食品毒理學(xué)評(píng)價(jià)

1、食品安全性評(píng)價(jià)毒性試驗(yàn)n急性毒性試驗(yàn)急性毒性試驗(yàn)n局部毒性試驗(yàn)n蓄積毒性試驗(yàn)蓄積毒性試驗(yàn)n亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)慢性毒性試驗(yàn)n遺傳毒性n生殖發(fā)育毒性急性毒性試驗(yàn)n一次或24小時(shí)內(nèi)多次給予受試物，了解動(dòng)物所產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)極其嚴(yán)重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，觀察受試物毒性反應(yīng)與劑量的關(guān)系。操作步驟操作步驟n健康動(dòng)物的選擇n性別辨認(rèn)n動(dòng)物稱重、編號(hào)和分組n劑量設(shè)置n受試物的配制n灌胃n中毒體征和動(dòng)物死亡情況觀察nLD50的計(jì)算LD50的計(jì)算方法n改進(jìn)寇氏法改進(jìn)寇氏法n霍恩法n序貫法序貫法nBliss法改進(jìn)寇氏法n是利用計(jì)量對(duì)數(shù)與死亡率呈S型曲線而設(shè)計(jì)的方法，又稱平均致死量法。本法要求每

2、個(gè)染毒劑量組動(dòng)物數(shù)要相同動(dòng)物數(shù)要相同，各劑量組組距呈等比級(jí)數(shù)組距呈等比級(jí)數(shù)，死亡率呈正態(tài)分布，最低劑量組死亡率80%。n計(jì)算公式如下：nM=Xk-i(p-0.5)nSm=i(pq/n)1/2nM: LD50 i：相鄰兩劑量組之對(duì)數(shù)差值nXk：最大劑量的對(duì)數(shù)值 ；q：存活率np：各組死亡率之和; n:每組動(dòng)物數(shù)組別 劑量對(duì)數(shù) 動(dòng)物數(shù) 死亡數(shù) n 1.1761 10 0n 1.2561 10 2n 1.3361 10 5n 1.4161 10 71 1.4961 10 9nM=Xk-i(p-0.5)=1.4961-0.08（2.3-0.5）nSm=i(pq/n)1/2=0.08（0.16/10+0

3、.25/10+0.21/10+0.09/10）1/2霍恩法n利用劑量對(duì)數(shù)與死亡率的轉(zhuǎn)換數(shù)呈直線關(guān)系而設(shè)計(jì)的方法，又稱平均移動(dòng)法或劑量遞增法。該法使用動(dòng)物數(shù)少，可直接查表求出LD50 。n該法推薦使用4個(gè)染毒劑量，要求每組動(dòng)物數(shù)相等，一般用4-5只動(dòng)物，且劑量組按等比級(jí)數(shù)排列。序貫法n又稱平均數(shù)法、階梯法或上-下法，先以一個(gè)劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，若動(dòng)物死亡，則以下一個(gè)較小劑量試探；若動(dòng)物存活，則以較大劑量試探，依次類推，最終求出LD50。nLD50 = (x f)/nnn: 使用的動(dòng)物總數(shù)；X：每個(gè)劑量組的劑量nf : 每個(gè)劑量組使用動(dòng)物數(shù)n舉例：小鼠經(jīng)口給與某化學(xué)物染毒，10mg/kg劑量試探，預(yù)計(jì)使

4、用4個(gè)劑量組，劑量組距對(duì)數(shù)值0.2，設(shè)計(jì)使用12只動(dòng)物，結(jié)果如下劑量 存活 死亡12.59 0 210.00 2 37.94 2 26.31 1 0nx f=12.592+105+7.944+6.311該法優(yōu)點(diǎn)是節(jié)省動(dòng)物，一般12-14只左右動(dòng)物即可完成實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)？蓄積毒性試驗(yàn)n某些毒物多次以小劑量反復(fù)多次以小劑量反復(fù)進(jìn)入體內(nèi)，可表現(xiàn)出機(jī)體對(duì)該毒物的反應(yīng)性增強(qiáng)，即一次染毒不引起反應(yīng)的劑量，如多次重復(fù)染毒，則可能引起明顯的反應(yīng)甚至死亡。n毒物的蓄積與進(jìn)入機(jī)體的毒物劑量、重復(fù)染毒的間隔時(shí)間、毒性及代謝特點(diǎn)和機(jī)體反應(yīng)特性條件有關(guān)。蓄積類型n物質(zhì)物質(zhì)蓄積：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反復(fù)多次接觸化學(xué)物后，用化學(xué)分析方法能

