熒光壽命成像技術(shù)FLIM

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上生物光子學(xué)大作業(yè)作業(yè)名稱：熒光壽命成像技術(shù)FLIM 姓名：曾揚(yáng)艦 學(xué)號(hào)： 完成日期：2016.6.28熒光壽命成像技術(shù)FLIM摘要：熒光壽命顯微成像技術(shù)（FLIM）技術(shù)是一種新穎的熒光成像技術(shù)，具有其他熒光成像技術(shù)無(wú)法代替的優(yōu)異性能，是生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。頻域調(diào)制、門控探測(cè)和時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)是FLIM的幾種主要實(shí)現(xiàn)方法。綜述了這些計(jì)數(shù)的原理、研究現(xiàn)狀和已取得的部分成果，比較了這三種方法的時(shí)間分辨率和成像速度等參數(shù)的優(yōu)劣。寬場(chǎng)FLIM更適用于延時(shí)成像和實(shí)時(shí)成像。熒光偏振各向異性成像和內(nèi)窺鏡FLIM技術(shù)都是FLIM技術(shù)很有前景的應(yīng)用方向。Fluorescence

2、 Lifetime Imaging Microscopy(FLIM)Why lifetime Imaging?The fluorescence lifetime is the signature of a fluorescent material ;It is the exponential decay in emission after the excitation of a fluorescent material has been stopped. FLIM is a technique to map the spatial distribution of lifetimes withi

3、n microscopic images and it allows measurements in living cells as well as in fixed.Because of the fact that some phenomena do affect fluorescence lifetimes, the lifetime is used to detect these phenomena leading to various applications such as; lon imaging ,oxygen imaging, probing microenvironment,

4、 and medical dlagnosis.Frequency domain methodThe homodyne frequency domain FLIM method requires a modulated light source and a modulated detector.In the LIFE system these are the LED and the intensified CCD camere. Both are modulated at exactly the same frequency,but with an adjustable diffrence in

5、 phase.These two parameters depend on the fluorescence lifetime of the sample and the modulation frequency and are measured to calculate the flurescence lifetime in each pixel of the image.1、基本概念 熒光是分子吸收能量后使得其基態(tài)電子被激發(fā)到單線激發(fā)態(tài)后由第一單線激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)所發(fā)生的輻射復(fù)合發(fā)出的光。 熒光壽命是指分子受到光脈沖激發(fā)后返回基態(tài)之前在激發(fā)平均停留的時(shí)間，處于激發(fā)態(tài)的熒光分子在從激發(fā)到基態(tài)

6、的過(guò)程中發(fā)射熒光釋放能量。熒光壽命是熒光物質(zhì)固有性質(zhì)，與濃度，光漂白和激發(fā)強(qiáng)度無(wú)關(guān)，依賴于圍繞熒光物質(zhì)的離子和局部環(huán)境，比如蛋白質(zhì)的束縛等。影響熒光壽命的因素：熒光物質(zhì)的結(jié)構(gòu)；所處微環(huán)境的極性、溫度、粘度，鍵合離子等條件有關(guān)。熒光壽命成像可以區(qū)分熒光物質(zhì)濃度和淬滅效應(yīng)的影響，這使得熒光壽命成像顯微學(xué)成為一個(gè)有力的工具進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的定量環(huán)境和分子動(dòng)力學(xué)分析。 熒光壽命成像技術(shù)有兩種：時(shí)間域和頻率域。（1）時(shí)域FLIM：需要脈沖光源，所以一般在雙光子的系統(tǒng)上比較常見(jiàn)，因?yàn)榧す馐敲}沖的而且買雙光子的老師一般也搭配一個(gè)FLIM。光路調(diào)節(jié)也是一個(gè)問(wèn)題，提供的廠家一般是Becker&Hickl和Pi

