實(shí)驗(yàn)一培養(yǎng)基的配制及滅菌

1、實(shí)驗(yàn)一培養(yǎng)基的配制及滅菌培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。各類(lèi)微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不盡相同，因而培養(yǎng)基的種類(lèi)繁多。在這些培養(yǎng)基中，就營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而言，一般不外乎碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子及水等幾大類(lèi)。培養(yǎng)基的配制，一是要求在營(yíng)養(yǎng)成分上能滿(mǎn)足所培養(yǎng)微生物生長(zhǎng)發(fā)育的需要，二是培養(yǎng)基在使用前不帶菌，三是以滅菌后和保存過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分不發(fā)生變化。培養(yǎng)基的滅菌通常在培養(yǎng)基配制后進(jìn)行，其目的是殺滅培養(yǎng)基中殘存的微生物或活的生物殘?bào)w，保證培養(yǎng)基在貯存過(guò)程中不變質(zhì)，也防止其他生物對(duì)培養(yǎng)的污染。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1掌握實(shí)驗(yàn)室常用玻璃器皿的清洗

2、、干燥和包扎方法。2明確培養(yǎng)基的配制原理。?3掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。4了解濕熱和干熱滅菌的原理，并掌握有關(guān)的操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理滅菌是指殺滅物體中所有微生物的繁殖體和芽孢的過(guò)程。消毒是指用物理、化學(xué)或生物的方法殺死病原微生物的過(guò)程。滅菌的原理就是使蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子發(fā)生變性，從而達(dá)到滅菌的作用，實(shí)驗(yàn)室中最常用的就是干熱滅菌和濕熱滅菌。干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固緩慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（16017

3、0C），時(shí)間長(zhǎng)（12h）。但干熱滅菌溫度不能超過(guò)？180C。否則，包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引起燃燒。高壓蒸氣滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過(guò)加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸氣。待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100C的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大，三是濕熱的蒸氣有潛熱存在。這種潛熱，能迅

4、速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，用以提供微生物生長(zhǎng)發(fā)育所需的物質(zhì)條件。培養(yǎng)細(xì)菌常用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)放線(xiàn)菌常用高氏？1?號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)霉菌常用蔡氏培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA,培養(yǎng)酵母菌常用麥芽汁培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA。根據(jù)培養(yǎng)目的不同，可分為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；此外，還有加富、選擇、鑒別等培養(yǎng)基之分。就培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而言，一般不外乎碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子及水等幾大類(lèi)。瓊脂（Agar）只是固體培養(yǎng)基的支持物，一般不為微生物所利用。它在？高溫下熔化成液體，而在？45C左右開(kāi)始

5、凝固成固體。在配制培養(yǎng)基時(shí)，根據(jù)各類(lèi)微生物的特點(diǎn)，就可以配制出適合不同種類(lèi)微生物生長(zhǎng)發(fā)育所需要的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基除了滿(mǎn)足微生物所必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還要求有一定的酸堿度和滲透壓。霉菌和酵母菌的？pH?偏酸；細(xì)菌、放線(xiàn)菌的？pH為微堿性。所以每次配制培養(yǎng)基時(shí)，都要將培養(yǎng)基的？pH值調(diào)到一定的范圍。常用微生物培養(yǎng)基的配方如下：LB培養(yǎng)基配方（pH7.0）:胰蛋白胨（Tryptone）10.0g酵母提取物（Yeastextract）5.0g氯化鈉（NaCl）10.0g瓊脂粉（Agar）?20.0g搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解，用5mol/LNaOH調(diào)pH至7.0，用去離子水定容至1L，在O.IMPa壓力下滅菌20