5、夠檢測(cè)到機(jī)體內(nèi)存在該化學(xué)物或代謝產(chǎn)物n功能功能（機(jī)能）蓄積：有的化學(xué)物在長(zhǎng)期接觸后，機(jī)體內(nèi)雖不能檢測(cè)到機(jī)體內(nèi)存在該化學(xué)物或代謝產(chǎn)物，卻出現(xiàn)了慢性毒性作用。功能蓄積可能n是由于機(jī)體內(nèi)的化學(xué)物或其代謝產(chǎn)物的數(shù)量極微，不能檢測(cè)出物質(zhì)的蓄積n或者是由于每次機(jī)體接觸化學(xué)物后所引起的損害累積所致蓄積作用的檢測(cè)方法n應(yīng)用化學(xué)分析或其他技術(shù)測(cè)定化學(xué)物進(jìn)入機(jī)體后在體內(nèi)含量的變化過程。該方法可確定化學(xué)的半衰期n生物學(xué)方法：即將一次染毒與多次染毒所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行比較，故該法所檢測(cè)的蓄積性不能區(qū)分不能區(qū)分功能蓄積和物質(zhì)蓄積。實(shí)驗(yàn)方法n選用大鼠或小鼠經(jīng)口灌胃或腹腔注射方法進(jìn)行試驗(yàn)，選用至少40只動(dòng)物隨機(jī)分為試驗(yàn)和

6、對(duì)照組，雌雄各半。在1/20-1/5 LD50 以相同的染毒途徑、定時(shí)定量對(duì)試驗(yàn)組染毒。n當(dāng)試驗(yàn)組累積發(fā)生一半動(dòng)物死亡時(shí)累積發(fā)生一半動(dòng)物死亡時(shí)終止染毒。n另外一種測(cè)定毒物蓄積系數(shù)的實(shí)驗(yàn)方法是動(dòng)物每天按體重給一定劑量的毒物染毒，第1-4天給0.1 LD50劑量，然后染毒計(jì)量按1.5倍每4天遞增一次，實(shí)驗(yàn)持續(xù)20天。蓄積系數(shù)nK= LD50n/ LD50n0-1 極強(qiáng)蓄積n1-3 強(qiáng)蓄積n3-5 中等蓄積n5 弱蓄積n LD50：一次染毒50%的致死劑量n LD50n：引起50%動(dòng)物死亡的累積總劑量n雖然蓄積系數(shù)法具有一定使用價(jià)值，但是某些化學(xué)物的慢性中毒反應(yīng)無法用K表示n例如多數(shù)有機(jī)磷化學(xué)物有機(jī)

7、磷化學(xué)物屬于輕度蓄積，但以小劑量反復(fù)接觸后乙酰膽堿酯酶可以持續(xù)降低，而且伴有一定程度的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀亞慢性毒性試驗(yàn)n在急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究多次重復(fù)染毒條件下出現(xiàn)的中毒體征、生化病理改變以及可能的靶器官，確定是否需要進(jìn)行慢性試驗(yàn)。試驗(yàn)步驟n試驗(yàn)動(dòng)物及分組（一般要求選擇兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡應(yīng)較小，動(dòng)物數(shù)80只）n染毒劑量（高劑量組死亡率10%，低劑量組不引起任何中毒反應(yīng)）n染毒途徑n指標(biāo)觀察觀察指標(biāo)n一般綜合指標(biāo)：動(dòng)物一般行為、體重?cái)z食量變化、中毒體征和死亡情況。n血液及生化檢驗(yàn)：常規(guī)項(xiàng)目包括血紅蛋白、紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞、血清酶活力等。n臟器重量：如心、肝、肺、腎等n病理學(xué)檢查

