菌種篩選方法

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上菌種篩選方法在實際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步進(jìn)行。初篩的目的是刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良菌種不致于漏網(wǎng)。因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次。初篩的手段應(yīng)盡可能快速、簡單。復(fù)篩的目的是確認(rèn)符合生產(chǎn)要求的菌株，所以，復(fù)篩步驟以質(zhì)為主，應(yīng)精確測定每個菌株的生產(chǎn)指標(biāo),測得的數(shù)據(jù)要能夠反映將來的生產(chǎn)水平。1 從菌體形態(tài)變異分析有時，有些菌體的形態(tài)變異與產(chǎn)量的變異存在著一定的相關(guān)性，這就能很容易地將變異菌株篩選出來。盡管相當(dāng)多的突變菌株并不存在這種相關(guān)性，但是在篩選工作中應(yīng)盡可能捕捉、利用這些

2、直接的形態(tài)特征性變化。當(dāng)然，這種鑒別方法只能用于初篩。有人曾統(tǒng)計過3,484個產(chǎn)維生素B2的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)的變異菌落，發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)菌株的菌落形態(tài)有以下特點：菌落直徑呈中等大?。?-10毫米），凡過大或過小者均為低產(chǎn)菌株；色澤深黃色，凡淺黃或白色者皆屬低產(chǎn)菌株。又如，在灰黃霉素產(chǎn)生菌蕁麻青霉(Penicillium urticae)的育種中，曾發(fā)現(xiàn)菌落的棕紅色變深者往往產(chǎn)量有所提高，而在赤霉素生產(chǎn)菌藤倉赤霉（Gibberella fujikuroi）中，卻發(fā)現(xiàn)菌落的紫色加深者產(chǎn)量反而下降。2 平皿快速檢測法 平皿快速檢測法是利用菌體在特定固體培養(yǎng)基平板上的生

3、理生化反應(yīng)，將肉眼觀察不到的產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化成可見的"形態(tài)"變化。具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等，見圖5.6.1。這些方法較粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初篩，但它們可以大大提高篩選的效率。它的缺點是由于培養(yǎng)平皿上種種條件與搖瓶培養(yǎng)，尤其是發(fā)酵罐深層液體培養(yǎng)時的條件有很大的差別，有時會造成兩者的結(jié)果不一致。 圖 5.6.1 平皿快速檢測法示意圖 平皿快速檢測法操作時應(yīng)將培養(yǎng)的菌體充分分散，形成單菌落，以避免多菌落混雜一起，引起"形態(tài)"大小測定的偏差。1) 紙片培養(yǎng)顯色法 將飽浸含某種指示劑的固體培養(yǎng)基的濾紙片擱于培養(yǎng)

4、皿中，用牛津杯架空，下放小團(tuán)浸有3%甘油的脫脂棉以保濕，將待篩選的菌懸液稀釋后接種到濾紙上，保溫培養(yǎng)形成分散的單菌落，菌落周圍將會產(chǎn)生對應(yīng)的顏色變化。從指示劑變色圈與菌落直徑之比可以了解菌株的相對產(chǎn)量性狀。指示劑可以是酸堿指示劑也可以是能與特定產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)生顏色的化合物。2) 變色圈法 將指示劑直接摻入固體培養(yǎng)基中，進(jìn)行待篩選菌懸液的單菌落培養(yǎng)，或噴灑在已培養(yǎng)成分散單菌落的固體培養(yǎng)基表面，在菌落周圍形成變色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定濃度的產(chǎn)淀粉酶菌株的菌懸液，使其呈單菌落，然后噴上稀碘液，發(fā)生顯色反應(yīng)。變色圈越大，說明菌落產(chǎn)酶的能力越強(qiáng)。而從變色圈的顏色又可粗略判斷水解產(chǎn)物的情況。3) 透明

5、圈法 在固體培養(yǎng)基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營養(yǎng)成分，造成渾濁、不透明的培養(yǎng)基背景。將待篩選在菌落周圍就會形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物質(zhì)的能力。 在培養(yǎng)基中摻入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分別用于檢測菌株產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)蛋白酶或產(chǎn)酸能力的大小。4) 生長圈法 利用一些有特別營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，若待分離的菌在缺乏上述營養(yǎng)物的條件下，能合成該營養(yǎng)物，或能分泌酶將該營養(yǎng)物的前體轉(zhuǎn)化成營養(yǎng)物，那么，在這些菌的周圍就會有工具菌生長，形成環(huán)繞菌落生長的生長圈。 該法常用來選育氨基酸、核苷酸和維生素的生產(chǎn)菌。工具菌往往都是對應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株。5) 抑制圈法 待篩選的菌株能分泌產(chǎn)

