極傳遞電子分2 步走，第步走，第1 步是電子在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生并向細(xì)胞表面?zhèn)鬟f；第步是電子在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生并向細(xì)胞表面?zhèn)鬟f；第2 步是電步是電子到達(dá)細(xì)胞表面后向子到達(dá)細(xì)胞表面后向MFC 陽極傳遞。陽極傳遞。（1） 由細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞表面的電子傳遞由細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞表面的電子傳遞一些產(chǎn)電微生物可依靠其膜上的脫

9、氫酶直接氧化小分子的有一些產(chǎn)電微生物可依靠其膜上的脫氫酶直接氧化小分子的有機(jī)酸，釋放電子給細(xì)胞膜上的電子載體，另一些產(chǎn)電微生機(jī)酸，釋放電子給細(xì)胞膜上的電子載體，另一些產(chǎn)電微生物可氧化糖類等稍微復(fù)雜的有機(jī)物生成物可氧化糖類等稍微復(fù)雜的有機(jī)物生成NADH，然后在，然后在NADH脫氫酶的作用下，電子從脫氫酶的作用下，電子從NADH 轉(zhuǎn)移至電子傳遞轉(zhuǎn)移至電子傳遞鏈，到達(dá)細(xì)胞表面的氧化還原蛋白。鏈，到達(dá)細(xì)胞表面的氧化還原蛋白。（2） 由細(xì)胞表面向由細(xì)胞表面向MFC 陽極的電子傳遞陽極的電子傳遞產(chǎn)電微生物在細(xì)胞內(nèi)氧化有機(jī)物產(chǎn)生的電子被傳遞至細(xì)胞表產(chǎn)電微生物在細(xì)胞內(nèi)氧化有機(jī)物產(chǎn)生的電子被傳遞至細(xì)胞表面后，被

10、證實(shí)將會(huì)通過面后，被證實(shí)將會(huì)通過2 種傳遞機(jī)制將電子傳遞到種傳遞機(jī)制將電子傳遞到MFC陽極上，陽極上，1 種是電子穿梭機(jī)制；種是電子穿梭機(jī)制；1 種是生物膜機(jī)制。種是生物膜機(jī)制。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5.3.6電池的電化學(xué)性能表征電池的電化學(xué)性能表征在每個(gè)在每個(gè)MFC上串聯(lián)一個(gè)上串聯(lián)一個(gè)1 k電阻，電阻電電阻，電阻電壓采用萬用表測(cè)量，電路電流根據(jù)電阻電壓計(jì)算壓采用萬用表測(cè)量，電路電流根據(jù)電阻電壓計(jì)算得到，并換算成基于得到，并換算成基于MFC陽極面積陽極面積(45 cm2)的的電流密度。電池輸出功率密度由輸入電壓及電流電流密度。電池輸出功率密度由輸入電壓及電流密度相乘得到。監(jiān)測(cè)陽極電勢(shì)時(shí)，參比電極是密度

11、相乘得到。監(jiān)測(cè)陽極電勢(shì)時(shí)，參比電極是AgCl/Ag電極，對(duì)電極采用電極，對(duì)電極采用R電極。極化曲線實(shí)電極。極化曲線實(shí)驗(yàn)在每次刺激后驗(yàn)在每次刺激后2h進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過程中分別連接進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過程中分別連接10至至10000的一系列負(fù)載電阻，每個(gè)電阻的一系列負(fù)載電阻，每個(gè)電阻下穩(wěn)定下穩(wěn)定lh后測(cè)量電流及電阻電壓。在測(cè)量開路電后測(cè)量電流及電阻電壓。在測(cè)量開路電壓之前，電路保持開路壓之前，電路保持開路12h以達(dá)到穩(wěn)態(tài)。以達(dá)到穩(wěn)態(tài)。5.3.7 陽極微生物的形態(tài)及電化學(xué)活性表征陽極微生物的形態(tài)及電化學(xué)活性表征1表征陽極生物膜的循環(huán)伏安曲線在 CHI 660電化學(xué)工作站上得到。在循環(huán)伏安測(cè)量過程中分別采用雙電極和

