乙肝兩對半定性測定課件

1、關(guān)于乙肝兩對半定性測定現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第1頁，共31頁HBV是乙型病毒性肝炎的病原體。HBV感染呈世界性流行，但不同地區(qū)感染的流行程度差異很大。據(jù)WHO報道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。我國屬高流行地區(qū)一般地區(qū)HBsAg陽性率為7.18%。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第2頁，共31頁乙肝病毒血清標(biāo)志物HBsAgn第一個出現(xiàn)，感染后1-2周即可陽性n陽性表示存在HBV感染HBsAbn出現(xiàn)在HBsAg消失后n保護性抗體n疫苗免疫成功的標(biāo)志 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第3頁，共31頁乙肝病毒血清標(biāo)志物HBeAgn病毒復(fù)制標(biāo)志n傳染性強

2、HBeAb n傳染性降低n長期存在是DNA與肝細(xì)胞整合的結(jié)果現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第4頁，共31頁乙肝病毒血清標(biāo)志物HBcAg nHBV復(fù)制的標(biāo)志n血清中難以檢測出來IgM-HBcAb n急性HBV感染IgG-HBcAbn急性感染恢復(fù)期和慢性持續(xù)感染現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第5頁，共31頁檢測HBV病毒血清標(biāo)志物是臨床最常用的病原學(xué)診斷方法。HBV具有三個抗原抗體系統(tǒng)，即乙肝表面抗原（HBSAg）和乙肝表面抗體（HBsAb）、e抗原（HBeAg）和e抗體（HBeAb）、核心抗原（HBcAg）核心抗體（HBcAb），由于HBcAg在血液中難于檢出，故臨床免疫學(xué)檢測不包括HBcAg，目前常采用酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光法檢測

3、。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第6頁，共31頁酶聯(lián)免疫吸附實驗原理用于檢測包被于固相板孔中的待測抗原（或抗體）。即用酶標(biāo)記抗體，并將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，最后通過酶作用于底物后顯色來判斷結(jié)果。顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第7頁，共31頁乙肝病毒血清標(biāo)志物檢測原理血清學(xué)標(biāo)志原理包被試劑標(biāo)記或結(jié)合物結(jié)果判斷HBsAg夾心法HBsAbHBsAb顯色(+)HBsAb夾心法HBsAgHBsAg顯色(+)HBeAg夾心法HBeAbHBeAb顯色(+)HBeAb競爭法HBeAbHBeAb及中和抗原不顯色(+)HB

4、cAb競爭法HBcAgHBcAb不顯色(+)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第8頁，共31頁標(biāo)本本要求采集： 血漿：使用抗凝血漿管（枸櫞酸鹽、EDTA鹽、肝素之一為抗凝劑）采集樣品。樣品離心分離后，提取血漿用于檢測。 血清：采用正確醫(yī)用技術(shù)采集標(biāo)本。離心分離后，提取血清樣品用于檢測?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第9頁，共31頁標(biāo)本要求儲存：樣品可存放于28冰箱，24小時內(nèi)測定。若需長時間保存，則應(yīng)凍存于-20以下，避免反復(fù)凍融。上述樣品使用前應(yīng)恢復(fù)到室溫，輕輕搖動混勻。若標(biāo)本有沉淀物形成，應(yīng)離心除去，并確定未變質(zhì)方可使用。嚴(yán)重融血或脂血標(biāo)本不可使用?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第10頁，共31頁試劑（安圖生物）編號編號組分名稱組分名稱96人份人

5、份1包被板69孔X1塊2樣品稀釋液2.3ml X1瓶3酶結(jié)合物5.5ml X1瓶4底物液6.2ml X1瓶5顯色劑6.2ml X1瓶6洗滌液30ml X1瓶7終止液5.5ml X1瓶8陰性對照1.0ml X1瓶9陽性對照1.0ml X1瓶10子母袋1個11說明書1份12板貼3張主要組成成分主要組成成分現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第11頁，共31頁實驗前準(zhǔn)備1.取出試劑盒及待測樣品，將所有試劑及樣品恢復(fù)至室溫（1825）。2.將恒溫箱或水浴鍋調(diào)至反應(yīng)溫度。3.洗液用蒸餾水作20倍稀釋后備用?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第12頁，共31頁檢驗步驟排板現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第13頁，共31頁檢驗步驟表面抗原（兩步法）1.留一孔作空白對照，加

6、入樣本稀釋液20ul/孔（含空白孔），其他加入陰性對照三孔和陽性對照二孔100ul/孔及待測標(biāo)本100ul/孔于相應(yīng)的反應(yīng)孔內(nèi)。2.在微型真當(dāng)器上振蕩30秒使孔內(nèi)液體混合均勻（該步驟非常重要）。3.貼上板貼，置37下溫育60分鐘?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第14頁，共31頁檢驗步驟4.撕下板貼，除空白孔外，各孔加入酶結(jié)合物50ul。5.在微型振蕩器上振蕩30秒使孔內(nèi)液體混合均勻（該步驟非常重要）。6.貼上板貼，置37下溫育30分鐘。7.撕下板貼，洗板6次，最后在吸水紙上拍干。8.每孔加入底物液、顯色劑各50ul，37避光溫育30分鐘?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第15頁，共31頁檢驗步驟9.加終止液50ul/孔，輕輕振蕩混