6、min。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方（pH?7.0）：牛肉膏?3.0g?胰蛋白胨（Tryptone）10.0g?NaCl5.0g?瓊脂粉（Agar）?20.0g去離子水?1000mL?高氏？1號(hào)培養(yǎng)基配方（pH）:可溶性淀粉?20.0g?NaCl?0.5g?KNO3?1.0g?K2HPO4?3H2O?0.5g?MgSO4?7H2O?0.5g?FeSO4?7H2O?0.01g?瓊脂粉（Agar）去離子水20.0g?1000mL?馬鈴薯培養(yǎng)基配方（自然?pH）：馬鈴薯（去皮）?200.0g?葡萄糖（或蔗糖）（Dextroseorglucose）20.0g?瓊脂粉（Agar）20.0g?去離子水1000m

7、L?察氏培養(yǎng)基配方（自然?pH）：蔗糖(glucose)?30.0g?NaNO3?2.0g?K2HPO4?1.0g?KCl?0.5g?MgSO4?7H2O?0.5g?FeSO4?7H2O?0.01g?瓊脂粉（Agar）20.0g?去離子水?1000mL?YPD培養(yǎng)基配方（pH7.0）:酵母提取物（Yeastextract）10.0g蛋白胨（Peptone）20.0g葡萄糖或蔗糖（Dextroseorglucose）20.0g瓊脂粉（Agar）?20.0g去離子水?1000mL?在O.IMPa壓力下滅菌20min。三、實(shí)驗(yàn)材料牛肉膏蛋白胨、高氏？1號(hào)、LB、PDAYPD察氏等各種培養(yǎng)基。四、儀器

8、設(shè)備及用具1. 90mm培養(yǎng)皿、吸管、試管、三角瓶、試管刷、硅膠塞、棉花、牛皮紙或報(bào)紙、包扎繩、去污粉、洗滌劑、燒杯、量筒、玻棒、牛角匙、pH?式紙（pH?5.59.0）、記號(hào)筆、麻繩、紗布等；2. 培養(yǎng)基分裝器、天平、電磁爐、微波爐、電爐、石棉網(wǎng)、電熱鼓風(fēng)干燥箱、立式高壓蒸汽滅菌鍋五、試劑無(wú)水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、馬鈴薯、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白胨（Peptone）、胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeastextract）、NaCI、瓊脂粉、5mol/LNaOH、1mol/LHCI、KNQK2HPO73HOMgSC?7IHOFeSO?7HO等。六、實(shí)驗(yàn)步驟1洗滌用試管刷蘸取少量去污

9、粉反復(fù)刷洗器皿23次；用自來(lái)水沖洗23次；用少量去離子水蕩洗12次，控干水分。注意事項(xiàng)： 不能用有腐蝕作用的化學(xué)試劑，也不能使用比玻璃硬度大的物品來(lái)擦拭玻璃器皿；新的玻璃器皿應(yīng)用2%的鹽酸溶液浸泡數(shù)小時(shí)，用水充分洗干凈。 用過(guò)的器皿應(yīng)立即洗滌。 強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、瓊脂等能腐蝕、阻塞管道的物質(zhì)不能直接倒在洗滌槽內(nèi)，必須到在廢物缸內(nèi)。 洗滌后的器皿應(yīng)達(dá)到玻璃壁能被水均勻濕潤(rùn)而無(wú)條紋和水珠。2器皿包扎（1）培養(yǎng)皿：洗凈的培養(yǎng)皿烘干后每5套（或根據(jù)需要而定）疊在一起，用牢固的紙卷成一筒，或裝入特制的不銹鋼桶中，然后進(jìn)行滅菌。（2）吸管：洗凈，烘干后的吸管，在吸口的一頭塞入少許脫脂棉花，以防在使用時(shí)造成污染。