6、生某些能抑制工具菌生長的物質(zhì)，或能分泌某種酶并將無毒的物質(zhì)水解成對工具菌有毒的物質(zhì)，從而在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈。例如：將培養(yǎng)后的單菌落連同周圍的小塊瓊脂用穿孔器取出，以避免其它因素干擾，移入無培養(yǎng)基平皿，繼續(xù)培養(yǎng)4-5天，使抑制物積累，此時的抑制物難以滲透到其它地方，再將其移入涂布有工具菌的平板，每個瓊脂塊中心間隔距離為2厘米，培養(yǎng)過夜后，即會出現(xiàn)抑菌圈。抑菌圈的大小反映了瓊脂塊中積累的抑制物的濃度高低。該法常用于抗生素產(chǎn)生菌的篩選，工具菌常是抗生素敏感菌。由于抗生素分泌處于微生物生長后期，取出瓊脂塊可以避免各菌落所產(chǎn)生抗生素的相互干擾。典型的例子是春雷霉素生產(chǎn)菌的篩選，見圖5

7、.6.2。3 搖瓶培養(yǎng)法 搖瓶培養(yǎng)法是將待測菌株的單菌落分別接種到三角瓶培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)，然后，再對培養(yǎng)液進(jìn)行分析測定。搖瓶與發(fā)酵罐的條件較為接近，所測得的數(shù)據(jù)就更有實際意義。但是搖瓶培養(yǎng)法需要較多的勞力、設(shè)備和時間，所以，搖瓶培養(yǎng)法常用于復(fù)篩。但若某些突變性狀無法用簡便的形態(tài)觀察或平皿快速檢測法等方法檢測時，搖瓶培養(yǎng)法也可用于初篩。 初篩的搖瓶培養(yǎng)一般是一個菌株只做一次發(fā)酵測定，從大量菌株中選出10-20%較好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而復(fù)篩中搖瓶培養(yǎng)一般是一個菌株培養(yǎng)3瓶，選出3-5個較好的菌株，再做進(jìn)一步比較，選出最佳的菌株。4 特殊變異菌的篩選方法 上述一般的篩選菌株方法的處理

8、量仍是很大的，為了從存活的每毫升106左右細(xì)胞的菌懸液中篩選出幾株高產(chǎn)菌株，要進(jìn)行大量的稀釋分離、搖瓶和測定工作。雖然平皿快速檢測法作為初篩手段可減少搖瓶和測定的工作量，但稀釋分離的工作仍然非常繁重。而且有些高產(chǎn)變異的頻率很低，在幾百個單細(xì)胞中并不一定能篩選到，所以，建立特殊的篩選方法是極其重要的。例如營養(yǎng)缺陷型和抗性突變菌株的篩選有它們的特殊性，營養(yǎng)缺陷型或抗性突變的性狀就象一個高效分離的"篩子"，以它為篩選的條件，可以大大加快篩選的進(jìn)程并有效地防止漏篩。在現(xiàn)代的育種中，常有意以它們作為遺傳標(biāo)記選擇親本或在DNA中設(shè)置含這些遺傳標(biāo)記的片段，使菌種篩選工作更具方向性和預(yù)見性

9、。本節(jié)還將簡單介紹其它一些特殊變異株的篩選方法。4.1 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 經(jīng)誘變處理后的菌懸液在篩選前一般應(yīng)先進(jìn)行誘變后培養(yǎng)，以促使變異細(xì)胞發(fā)生分離，防止出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，篩選出不純的菌株。營養(yǎng)缺陷型的篩選一般包括濃縮、進(jìn)一步檢出和鑒別營養(yǎng)缺陷型等步驟。1) 濃縮營養(yǎng)缺陷型菌株 誘變后的細(xì)胞群體中大部分存活菌是野生型，而營養(yǎng)缺陷型占的比例相當(dāng)小，這對分離是很不利的，所以，應(yīng)該淘汰大量的野生型，以達(dá)到濃縮營養(yǎng)缺陷型的目的。常用的濃縮方法有抗生素法、菌絲過濾法、差別殺菌法和饑餓法等。2)進(jìn)一步檢出所需缺陷型 濃縮后的菌液中營養(yǎng)缺陷型的比例較大，但并非全部都是。并且營養(yǎng)缺陷型中也有不同的類型，