8、：試驗(yàn)結(jié)束時(shí)結(jié)束時(shí)處死所有動(dòng)物處死所有動(dòng)物進(jìn)行大體尸檢，如未見明顯病變，可將高劑量組和對(duì)照組的主要臟器進(jìn)行病理學(xué)檢查。評(píng)價(jià)n得出未觀察到有害作用的劑量n觀察到有害作用的最低劑量n主要中毒體征和毒作用的靶器官結(jié)果判定n小于或等于人的可能攝入量的倍者，表示毒性較強(qiáng)，應(yīng)予以放棄n大于倍而小于倍者，可進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn) n大于或等于倍者，則不必進(jìn)行慢性試驗(yàn)，可進(jìn)行評(píng)價(jià) 慢性毒性試驗(yàn)n經(jīng)過長(zhǎng)期、反復(fù)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不同劑量的受試物后，觀察慢性毒性效應(yīng)、嚴(yán)重程度、靶器官和損害的可逆性。操作步驟n分組:3-4個(gè)劑量組，1個(gè)對(duì)照組，每組40-100只，雌雄各半n染毒劑量：根據(jù)亞慢性毒性試驗(yàn)NOAEl來確定，以其1/

9、5-1/2為高劑量組，1/50-1/10為中劑量組，1/100為低劑量組。n如無亞慢性毒性試驗(yàn)資料，1/10 LD50為高劑量組，1/100 LD50為中劑量組。n實(shí)驗(yàn)期限：6-24個(gè)月觀察檢測(cè)指標(biāo)n一般觀察n體重與攝食量測(cè)定n臨床檢查n系統(tǒng)尸檢n恢復(fù)性觀察恢復(fù)性觀察結(jié)果評(píng)價(jià)與應(yīng)用n明確陽(yáng)性指標(biāo)的意義n分析評(píng)價(jià)劑量-效應(yīng)-反應(yīng)關(guān)系n靶器官、毒作用性質(zhì)nLOAEL、 NOAELn評(píng)價(jià)慢性毒性大小，為人群長(zhǎng)期安全接觸水平提供依據(jù)結(jié)果判定n小于或等于人的可能攝入量的倍者，表示毒性較強(qiáng)，應(yīng)予放棄。n大于倍而小于倍者，需由有關(guān)專家共同評(píng)議 n大于或等于倍者，則可考慮允許使用于食品，并制定日許量。如在 任

10、何一個(gè)劑量發(fā)現(xiàn)有致癌作用，且有劑量反應(yīng)關(guān)系，則需由有關(guān)專家共同評(píng)議，以 作出評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的問題n合理營(yíng)養(yǎng)n對(duì)照組對(duì)照組n飼料及飲水檢查n防止疾病n保證研究結(jié)果的實(shí)用性保證研究結(jié)果的實(shí)用性遺傳毒性試驗(yàn)n目的：對(duì)受試物是否具有改變DNA的可能性進(jìn)行篩選。 n細(xì)菌致突變?cè)囼?yàn)：試驗(yàn)或大腸桿菌試驗(yàn)。 n微核試驗(yàn)和骨髓細(xì)胞染色體畸變分析試驗(yàn)中任選一項(xiàng)。 n顯性致死試驗(yàn)：睪丸生殖細(xì)胞染色體畸變分析試驗(yàn)和精子畸形試驗(yàn)中任選 一項(xiàng)。 n修復(fù)合成試驗(yàn)。 n根據(jù)受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及對(duì)遺傳物質(zhì)作用終點(diǎn)的不同，并兼顧體 外（細(xì)胞、微生物）體內(nèi)試驗(yàn)以及體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的原則，在以上四類中選擇三項(xiàng)試驗(yàn)。 結(jié)