12、三電極體系。2電化學(xué)石英晶體微天平(EQCM)系統(tǒng)用來模擬微生物在電場(chǎng)中的電泳。3MFC陽極生物膜上的微生物形態(tài)采用日本 SHIMAQZU SSX-550掃描電鏡(SEM)表征。5.4 群落分析群落分析5.4.1陰極室利用氧氣的陰極室利用氧氣的MFC15.4.2除氧氣外的其他電子受體除氧氣外的其他電子受體MFC25.4.3沉積物沉積物MFC35.4.4高溫高溫MFC45.4.1陰極室利用氧氣的陰極室利用氧氣的MFC以氧氣為陰極電子受體的不同以氧氣為陰極電子受體的不同MFC中的微生物群落分析中的微生物群落分析接 種 體底 物群 落江底沉積物（Phung等2004）葡萄糖+谷氨酸Alpha 占65

13、%（主要是Actinobacteria），Beta 占21%，Gammaproteobacteria占3%，Bacteroidetes占8%，其他占3%江底沉積物（Phung等2004）江水Alpha 占11%，Beta 占46%（與Leptothrix spp.相關(guān)），Gamma 占13%，Deltaprotebacteria占13%，Bacteroidetes占9%，其他占8%海底沉積物（Logan等2005）半胱氨酸Gammaproteobacteria（40%Shewanella affinis KMM），然后是Vibrio spp. 和Pseudoalteromonas spp.廢水

14、（Lee等2003）乙酸Alpha占24%，Beta占7%，Gamma占21%，Deltaproteobacteria占21%，其他占27%廢水（Kim等2004；Methe等2003）淀粉未鑒定的細(xì)菌占36%，Beta占25%，Alphaproteobacteria占20%，Cytophaga、Flexibacter、Bacterioides共占19%5.4.1陰極室利用氧氣的陰極室利用氧氣的MFCv 我們需要逐一比較我們需要逐一比較MFC的構(gòu)型（如沉的構(gòu)型（如沉積物、非沉積物、氧氣、鐵氰化鉀和恒電位積物、非沉積物、氧氣、鐵氰化鉀和恒電位MFC），底物和接種物（沉積物、江水和），底物和接種物

15、（沉積物、江水和廢水細(xì)菌），從而更好地理解控制了廢水細(xì)菌），從而更好地理解控制了MFC系統(tǒng)中生物群落的進(jìn)化的因素。系統(tǒng)中生物群落的進(jìn)化的因素。5.4.2除氧氣外的其他電子受體除氧氣外的其他電子受體MFCv 在以葡萄糖為底物、用鐵氰化鉀作陰極在以葡萄糖為底物、用鐵氰化鉀作陰極的的MFC中，中，Rabaey等應(yīng)用變性梯度凝膠等應(yīng)用變性梯度凝膠電泳（電泳（DGGE）技術(shù)，鑒定了生物膜中大量）技術(shù)，鑒定了生物膜中大量細(xì)菌的菌屬。鑒定的序列分屬于細(xì)菌的菌屬。鑒定的序列分屬于Firmicutes、Gamma 和和Alphaproteobacteria。5.4.3 沉積物沉積物MFCv 雖然沉積物雖然沉積物

16、MFC（SMFC）的陰極存在）的陰極存在氧氣，但此系統(tǒng)與其他氧氣，但此系統(tǒng)與其他MFC的根本區(qū)別在的根本區(qū)別在于樣機(jī)上的細(xì)菌是與氧氣完全隔絕的。于樣機(jī)上的細(xì)菌是與氧氣完全隔絕的。5.4.4 高溫高溫MFCv 少數(shù)研究者考察了正常實(shí)驗(yàn)室溫度范圍少數(shù)研究者考察了正常實(shí)驗(yàn)室溫度范圍之外的之外的MFC產(chǎn)電情況（溫度達(dá)到產(chǎn)電情況（溫度達(dá)到36）。）。Choi等在一個(gè)等在一個(gè)MFC系統(tǒng)中檢測(cè)出了兩株嗜系統(tǒng)中檢測(cè)出了兩株嗜熱菌株（熱菌株（Bacillus licheniformis和和B.thermoglucosidasius）。但是，其）。但是，其能量產(chǎn)生需要用到中介體，所以在這個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)芰慨a(chǎn)生需要用到中介