10、還需要進(jìn)一步檢出所需要的營養(yǎng)缺陷型。這樣就需要采用逐個檢出法、夾層培養(yǎng)法和限量補給法等方法進(jìn)一步檢出所需要的營養(yǎng)缺陷型。3)營養(yǎng)缺陷型的鑒定 獲得的營養(yǎng)缺陷型菌株還應(yīng)進(jìn)一步確認(rèn)其生長的所需物。菌株較少時，可用生長譜法， 若菌株較多時，常采用組合補充培養(yǎng)基法4.2 抗性突變菌株的篩選 抗性突變株的篩選相對比較容易，只要有10-6頻率的突變體存在，就容易篩選出來。抗性突變株的篩選常用的有一次性篩選法和階梯性篩選法兩種手段。1) 一次性篩選法 一次性篩選法就是指在對出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中，一次性篩選出少量抗性變異株。 噬菌體抗性菌株常用此方法篩選。將對噬菌體敏感的出發(fā)菌株經(jīng)變異處理后的菌懸液大量接

11、入含有噬菌體的培養(yǎng)液中，為了保證敏感菌不能存活，可使噬菌體數(shù)大于菌體細(xì)胞數(shù)。此時出發(fā)菌株全部死亡，只有變異產(chǎn)生的抗噬菌體突變株能在這樣的環(huán)境中不被裂解而繼續(xù)生長繁殖。通過平板分離即可得到純的抗性變異株。 耐高溫菌株在工業(yè)發(fā)酵中的應(yīng)用意義在于它可以節(jié)約冷卻水的用量，尤其是在夏季，并能減少染菌的機(jī)會。耐高溫菌株所產(chǎn)生酶的熱穩(wěn)定性較高，適用于一些特殊的工藝過程。耐高溫菌株也常采用此法篩選。將處理過的菌懸液在一定高溫下處理一段時間后再分離。對此溫度敏感的細(xì)胞被大量殺死，殘存的細(xì)胞則對高溫有較好的耐受性。 耐高濃度酒精的酵母菌的酒精發(fā)酵能力較高，也適宜提高發(fā)酵醪濃度，提高醪液酒精濃度。而耐高滲透壓的酵母

12、菌株具有積累甘油的性能，可用于甘油發(fā)酵。耐高酒精度、高滲透壓的菌株也可分別在高濃度酒精或加蔗糖等造成的高滲環(huán)境下一次性篩選獲得。2)階梯性篩選法 藥物抗性即抗藥性突變株可在培養(yǎng)基中加入一定量的藥物或?qū)w生長有抑制作用的代謝物結(jié)構(gòu)類似物來一次性篩選，大量細(xì)胞中少數(shù)抗性菌在這種培養(yǎng)基平板上能長出菌落。但是在相當(dāng)多的情況下，無法知道微生物究竟能耐受多少高濃度的藥物，這時，藥物抗性突變株的篩選需要應(yīng)用階梯性篩選法。 因為藥物抗性常受多位點基因的控制，所以藥物的抗性變異也是逐步發(fā)展的，時間上是漸進(jìn)的，先是可以抗較低濃度的藥物，而對高濃度藥物敏感，經(jīng)"馴化"或誘變處理后，可能成為抗較

13、高濃度藥物的突變株。階梯篩選法由梯度平板或紙片擴(kuò)散在培養(yǎng)皿的空間中造成藥物的濃度梯度，可以篩選到耐藥濃度不等的抗性變異菌株，使暫時耐藥性不高，但有發(fā)展前途的菌株不致于被遺漏，所以說，階梯性篩選法較適合于藥物抗性菌株的篩選，特別是在暫時無法確定微生物可以接受的藥物濃度情況下4.3 組成酶變異株的篩選許多水解酶是誘導(dǎo)酶，只有在含有底物或底物類似物的培養(yǎng)環(huán)境中，微生物才會合成這些酶類，所以，誘導(dǎo)酶的生產(chǎn)不僅需要誘導(dǎo)物，而且受到誘導(dǎo)物的種類、數(shù)量以及分解產(chǎn)物的影響。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）往往會引起酶合成的減少，誘導(dǎo)物有時又比較昂貴。這些都可能造成這些水解酶工業(yè)生產(chǎn)的波動以及生產(chǎn)成本提高。如果控制