11、果判定n如三項(xiàng)試驗(yàn)均為陽(yáng)性，則無論蓄積毒性如何，均表示受試物很可能具有致 癌作用，一般應(yīng)予以放棄。n如其中兩項(xiàng)試驗(yàn)為陽(yáng)性，而又有強(qiáng)蓄積性，則一般應(yīng)予以放棄；如為弱蓄 積性，則由有關(guān)專家進(jìn)行評(píng)議，根據(jù)受試物的重要性和可能攝入量等，綜合權(quán)衡利 弊再作出決定。 n如其中一項(xiàng)試驗(yàn)為陽(yáng)性，則再選擇二項(xiàng)其他致突變?cè)囼?yàn)（包括枯草桿菌試 驗(yàn)、體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞染色體畸變分析、果蠅隱性致死試驗(yàn)、合成抑制試驗(yàn) 和姐妹染色單體互換試驗(yàn)等）。如此兩項(xiàng)均為陽(yáng)性，則無論蓄積毒性如何，均應(yīng)予 以放棄；如有一項(xiàng)為陽(yáng)性，而為弱蓄積性，需進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證 。n如三項(xiàng)試驗(yàn)均為陰性，則無論蓄積毒性如何，均可進(jìn)入進(jìn)一步的試驗(yàn)。 食

12、品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序 適用范圍：n用于食品生產(chǎn)、加工和保藏的化學(xué)和生物物質(zhì)，如食品添加劑，食品加工 用微生物等n食品生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、銷售和保藏等過程中產(chǎn)生和污染的有害物質(zhì) n 新食物資源及其成份 n食品中其他有害物質(zhì) 評(píng)價(jià)總則應(yīng)全面考慮以下因素，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià) 一、化學(xué)結(jié)構(gòu)二、理化性質(zhì)和純度 三、人的可能攝入量 四、人體資料 五、動(dòng)物毒性試驗(yàn)和體外試驗(yàn)資料 n六、代謝試驗(yàn)的資料 n七、綜合評(píng)價(jià) n八、對(duì)任何化學(xué)物質(zhì)的評(píng)價(jià)都是在一定時(shí)間條件下進(jìn)行的 毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序 n本程序包括四個(gè)階段，即急性毒性試驗(yàn)，蓄積毒性和遺傳毒性試驗(yàn)，亞慢性毒性 （包括繁殖、致畸）試驗(yàn)和代謝試驗(yàn)，慢性毒性（包括致癌）試

13、驗(yàn)。 n凡屬我國(guó)創(chuàng)制的新化學(xué)物質(zhì)，一般要求進(jìn)行四個(gè)階段的試驗(yàn)。特別是對(duì)其中化 學(xué)結(jié)構(gòu)提示有慢性毒性或致癌作用可能者，產(chǎn)量大、使用面積廣、攝入機(jī)會(huì)多者， 必需進(jìn)行全部四個(gè)階段的試驗(yàn)。同時(shí)，在進(jìn)行急性毒性、天喂養(yǎng)試驗(yàn)和慢性毒 性（包括致癌）試驗(yàn)時(shí)，要求用兩種動(dòng)物。 n凡屬與已知物質(zhì)（指經(jīng)過安全性評(píng)價(jià)并允許使用者）的化學(xué)結(jié)構(gòu)基本相同的衍 生物，則可根據(jù)第一、二、三階段試驗(yàn)的結(jié)果，由有關(guān)專家進(jìn)行評(píng)議，決定是否需 要進(jìn)行第四階段試驗(yàn)。 n凡屬我國(guó)仿制的而又具有一定毒性的化學(xué)物質(zhì)，如多數(shù)國(guó)家已允許使用于食品 ，并有安全性證據(jù)，或世界衛(wèi)生組織已公布每人每日允許攝入量（即，以下 簡(jiǎn)稱日許量）者，同時(shí)生產(chǎn)單位又

14、能證明我國(guó)產(chǎn)品的理化性質(zhì)、純度和雜質(zhì)成份及 含量均與國(guó)外產(chǎn)品一致，則可以先進(jìn)行第一、二階段試驗(yàn)。如試驗(yàn)結(jié)果與國(guó)外相同 產(chǎn)品一致，一般不再繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)，可進(jìn)行評(píng)價(jià)。n如評(píng)價(jià)結(jié)果允許用于食品，則制 定日許量。凡在產(chǎn)品質(zhì)量或試驗(yàn)結(jié)果方面與國(guó)外資料或產(chǎn)品不一致，則應(yīng)進(jìn)行第三 階段試驗(yàn)。 致畸作用及試驗(yàn)方法n胚胎在發(fā)育過程中，由予各種原因造成器官形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常，稱為畸形具有畸形的胚胎或胎仔，稱為畸胎。凡能引起胚胎發(fā)生畸形的化學(xué)物稱為致畸物或致畸原。化學(xué)物通過母體作用于胚胎而引起胎兒畸形的現(xiàn)象稱為致畸作用。廣義的致畸作用還包括引起胚胎發(fā)育遲緩、還包括引起胚胎發(fā)育遲緩、功能不全和胚胎死亡功能不全和胚胎死亡。

