第六章 生物合成技術(shù)

1、生物合成技術(shù)生物技術(shù)，又稱生物工程或生物工程技術(shù)，是生物科學(xué)與工程技術(shù)相結(jié)合而形成的新學(xué)科。生物技術(shù)主要包括基因工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程。基因工程又稱為重組DNA技術(shù)，是通過人工操作，在分子水平上進(jìn)行基因重組、改造和轉(zhuǎn)移，以獲得具有新的遺傳特性的細(xì)胞，合成人們所需物質(zhì)的技術(shù)過程。酶工程是酶的生產(chǎn)與應(yīng)用的技術(shù)過程。即是通過人工操作，獲得人們所需的酶，并通過各種方法使酶發(fā)揮其催化功能的技術(shù)過程。細(xì)胞工程是在細(xì)胞水平上改變細(xì)胞的遺傳特性或通過大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)以獲得人們所需物質(zhì)的技術(shù)過程。發(fā)酵工程又稱為微生物工程，是在人工控制的條件下，通過微生物的生命活動(dòng)而獲得人們所需物質(zhì)的技術(shù)過程

2、。發(fā)酵方式主要分為固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩大類。生物技術(shù)可以定向改造生物、加工生物材料，有目的地利用生命過程，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)林牧漁、生態(tài)、輕工食品、化工、能源、材料、海洋開發(fā)及環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域，涉及面廣，促進(jìn)傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的改造和新型產(chǎn)業(yè)的形成。實(shí)驗(yàn)1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法。2. 學(xué)習(xí)將外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞并篩選轉(zhuǎn)化體的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理轉(zhuǎn)化是將異源DNA分子引入另一細(xì)胞品系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的變

3、異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過感受態(tài)細(xì)胞。在一定條件下，將外源DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合保溫，使外源DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可篩選出轉(zhuǎn)化體。本實(shí)驗(yàn)以E. coli DH 5菌株為受體細(xì)胞，用氯化鈣處理受體菌使其處于感受態(tài)，然后在一定條件下與pBR322質(zhì)粒攜帶有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素的基因，因而使接受了該質(zhì)粒的受體菌也具有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素的特性，常用Ampr，Tetr符號(hào)

4、表示。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的全部受體細(xì)胞經(jīng)過適當(dāng)稀釋后，在含有氨芐青霉素抗四環(huán)素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，而未受轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞則因無抵抗氨芐青霉素和四環(huán)素的能力都被殺死，所有帶有抗藥基因的質(zhì)粒DNA能使受體菌從對(duì)抗菌素敏感（Amps，Tets）轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂锌顾幮裕ˋmpr，Tetr），即表明了該質(zhì)粒具有生物活性。這種轉(zhuǎn)化活性是檢查質(zhì)粒DNA生物活性的重要指標(biāo)。轉(zhuǎn)化體經(jīng)過進(jìn)一步純化擴(kuò)增后，再將轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA分離提取出來，可進(jìn)行重復(fù)轉(zhuǎn)化、電泳、電鏡觀察及做限制性內(nèi)切酶酶解圖譜、分子雜交、DNA測(cè)序等實(shí)驗(yàn)鑒定。為提高轉(zhuǎn)化率，實(shí)驗(yàn)中要注意以下幾個(gè)重要因素：（1）細(xì)胞生長狀態(tài)和密度：不要用已經(jīng)過多

5、次轉(zhuǎn)接及貯存在4或室溫的培養(yǎng)菌液；細(xì)胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5×107個(gè)左右為最佳（可通過測(cè)定培養(yǎng)液A600nm控制），密度不足或過高均會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。（2）轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度：用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是共價(jià)閉環(huán)DNA（即cccDNA，又稱超螺旋DNA），轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí)則會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。（3）試劑的質(zhì)量：所用的試劑，如氯化鈣等，應(yīng)是高質(zhì)量的，且最好分裝保存于干燥的暗處。（4）防止雜菌和其它外源DNA的污染：所有器皿，如離心管、分裝用的Eppendorf管等，一定要干凈，最好是新的。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過