14、這些酶合成的調(diào)節(jié)基因發(fā)生了變異，誘導(dǎo)酶就可能轉(zhuǎn)變成組成酶，它的合成與細(xì)胞的其它組織蛋白一樣，不再需要誘導(dǎo)物的存在。由誘導(dǎo)型的出發(fā)菌株誘變篩選出組成型變異株對于水解酶的工業(yè)生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實意義。具體的篩選方法有恒化器法、循環(huán)培養(yǎng)法和誘導(dǎo)抑制物法。1) 恒化器法 恒化器常被用于微生物的"馴化"。在培養(yǎng)基中添加不能起誘導(dǎo)作用的低濃度底物，接入處理后的菌懸液進(jìn)行培養(yǎng)，此時出發(fā)菌株由于不能被誘導(dǎo)，無法合成有關(guān)的誘導(dǎo)酶而不能分解該底物，從而生長速率極慢，而群體中少數(shù)組成型變異株則可合成有關(guān)的酶，分解利用該底物，生長速率較快。為了提高組成酶變異株的優(yōu)勢，即它在群體中的比例，可以應(yīng)用恒化

15、器培養(yǎng)技術(shù)。隨著恒化器培養(yǎng)中不斷加入新鮮基質(zhì)而逐漸增大組成酶變異株的優(yōu)勢，這樣就能夠比較容易地做進(jìn)一步的純化分離。2) 循環(huán)培養(yǎng)法 利用不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境和含有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行交替循環(huán)培養(yǎng)待分離的菌懸液，從而使組成酶變異株得到富集。當(dāng)接種到不含誘導(dǎo)物而含有其它可利用碳源的培養(yǎng)基中時，兩種類型菌株同樣能較好地生長，但在此環(huán)境中組成型突變株已能合成有關(guān)的水解酶，而誘導(dǎo)型菌株就不能合成。 進(jìn)而將它們轉(zhuǎn)接入含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中時，變異株能迅速利用誘導(dǎo)底物進(jìn)行生長繁殖，而誘導(dǎo)型出發(fā)菌株需經(jīng)歷一個誘導(dǎo)合成酶的階段，兩類菌株的生長就不同步了，隨著循環(huán)交替培養(yǎng)的繼續(xù)，組成酶變異株所占的比例將逐漸增大。3)

16、 誘導(dǎo)抑制劑法 有些化合物能阻止某些誘導(dǎo)酶的合成，如-硝基苯基-巖藻糖苷對大腸桿菌的-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)合成有抑制作用，稱為誘導(dǎo)抑制劑。當(dāng)在誘導(dǎo)物和誘導(dǎo)抑制劑同時存在的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)待分離菌群時，誘導(dǎo)型菌株不能產(chǎn)生誘導(dǎo)酶，無法正常生長，只有組成型變異株能夠利用底物進(jìn)行生長繁殖。4.4高分子廢棄物分解菌的篩選 隨著石油化工和塑料工業(yè)的發(fā)展，各種高分子包裝廢棄物日益增多，這些"白色污染"在自然界很難被消化而進(jìn)入物質(zhì)循環(huán)。設(shè)法選育能分解利用這些高分子材料的微生物對于環(huán)境保護(hù)至關(guān)重要。這些高分子材料大多是不溶于水的，直接分離具有分解功能的微生物很困難。為此，有人設(shè)計了階段式篩選法，首

17、先尋找能在與聚乙二醇結(jié)構(gòu)相似的含兩個醚鍵的三甘醇上生長的微生物，接著，誘變篩選能分解聚乙二醇的變異株；或者篩選能以乙二醇、丙二醇為碳源的菌株，繼而誘變篩選出能利用聚乙二醇等物質(zhì)的變異株。這種由簡單的聚合物單體入手逐級篩選高分子廢棄物分解菌也許是一條有效的篩選思路。4.5無泡沫菌株及高凝聚性菌株的篩選 有些菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的泡沫，從而造成發(fā)酵液滿溢，增大了染菌的機(jī)會，使發(fā)酵體系反應(yīng)不均勻，也有可能引起某些發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性喪失，如蛋白酶變性失活。為了避免泡沫的產(chǎn)生，常常需通過犧牲發(fā)酵液的裝量或加入大量的消泡劑來消除泡沫的不利影響。發(fā)酵過程產(chǎn)生泡沫是菌體代謝、培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝等方面的原因造成的，而菌種是產(chǎn)生泡沫的關(guān)鍵，選育無泡沫或少泡沫菌株可以從根本上解決泡沫問題。 有人用氣泡上浮法篩選出了無泡沫的酒精酵母。將變異處理后的菌懸液接種入生長培養(yǎng)基中，培養(yǎng)器皿的底部放置無菌壓縮空氣噴口，培養(yǎng)過程中不斷通入無菌