15、致畸物n化學(xué)致畸物：烷化劑、反應(yīng)停烷化劑、反應(yīng)停、激素激素、孕激素、抗代謝物、甲級(jí)汞等影響致畸作用的因素n化學(xué)物的理化性質(zhì)n作用時(shí)機(jī)n劑量n遺傳因素n其他因素致畸作用機(jī)制n突變引起胚胎發(fā)育異常 化學(xué)物作用于生殖細(xì)胞，引起遺傳基因突變所產(chǎn)生的子代畸形具有遺傳性，作用于胚胎體細(xì)胞引起的畸形是非遺傳性的n胚胎細(xì)胞代謝障礙 胚胎排除化學(xué)物的速度比母體慢，又因胎兒缺乏肝微粒體酶，這致使某些致畸物在胚胎或胎兒期體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過程與成人不同，以至于在胚胎內(nèi)蓄積、造成胚胎中間代謝障礙和能量供應(yīng)不足影響DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂及組織分化過程而導(dǎo)致畸形n細(xì)胞毒性作用 化學(xué)致畸物進(jìn)入胚胎后，表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用，引起細(xì)胞

16、死亡或細(xì)胞增殖抑制，導(dǎo)致這些組織器官畸形n胚胎組織發(fā)育過程的不協(xié)調(diào) 胚胎正常結(jié)構(gòu)的形成、依賴于多種細(xì)胞和組織在增殖、分化和生長(zhǎng)上的高度協(xié)調(diào)。某些化學(xué)物對(duì)胚胎發(fā)育過程中的某些細(xì)胞或組織增殖分化過程的干擾，可造成各種細(xì)胞和組織之間在時(shí)間和空間關(guān)系上的紊亂，導(dǎo)致特定的組織、器官、系統(tǒng)的發(fā)育異常。致畸試驗(yàn)方法n物種選擇n劑量與分組n動(dòng)物交配處理n致畸效應(yīng)檢查物種選擇n致畸試驗(yàn)中動(dòng)物的選擇除參照一般毒性試驗(yàn)的原則外，還應(yīng)選擇孕期較短、孕期較短、每窩產(chǎn)仔數(shù)較多、胎盤結(jié)構(gòu)和代謝途徑每窩產(chǎn)仔數(shù)較多、胎盤結(jié)構(gòu)和代謝途徑與人類接近與人類接近的動(dòng)物，其自然畸形發(fā)生率要低。一般首選大鼠其次是小鼠或家免。劑量的設(shè)置n受

17、試動(dòng)物分為2-3個(gè)劑量組，另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。先求出成年雌鼠的LD50，以15-13LD50為高劑量組，l100-130 LD50為低劑量組，若實(shí)際接觸量作為低別量組；并以其10倍左右為高劑量組組動(dòng)物的交配處理n將性成熟的動(dòng)物按雌雄1：1或2：1比例同籠交 配，并準(zhǔn)確查知其受精日期。為此，每日清晨進(jìn)行雌性動(dòng)物雌性動(dòng)物陰栓脫落陰栓脫落，以確認(rèn)雌件動(dòng)物是否受精 陰栓是排鼠精囊與凝固腺分泌液在雌鼠陰道凝結(jié)而成的白色塊狀物，形似米粒，交配后能在雌鼠陰道外部出現(xiàn)。大鼠的陰拴極易脫落，次日可在籠下的載盤中發(fā)現(xiàn)。小鼠的陰性不易脫落，在陰道內(nèi)才能查到。染毒時(shí)間的控制n由于致畸作用有明顯的有明顯的敏感期敏感期，所以給于受試物的時(shí)間