7、coQuant德國(guó)公司。這個(gè)方法比較流行，也有很多系統(tǒng)。（2）頻域FLIM：需要一個(gè)相位調(diào)制的光源，有用LED調(diào)制的，荷蘭的Lambert-Instrument就有這樣一套產(chǎn)品，是在熒光顯微鏡上搭的。2、FLIM技術(shù)的分類及總體進(jìn)展 熒光發(fā)射后會(huì)以指數(shù)規(guī)律衰減。熒光壽命通常定義為熒光強(qiáng)度降至最大值的1/e時(shí)所需要的時(shí)間，常用表示。由于熒光分子所處環(huán)境的不同，熒光發(fā)射可分為單組分和多組分兩類，最簡(jiǎn)單的情況即單組分下，熒光信號(hào)衰減可表示為 如果有大量處在相似環(huán)境里的熒光分子被激發(fā)，那么發(fā)射熒光的衰減遵循單指數(shù)規(guī)律。典型的熒光信號(hào)通常都是多組分，即多指數(shù)衰減規(guī)律。 FLIM技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)在，形成了頻域

8、和時(shí)域兩大類方法。其中門控探測(cè)、時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)和掃描相機(jī)成像是三種主要的時(shí)域?qū)崿F(xiàn)方法。 國(guó)際上從20世紀(jì)80年代開(kāi)始熒光壽命成像發(fā)面的研究工作。較早從事熒光壽命成像技術(shù)方面的研究工作是日本大阪大學(xué)，他們提出的頻率調(diào)制法來(lái)進(jìn)行熒光壽命的測(cè)量。頻率調(diào)制法原理清晰，設(shè)備要求低，系統(tǒng)簡(jiǎn)單而且造價(jià)低，技術(shù)也日趨成熟。睡者生物醫(yī)學(xué)測(cè)量的需要，可進(jìn)行納秒、皮秒量級(jí)熒光壽命成像的實(shí)時(shí)時(shí)域FLIM技術(shù)隨后興起，具有成像速度快，時(shí)間分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。TCSPC是一種經(jīng)典的光子測(cè)量技術(shù)，在目前時(shí)域FLIM中應(yīng)用最廣泛，技術(shù)也很成熟。與此同時(shí)，時(shí)間分辨率不及TCSPC，但成像速度更快的門控FLIM技術(shù)逐漸成為FLI

9、M領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。3、條紋相機(jī)方法測(cè)量熒光壽命 工作原理：條紋相機(jī)把熒光中的時(shí)間信息轉(zhuǎn)化為空間信息的裝置。典型的條紋相機(jī)由條紋管、快速掃描電極、輸入和輸出裝置。條紋相機(jī)主要是用來(lái)測(cè)量超快熒光。由超短光脈沖誘導(dǎo)的、從樣品發(fā)出的熒光被聚焦在條紋相機(jī)的光陰電極上，從光陰電極上釋放的光電子流量與聚焦在光陰電極上的熒光強(qiáng)度成比，這些電子在加速電場(chǎng)中被加速，然后在偏轉(zhuǎn)電場(chǎng)中被偏離，最后入射到熒光屏的磷光粉上。因此，在不同的時(shí)刻，從光陰電極上釋放出來(lái)的光電子入射到熒光屏上位置也不同。這樣在熒光屏上就可以看到一條條軌跡或者稱之為條紋，這些條紋的空間分辨率直接對(duì)應(yīng)于熒光的時(shí)間分辨率。類型細(xì)分為飛秒條紋相機(jī)，大動(dòng)

10、態(tài)范圍條紋相機(jī)，幀條紋相機(jī)，X-射線條紋相機(jī)等。4、頻域FLIM技術(shù)頻域FLIM使用正選調(diào)制的激光器或者發(fā)光二極管LED作為光源對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，樣品會(huì)產(chǎn)生與激發(fā)光同頻率但相位差為的熒光信號(hào)然后使用同頻率調(diào)制的CCD或者PMT作為探測(cè)器解調(diào)并接收熒光信號(hào)，通過(guò)測(cè)量解調(diào)系數(shù)M，即可計(jì)算相應(yīng)的熒光壽命c(diǎn)和M。 C=1tan M=11M2-1 M=ACem/DCemACex/ACex 國(guó)際上對(duì)頻域FLIM的研究開(kāi)展較早。如何提高成像速率成為頻域FLIM技術(shù)首先需要解決的問(wèn)題。1999年，瑞士環(huán)境工程研究所Mizeret等實(shí)現(xiàn)了視頻速率的內(nèi)窺鏡頻域FLIM成像，將其應(yīng)用到了醫(yī)療診斷領(lǐng)域，2000年，伊利