10、塞入的棉花量要適宜，多余的棉花可用酒精燈火焰燒掉。每支吸管用一條寬約45cm的紙條，以3050C的角度螺旋形卷起來(lái)，吸管的尖端在頭部，另一端用剩余的紙條打成一結(jié)，以防散開(kāi)，標(biāo)上容量，若干支吸管包扎成一束進(jìn)行滅菌，使用時(shí)，從吸管中間擰斷紙條，抽出吸管。（3）試管和三角瓶：試管和三角瓶都需要做合適的棉塞，棉塞可起過(guò)濾作用，避免空氣中的微生物進(jìn)入容器。制作棉塞時(shí)，要求棉花緊貼玻璃壁，沒(méi)有皺紋和縫隙，松緊適宜。過(guò)緊易擠破管口和不易塞入；過(guò)松易掉落和污染。棉塞的長(zhǎng)度不小于管口直徑的2倍，約2/3塞進(jìn)管口。若干支試管用繩扎在一起，在棉花部分外包裹油紙或牛皮紙，再用繩扎緊。三角瓶加棉塞后單個(gè)用報(bào)紙包扎。3烘

11、干洗凈的儀器控去水分，放在烘箱內(nèi)烘干，烘箱溫度為105110C烘1小時(shí)左右。此法適用于一般儀器。對(duì)于急于干燥的儀器或不適于放入烘箱的較大的儀器可用吹干的辦法。通常用少量乙醇、丙酮（或最后再用乙醚）倒入已控去水分的儀器中搖洗，然后用電吹風(fēng)機(jī)吹至完全干燥。不急等用的儀器，可在蒸餾水沖洗后在無(wú)塵處倒置處控去水分，然后自然干燥?？捎冒灿心踞?shù)募茏踊驇в型笟饪椎牟ＡЧ穹胖脙x器。4培養(yǎng)基的配置（1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基A、稱(chēng)量按培養(yǎng)基配方比例依次推確地稱(chēng)取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放入燒杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱(chēng)量，用熱水溶化后倒入燒杯，也可按在稱(chēng)量紙上，稱(chēng)量后直接放入水中，這時(shí)如稍微加

12、熱，牛肉膏便會(huì)與稱(chēng)量紙分離，然后立即取出紙片。蛋白胨很易吸濕，在稱(chēng)取時(shí)動(dòng)作要迅速。另外，稱(chēng)藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱(chēng)取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱(chēng)取另一藥品。瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。?B、融化在上述燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。將藥品完全溶解后，補(bǔ)充水到所需的總體積，如果配制固體培養(yǎng)基時(shí)，將稱(chēng)好的瓊脂放入己溶的藥品中，再加熱溶化，最后補(bǔ)足所損失的水分。C、調(diào)節(jié)？pH?在未調(diào)?pH前，先用精密？pH試紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始pH,如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入？1mol/LNaOH邊加邊攪拌，并隨時(shí)用？pH試紙測(cè)其？pH,直至?pH達(dá)？7.6

13、。反之，用？1mol/LHCL?進(jìn)行調(diào)節(jié)。對(duì)于有些要求？pH較精確的微生物，其？pH的調(diào)節(jié)可用酸度計(jì)進(jìn)行。？pH?不要調(diào)過(guò)頭，以避免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。配制？pH低的瓊脂培養(yǎng)基時(shí)，若預(yù)先調(diào)好？pH?并在高壓蒸氣下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固。？D過(guò)濾趁熱用濾紙或多層紗布過(guò)濾，以利某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。一般無(wú)特殊要求的情況下可以省去（本實(shí)驗(yàn)勿需過(guò)濾）。?E、分裝按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝人試管內(nèi)或三角燒瓶?jī)?nèi)（見(jiàn)圖3-1）。a液體分裝：分裝高度以試管高度的?l/4?左右為宜。分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，一般以不超過(guò)三角瓶容積的一半為宜，如果是用于振蕩培養(yǎng)用，則根據(jù)通氣量的要求酌情減

14、?A?漏斗分裝裝置；B?自動(dòng)分裝裝置1?鐵架；2?漏斗；3孔膠管；4彈簧夾；5玻璃；6流速調(diào)節(jié)；7?裝量調(diào)節(jié)；8開(kāi)關(guān)少；有的液體培養(yǎng)基在滅菌后，需要補(bǔ)加一定量的其他無(wú)菌成分，如抗生素等，則裝量一定要準(zhǔn)確。?b固體分裝：分裝試管，其裝量不超過(guò)管高的?1/5，滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超過(guò)三角燒瓶容積的一半為宜。?c半固體分裝：試管一般以試管高度的?1/3為宜，滅菌后垂直待凝。在分裝過(guò)程中，應(yīng)注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。?F、加塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角烷瓶口上塞上棉塞（或硅膠塞及試管帽等），棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基，防止由此而