7、勻后，立即測試結(jié)果。10.使用酶標(biāo)儀450nm單波長測量各孔的OD值?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第16頁，共31頁檢驗步驟表面抗體、e抗原、e抗體、核心抗體（一步法）1.留一孔空白，三孔加入陰性對照、二孔加入陽性對照各50ul/孔，其他各孔分別加入樣本50ul (HBcAb測定時待測血清用生理鹽水1:30稀釋50ul血清+1.5ml生理鹽水) 。2.除空白孔外，各孔加入酶結(jié)合物50ul。3.在微型真當(dāng)器上振蕩30秒使孔內(nèi)液體混合均勻（該步驟非常重要）。4.貼上板貼，置37下溫育30分鐘?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第17頁，共31頁檢驗步驟5.撕下板貼，洗板6次，最后在吸水紙上拍干。6.每孔加入底物液、顯色劑各50ul，3

8、7避光反應(yīng)10分鐘。7.加終止液50ul/孔，輕輕振蕩混勻后，立即測試結(jié)果。8.使用酶標(biāo)儀450nm單波長測量各孔的OD值?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第18頁，共31頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第19頁，共31頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第20頁，共31頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第21頁，共31頁結(jié)果判定血清學(xué)標(biāo)志原理包被試劑標(biāo)記或結(jié)合物結(jié)果判斷HBsAg夾心法HBsAbHBsAb顯色(+)HBsAb夾心法HBsAgHBsAg顯色(+)HBeAg夾心法HBeAbHBeAb顯色(+)HBeAb競爭法HBeAbHBeAb及中和抗原不顯色(+)HBcAb競爭法HBcAgHBcAb不顯色(+)1.肉眼判定現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第22頁，共31頁結(jié)果判定2.酶標(biāo)儀判

9、定：用酶標(biāo)儀單波長450nm或雙波長450nm/630nm測定各孔OD值，根據(jù)OD值判定結(jié)果現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第23頁，共31頁注意事項濃縮洗滌液配制前充分搖勻。加樣本時要加到孔底。加試劑前應(yīng)將試劑瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使液體混勻。如果滴加，滴加前應(yīng)棄去1-2滴。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第24頁，共31頁注意事項滴加時瓶身應(yīng)保持垂直，以使滴量準(zhǔn)確。勿將試劑滴在孔壁上。洗滌時各孔須加滿，防止孔口內(nèi)有游離酶殘留。洗滌時注意孔與孔之間的交叉污染。脂血，溶血可影響結(jié)果?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第25頁，共31頁注意事項所有樣本都應(yīng)按傳染源處理。樣品顯色深淺與樣品中抗體的含量沒有一定正相關(guān)。任何一種測試都不能絕對保證樣品中沒有低濃度的抗體存在

10、。不同品名、不同批號的試劑不可混用，以免產(chǎn)生錯誤結(jié)果?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第26頁，共31頁影響檢測結(jié)果的因素1.樣本采集與處理的影響 1.1 標(biāo)本嚴(yán)重溶血。 1.2 標(biāo)本凝固不全：血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋原。2、試劑的影響 2.1 不同批號。 2.2 不同廠家。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第27頁，共31頁影響檢測結(jié)果的因素3.操作技術(shù)的影響 3.1 加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準(zhǔn)確性，直接影響檢測結(jié)果。 3.2 溫浴影響。 3.3 手洗條件一致性較差，對結(jié)果影響較大，半自動與全自動洗板機使用不當(dāng)也會影響結(jié)果。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第28頁，共31頁常見模式及臨床意義HBsAgHBsAbH

11、BeAgHBeAbHBcAb臨 床 意 義+ + + +急性或慢性乙型肝炎感染；提示HBV復(fù)制，傳染性強大三陽大三陽+ + + +急性HBV感染趨向恢復(fù)；慢性HBsAg攜帶者；傳染性弱小三陽小三陽+ + +急性HBV感染；慢性HBsAg攜帶者；傳染性弱+ + +慢性HBsAg攜帶者易轉(zhuǎn)陰；急性HBV感染趨向恢復(fù)+ + +急性HBV感染早期或慢性攜帶者，傳染性強+ +急性HBV感染早期；急性HBV感染潛伏期；慢性HBV攜帶者，傳染性弱現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第29頁，共31頁常見模式及臨床意義HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb臨 床 意 義+ + + +非典型性或亞臨床型HBV感染+ +注射過乙肝