11、洛伊大學(xué)厄本那分校Holub等實(shí)現(xiàn)了幀頻55Hz的頻域，是當(dāng)時(shí)最快幀頻。2004年，新加坡南洋理工大學(xué)Seah等使用頻域FLIM完成了對(duì)潛在指紋的識(shí)別。5、時(shí)域FLIM技術(shù)時(shí)域FLIM通過(guò)脈沖激光器激發(fā)熒光團(tuán)，利用探測(cè)器等直接探測(cè)熒光衰減信號(hào)成像。時(shí)域設(shè)備與頻域相比，通常有更快的成像速度和更高的時(shí)間分辨率，因此對(duì)設(shè)備要求更高。TCSPC有理想的光子計(jì)數(shù)率和超高的時(shí)間分辨率，與門控探測(cè)相比，可測(cè)量更短的熒光壽命。門控法的熒光壽命分辨率雖不及TCSPC，但圖像獲取速度通常很快，是實(shí)現(xiàn)非穩(wěn)態(tài)過(guò)程探測(cè)的有力技術(shù)手段。5.1 時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù) 某一段時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到發(fā)射光子的概率與此時(shí)段內(nèi)的熒光強(qiáng)度成正比

12、，通過(guò)測(cè)量探測(cè)熒光強(qiáng)度的衰減即可實(shí)現(xiàn)熒光壽命的探測(cè)。TCSPC基于上述原理實(shí)現(xiàn)，構(gòu)造出如右圖熒光發(fā)射光子在時(shí)間軸上的概率分布曲線，即熒光衰減曲線。由于每個(gè)周期只記錄一個(gè)光子，成像速度慢成為TCSPC最大缺點(diǎn)。TCSPC的時(shí)間分辨率很高，通常只受探測(cè)器渡越時(shí)間限制。 5.2 門控探測(cè) 左圖為理想的單指數(shù)熒光衰減曲線，在激發(fā)光E(t)作用下，熒光團(tuán)發(fā)射熒光，熒光強(qiáng)度F(t)與時(shí)間t關(guān)系可表示為F(t)=F0exp(-t/) ，熒光壽命可通過(guò)在兩個(gè)不同時(shí)刻開(kāi)啟的相同寬度的門內(nèi)記錄的熒光強(qiáng)度信息求得。在條件允許下，通常采用多門探測(cè)。一個(gè)典型的設(shè)置為：取三個(gè)不同的延遲時(shí)刻，每個(gè)門記錄15幅圖像 右圖是個(gè)

13、典型的門控?zé)晒鈮勖上裣到y(tǒng)簡(jiǎn)圖。通常由激發(fā)光源、光電探測(cè)器、延遲裝置及圖像處理設(shè)備組成門控裝置的光源通常為短脈寬超快激光器，以提高生物樣品成像的壽命分辨率。CCD是常見(jiàn)的成像設(shè)備，CCD門寬對(duì)成像精度的影響還需要深入研究。延遲裝置提供FLIM的控制信號(hào)。熒光強(qiáng)度圖像生成壽命圖像的方法有兩種：RLD和WNLLS。6、寬場(chǎng)FLIM系統(tǒng) 寬場(chǎng)FLIM是寬視場(chǎng)的熒光壽命成像顯微鏡，右圖給出了寬場(chǎng)顯微鏡與掃描顯微鏡的對(duì)比。，寬場(chǎng)FLIM優(yōu)勢(shì)在于較弱的熒光團(tuán)光漂白效應(yīng)和較快的系統(tǒng)成像速度，相同探測(cè)率下，所需要的激發(fā)光要小的多，則樣品受到光漂白的影響會(huì)小于掃描系統(tǒng)。寬場(chǎng)系統(tǒng)缺點(diǎn)在于其成像深度小與掃描系統(tǒng)，無(wú)