17、體，所以在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用的菌株不屬于胞外產(chǎn)電菌。高溫下的中使用的菌株不屬于胞外產(chǎn)電菌。高溫下的一個(gè)問題是氧氣的溶解度會(huì)隨著溫度的升高一個(gè)問題是氧氣的溶解度會(huì)隨著溫度的升高而降低。而降低。5.5 將將MFC作為工具研究胞外產(chǎn)電菌作為工具研究胞外產(chǎn)電菌v 雖然研究雖然研究MFC的主要目的是產(chǎn)電，但的主要目的是產(chǎn)電，但同時(shí)同時(shí)MFC也為科學(xué)家提供了一個(gè)研究胞外也為科學(xué)家提供了一個(gè)研究胞外產(chǎn)電菌生態(tài)系統(tǒng)的有趣的新平臺(tái)。當(dāng)細(xì)菌降產(chǎn)電菌生態(tài)系統(tǒng)的有趣的新平臺(tái)。當(dāng)細(xì)菌降解不溶性金屬時(shí)，其表面特征隨時(shí)間而變化，解不溶性金屬時(shí)，其表面特征隨時(shí)間而變化，同時(shí)，因?yàn)榻饘匐x子的氧化同時(shí)，因?yàn)榻饘匐x子的氧化/還原相對(duì)濃

18、度還原相對(duì)濃度比例隨時(shí)間的變化而變化導(dǎo)致了溶液化學(xué)性比例隨時(shí)間的變化而變化導(dǎo)致了溶液化學(xué)性質(zhì)變得更加復(fù)雜。然而在質(zhì)變得更加復(fù)雜。然而在MFC中電極是不中電極是不會(huì)被腐蝕的，允許生物膜在其上生長并成熟。會(huì)被腐蝕的，允許生物膜在其上生長并成熟。5.6 微生物馴化與鑒定微生物馴化與鑒定5.6.15.6.25.6.35.6.4培養(yǎng)液培養(yǎng)液COD負(fù)負(fù)荷及外電荷及外電路電流對(duì)路電流對(duì)馴化的影馴化的影響響電極材料電極材料對(duì)電池性對(duì)電池性能的影響能的影響外電路不外電路不同負(fù)載對(duì)同負(fù)載對(duì)電池性能電池性能的影響的影響微生物分微生物分離純化及離純化及鑒定鑒定混合微生混合微生物菌群的物菌群的馴化及群馴化及群落分析落分

19、析5.6.55.6.1培養(yǎng)液培養(yǎng)液COD負(fù)荷及外電路電流對(duì)馴化的影響負(fù)荷及外電路電流對(duì)馴化的影響 活性污泥在新的培養(yǎng)體系下很難承受過大COD負(fù)荷的沖擊，從而導(dǎo)致其微生物細(xì)菌代謝發(fā)生異常，抑制細(xì)菌代謝的正常進(jìn)行，使產(chǎn)電菌部分失活。 不同COD負(fù)荷對(duì)電池性能的影響5.6.1培養(yǎng)液培養(yǎng)液COD負(fù)荷及外電路電流對(duì)馴化的影響負(fù)荷及外電路電流對(duì)馴化的影響 在初始階段分別采用恒電流放電和恒電阻放電進(jìn)行活性污泥的馴化，分別得到可兩組電池性能指標(biāo) 外電路電流對(duì)電池性能的影響5.6.2電極材料對(duì)電池性能的影響電極材料對(duì)電池性能的影響 以20% PTFE石墨膜為陽極材料所組裝的電池在開路條件下陽極電勢(shì)最負(fù)，且穩(wěn)定時(shí)

20、間最長恒阻放電時(shí)其陽極電勢(shì)也為最負(fù)，并且此時(shí)外電路電流最大，陽極極化較小，所以其陽極性能最好。 電極材料對(duì)電池性能的影響5.6.3外電路不同負(fù)載對(duì)電池性能的影響外電路不同負(fù)載對(duì)電池性能的影響 馴化到出現(xiàn)明顯放電現(xiàn)象過程中，負(fù)載不同電阻的陽極電勢(shì)變化。 馴化階段不同負(fù)載的陽極電勢(shì)不同負(fù)載下電池的能量密度隨電流變化的關(guān)系圖5.6.4微生物分離純化及鑒定微生物分離純化及鑒定 厭氧操作箱示意圖液體厭氧培養(yǎng)用到的主要工具5.6.4微生物分離純化及鑒定微生物分離純化及鑒定 固體厭氧培養(yǎng)裝置 單菌落形態(tài)特征5.6.5 混合微生物菌群的馴化及群落分析混合微生物菌群的馴化及群落分析v近年來的研究結(jié)果表明，直接用來自天近年來的研究結(jié)果表明，直接用來自天然厭氧環(huán)境的混合菌接種然厭氧環(huán)境的混合菌接種MFC，可以使電，可以使電流輸出成倍增加，且在