15、引起的污染；另一方面保證有良好的通氣性能，使培養(yǎng)在里面的微生物能夠從外界源源不斷地獲得新鮮無(wú)菌空氣。因此棉塞質(zhì)量的好壞對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有著很大的影響。一只好的棉塞，外形應(yīng)象一只蘑菇，大小、松緊都應(yīng)適當(dāng)（見(jiàn)圖3-2）。加塞時(shí)的棉塞的總長(zhǎng)度的?3/5應(yīng)在口內(nèi)，2/5在口外。圖1-2?棉塞的制作G包扎加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱(chēng)、組別、配制日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時(shí)容易解開(kāi)，同樣用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱(chēng)、組別、配制日期。（2）高氏I號(hào)培養(yǎng)基配制方法?A、稱(chēng)量和溶化：按配方先

16、稱(chēng)取可溶性淀粉、放入小燒杯中，并用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶化。然后再稱(chēng)取其他各成分依次逐一溶化。對(duì)微量成分？FeSOP7H20?可先配成高濃度的貯備液按比例換算后再加入，方法是先在？100mL水中加入?1g?的？FeSO?7H2O配成？0.01g/mL，再在？1000mL培養(yǎng)基中加?1mL的?0.0lg/mL的貯備液即可。待所有藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。如要配制固體培養(yǎng)基，其溶化過(guò)程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制方法。?B、調(diào)pH分裝、包扎：滅菌及無(wú)菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制方法。（3）LB培養(yǎng)基配制方法準(zhǔn)確稱(chēng)量胰蛋白胨（Tr

17、yptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，氯化鈉（NaCI）10g放入一燒杯中，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解，加入1520g瓊脂粉，用5mol/LNaOH調(diào)pH至7.0，用去離子水定容至1L,分裝，O.IMPa滅菌？20?min。（4）馬鈴薯培養(yǎng)基配制（PDA）取去皮馬鈴薯？200g,切成小塊，放入？1500mL的燒杯中煮沸？30min,注意用玻棒攪拌以防糊底。然后用雙層紗布過(guò)濾，取濾液加糖（酵母菌用葡萄糖，霉菌用蔗糖），加熱煮沸后加入瓊脂，繼續(xù)加熱融化并補(bǔ)足失水。再按前所述，進(jìn)行分裝、加塞、包扎、0.1MPa滅菌?20?min。?（5）察氏培養(yǎng)基配制方法同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配

18、制。（6）YPD培養(yǎng)基配制方法同LB培養(yǎng)基配制。5. 滅菌?（1）高壓蒸氣滅菌A、首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的去離子水，使水面與三角擱架相平為宜。?B、放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品（各種玻璃器皿、培養(yǎng)基等）。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸氣流通而影響滅菌效果，三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透人棉塞。C、加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)。再以?xún)蓛蓪?duì)稱(chēng)的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺拴，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。?D通電加熱，并同時(shí)打開(kāi)排氣閥，使水沸騰5min,以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上徘氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸氣壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所得壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。E滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”時(shí)，打開(kāi)排氣閥，旋松螺栓，打開(kāi)蓋子，取出滅菌物品。（2）干熱滅菌A、裝入待滅菌物品將包好的待滅菌物品（培養(yǎng)皿、試管、吸管等）放入電烘箱內(nèi)，關(guān)好箱門(mén)。?B、升溫接通電源，撥動(dòng)開(kāi)關(guān)，打開(kāi)電烘箱排氣孔，旋動(dòng)恒溫調(diào)節(jié)器至綠燈亮，