14、法得到樣本深層的圖像。 描系統(tǒng)。寬場(chǎng)系統(tǒng)缺點(diǎn)在于其成像深度小與掃描系統(tǒng)，無(wú)法得到樣本深層的圖像，可通過(guò)其他手段得到改善。7、FLIM技術(shù)與癌癥診斷 癌細(xì)胞的自熒光特性與正常組織有較大差異，同時(shí)也可用于區(qū)分癌細(xì)胞的不同生長(zhǎng)周期。其自熒光特性之一的熒光壽命提供了癌癥診斷的新依據(jù)。近年來(lái)，國(guó)際FLIM研究熱點(diǎn)紛紛集中在FLIM對(duì)癌癥的輔助診斷上，研究方向逐漸由體外病理檢驗(yàn)向體內(nèi)診斷治療發(fā)展。內(nèi)窺鏡是臨床診療，特別是胃癌、食道癌診斷中非常重要的手段。因此FLIM與內(nèi)窺鏡的結(jié)合，將極大發(fā)揮其對(duì)癌癥組織的精確定位的優(yōu)勢(shì)。實(shí)時(shí)成像在內(nèi)窺鏡診斷中是非常有必要的。8、FLIM技術(shù)的應(yīng)用1）細(xì)胞體自身熒光壽命分析

15、2）自身熒光相對(duì)熒光標(biāo)記的有效區(qū)分3）具有相同頻譜性質(zhì)的不同熒光標(biāo)記的區(qū)分4）活細(xì)胞內(nèi)水介質(zhì)的PH值測(cè)量5）局部氧氣濃度測(cè)量6）活細(xì)胞內(nèi)鈣濃度測(cè)量7）時(shí)間分辨Forster共振能量轉(zhuǎn)移（Fret）：納米級(jí)尺度上的遠(yuǎn)程測(cè)量，環(huán)境敏感的FRET探針定量測(cè)量?？偨Y(jié)：在各種FLIM方法中，TCSPC的時(shí)間分辨率最高，文獻(xiàn)報(bào)道可達(dá)25ps，門控FLIM僅此于TCSPC，可進(jìn)行納秒量級(jí)的壽命測(cè)試。但在成像速度上，門控FLIM是最快的，文獻(xiàn)報(bào)道幀頻可達(dá)100Hz。頻域FLIM的成本最低，應(yīng)用最廣泛，但其性能指標(biāo)均不及TCSPC和門控FLIM為主的時(shí)域方法。寬場(chǎng)FLIM可實(shí)現(xiàn)更快的幀頻，更適合應(yīng)用門控FLIM

16、。內(nèi)窺鏡FLIM有廣闊的醫(yī)療應(yīng)用前景，可用于癌癥等疾病的早期診斷。參考文獻(xiàn)：1、Li Dongxu , Xu Xiao , Li Na et al. Time resolution fluorescence technology and fluorescence lifetime measurementJ.University Chemistry, 2008, 23(4):211李東旭，徐瀟，李娜等.時(shí)間分辨熒光技術(shù)與熒光壽命測(cè)量J.大學(xué)化學(xué)，2008，23(4):2112、陳同生，王巖等. 利用基于掃描相機(jī)的熒光壽命成像顯微技術(shù)研究細(xì)胞周期J.中國(guó)激光，2011,38(3):3、Y. Sun

17、，N. Hatami , M.Yee et al. Fluorescence lifetime imaging microscopy forbrain tumor image guide surgeryJ. J.Biomedical Optics,2010,15(5):4、W. Becker, A. Bergmann, M.Hansroul et al. Instrumentation for real2time fluorescence lifetime imaging in endoscopyJ Microscopy Reseach and Technique,2004 ,63(1):5866 5、Lin Xiaogang ,Pan Yingjun , Guo Yongcai. The study of cervical cancer cells model based on UV absorption spectrum