6、程中要注意無菌操作。氯化鈣轉(zhuǎn)化法由Cohen等首創(chuàng)。其轉(zhuǎn)化率一般能達(dá)到每1 g超螺質(zhì)粒DNA產(chǎn)生5×1062×107個(gè)轉(zhuǎn)化體，足以滿足常規(guī)基因克隆試驗(yàn)的需要。該法具有簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好、菌株適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛采用。三、儀器、材料與試劑 材料：E. coli DH 5 受體菌（Amps，Tets），pBR322質(zhì)粒試劑：含抗菌素的LB平板培養(yǎng)基：將配好的LB固體培養(yǎng)基高溫滅菌20 min后，冷卻至60左右，加入氨芐青霉素和四環(huán)素貯存液，使終濃度分別為50 g/mL和12.5 g/mL，搖勻后鋪板。LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸膏5 g/L，氯化鈉

7、10 g/L，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH 7.5。120高溫滅菌20 min。氨芐青霉素和四環(huán)素貯存液：用50%乙醇配制。0.1 mol/L 氯化鈣溶液：每100 mL溶液中含無水氯化鈣1.10 g，用無菌重蒸水配制，滅菌處理。儀器：恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、無菌操作超凈臺(tái)、電熱恒溫水浴箱、分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、帶蓋離心管、吸量管或自動(dòng)加樣器、Eppendorf管等。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 感受態(tài)細(xì)胞的制備（1）從新活化的E. coli DH 5菌平板上挑取一單菌落，接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)12 h左右至對(duì)數(shù)生長期。將該菌懸浮液以1：100接種量轉(zhuǎn)接于100 mL LB液體培養(yǎng)基中

8、，37振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔2030 min測(cè)一次A600nm，至A600nm0.7停止培養(yǎng)。（2）培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，在冰上冷卻片刻后，于04，4000 r/min離心10 min。倒出上清培養(yǎng)液，并將離心管倒置在濾紙片上1 min，使殘留的培養(yǎng)液流盡。用10 mL冰冷的0.1 mol/L 氯化鈣溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置1530 min。于04，4000 r/min離心10 min。棄去上清液，加入2 mL冰冷的0.1 mol/L 氯化鈣溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻后即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液。（3）以上制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可在冰上放置，24 h后直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，也

9、可加入等體積30%滅菌甘油，混勻后，分裝于0.5 mLEppendorf管中，每管含100200 L感受態(tài)細(xì)胞懸液，置于-70條件下保存半年至一年。2. 轉(zhuǎn)化（1）取100 L搖勻后的感受態(tài)細(xì)胞懸液（如是冷凍保存液，則需化凍后馬上進(jìn)行下面操作），加入pBR322質(zhì)粒DNA溶液2 L（含量不超過50 ng，體積不超過10 L），此管為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組。同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照管。受體菌對(duì)照組：100 L感受態(tài)細(xì)胞懸液+2 L無菌重蒸水。質(zhì)粒DNA對(duì)照組：100 L 0.1 mol/L 氯化鈣溶液+2 LpBR322質(zhì)粒溶液。（2）將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置30 min后，于42水浴中保溫1.5 min，然后

10、迅速在冰上冷卻35 min。（3）上述各管中分別加入100 L LB液體培養(yǎng)基，則總體積為0.2 mL，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液?；靹?，于37水浴中溫浴45 min（欲獲得更高的轉(zhuǎn)化率，此步也可恒溫?fù)u動(dòng)培養(yǎng)），使受體菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生抗藥性（Ampr，Tetr）。3. 稀釋和平板培養(yǎng)（1）將上述經(jīng)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液搖勻后，進(jìn)行梯度稀釋，方法見表1.表1 轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液梯度稀釋表試管號(hào)12345678910轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液/mL原液0.1稀釋液1 0.1稀釋液2 0.1稀釋液3 0.1稀釋液4 0.1稀釋液5 0.1稀釋液6 0.1稀釋液7 0.1稀釋液8 0.1稀釋液9 0.1稀釋液（

11、LB液體培養(yǎng)基）/mL0.90.90.90.90.90.90.90.90.90.9稀釋濃度10-110-210-310-410-510-610-710-810-910-10稀釋倍數(shù)1011021031041051061071081091010（2）分別取適當(dāng)稀釋度的各樣品培養(yǎng)液0.1 mL，接種于兩種（含抗菌素和不含抗菌素）LB平板培養(yǎng)基上，涂勻。以上各步操作均需在無菌超凈臺(tái)上進(jìn)行。（3）待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，于37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待菌落生長良好而又未相互重疊時(shí)停止培養(yǎng)，每組平行做兩份。4. 檢出轉(zhuǎn)化體和計(jì)算轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)，各實(shí)驗(yàn)組平皿內(nèi)菌落生長情況應(yīng)

12、如表2所示。表2 各實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)皿內(nèi)生長情況及結(jié)論不含抗菌素培養(yǎng)基含抗菌素培養(yǎng)基結(jié)果說明受體菌對(duì)照組有大量菌落長出無菌落長出本實(shí)驗(yàn)中未產(chǎn)生抗藥性突變株質(zhì)粒DNA對(duì)照組無菌落長出無菌落長出pBR322質(zhì)粒DNA溶液不含雜菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組有大量菌落長出有菌落長出pBR322質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞使其產(chǎn)生抗藥性所以，轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組在含抗菌素培養(yǎng)基平皿中長出的菌落即為轉(zhuǎn)化體，根據(jù)此皿中菌落數(shù)則可計(jì)算出轉(zhuǎn)化體總數(shù)和轉(zhuǎn)化率，計(jì)算公式如下：再根據(jù)受體菌對(duì)照組不含抗菌素平皿中檢出的菌落數(shù)，則可求出轉(zhuǎn)化反應(yīng)液內(nèi)受體菌總數(shù)，進(jìn)一步可計(jì)算出本實(shí)驗(yàn)條件下，由多少個(gè)受體菌可獲得一個(gè)轉(zhuǎn)化體。五、注意事項(xiàng)（1）本實(shí)驗(yàn)涉及溶液的移取、分裝

13、等需敞開實(shí)驗(yàn)器皿的操作，均應(yīng)在無菌超凈臺(tái)中進(jìn)行，以防污染。（2）衡量受體菌生長情況的A600nm和細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同，因此，不同菌株的合適A600nm是不同的。（3）轉(zhuǎn)化菌不宜培養(yǎng)時(shí)間過長，使其菌落過多而重疊，妨礙計(jì)數(shù)和單菌落的挑選。六、思考題1. 如果一次實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)化率偏低，應(yīng)從哪些方面去分析原因？2. 制備感受態(tài)細(xì)胞的基本原理是什么？3. 如果在對(duì)照組不該長出菌落的平皿中長出了一些菌落，你該怎樣分析你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)？實(shí)驗(yàn)2 PCR擴(kuò)增基因特異片段一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)PCR體外擴(kuò)增的原理及其引物設(shè)計(jì)原則；2. 了解擴(kuò)增過程中各因素對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響；3. 掌握PC

14、R的基本操作二、實(shí)驗(yàn)原理PCR(polymerase chain reaction)是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴(kuò)增反應(yīng)。在分子生物學(xué)研究中，廣泛地應(yīng)用于研究基因突變，獲取加上酶切位點(diǎn)的目的基因和DNA序列測(cè)定等方面，是分子生物學(xué)中一項(xiàng)極為常用的技術(shù)。PCR的原理是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸(dNTP)存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。兩個(gè)引物分別位于靶序列的兩端，同兩條模板的3端互補(bǔ)，由此限定擴(kuò)增片段。PCR反應(yīng)由一系列的變性退火延伸反復(fù)循環(huán)構(gòu)成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈，然后在較低的溫度下同過量的引物退火，再在適中的溫度下由DNA聚合酶催化進(jìn)行

15、延伸。由于每一循環(huán)的產(chǎn)物都可作為下一循環(huán)反應(yīng)的模板，因此擴(kuò)增產(chǎn)物的量以指數(shù)級(jí)方式增加。理論上，經(jīng)過N次循環(huán)可使特定片段擴(kuò)增到2n-1，考慮到擴(kuò)增效率不可能達(dá)到100，實(shí)際上要少些，通常經(jīng)2530次循環(huán)可擴(kuò)增106倍，這個(gè)量足夠分子生物學(xué)研究的一般要求。（一）PCR引物設(shè)計(jì)1. Tm值 Tm值是PCR引物設(shè)計(jì)中的一個(gè)重要參數(shù)，是指引物與模板之間精確互補(bǔ)并且在模板過量的情況下有50的引物與模板配對(duì)，而另外50的引物處于解離狀態(tài)時(shí)的溫度，Tm值一般高于55。合適的引物選擇應(yīng)需考慮到以下因素，如Taq酶的最適溫度(TE)和Tm值等。最常用的Taq酶的最適溫度(TE)范圍為7074，根據(jù)TE可以先確定一

16、個(gè)合適的退火溫度范圍(Ta)。這個(gè)溫度范圍應(yīng)不高于酶的最適反應(yīng)溫度，也不能比TE25更低。這是因?yàn)槿绻嘶饻囟鹊陀诿傅淖钸m反應(yīng)溫度時(shí)，酶的合成反應(yīng)會(huì)非常緩慢，但片面考慮提高溫度又會(huì)造成引物脫落而不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所以Ta的選擇應(yīng)滿足TE-25<Ta<TE。 2. 引物的長度 引物長度一般在1530個(gè)核苷酸之間比較合適。引物過短時(shí)造成Tm值過低，不能與模板很好地配對(duì)或是配對(duì)專一性很低。引物過長時(shí)又會(huì)造成Tm值過高，超過酶的最適反應(yīng)溫度，還使合成引物的費(fèi)用大大增加。當(dāng)然若要在引物的5末端加上特定的酶切位點(diǎn)等堿基則可稍長。 3. 引物的GC含量 引物的GC比最好設(shè)計(jì)在4060的范圍內(nèi)。

17、GC比過高與過低都會(huì)直接造成Tm值的過高與過低。如上所述，Tm值的估計(jì)可簡(jiǎn)單地根據(jù)經(jīng)驗(yàn)式Tm4×GC+2×AT+3.3獲得。 4. 引物3端起始?jí)A基 Taq酶在3末端錯(cuò)配時(shí)延伸效率是不一樣的，延伸效率為T>GC>A。即當(dāng)引物3末端為A時(shí)，即使有錯(cuò)配堿基也最不易延伸，所以引物設(shè)計(jì)時(shí)可將3末端設(shè)計(jì)為A，以提高復(fù)制精確性。另一種理論是3末端應(yīng)設(shè)計(jì)為G或C，因?yàn)镚和C的氫鍵多于A與T，能更好地與模板結(jié)合開始DNA合成，當(dāng)然對(duì)錯(cuò)配延伸效率方面就不能苛求了?？偠灾锏?末端不要考慮使用T。 5. 引物無發(fā)卡結(jié)構(gòu) 引物自身應(yīng)無發(fā)卡結(jié)構(gòu)。 6. 二引物自身之間不能配對(duì) 二

18、引物自身不能配對(duì)是指同一對(duì)引物之間不能有配對(duì)的多個(gè)堿基，特別是在引物的3末端。二引物間不能配對(duì)的道理與二引物本身不能配對(duì)相同，若發(fā)生這種情況會(huì)形成引物二聚體，造成擴(kuò)增失敗。一般引物自身配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對(duì)數(shù)不大于3，兩條引物間配對(duì)堿基數(shù)小于5個(gè)。7. 二引物的Tm值 引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)注意使二引物的Tm值相近，否則二個(gè)引物必然不能同時(shí)達(dá)到最佳退火溫度，將會(huì)影響PCR擴(kuò)增效果。能同時(shí)達(dá)到最佳退火溫度，將會(huì)影響PCR擴(kuò)增效果。由于影響引物設(shè)計(jì)的因素比較多，所以常利用計(jì)算機(jī)來輔助設(shè)計(jì)，通常可用primer 5.0軟件或其它PCR引物設(shè)計(jì)程序來幫助設(shè)計(jì)。（二）PCR 反應(yīng)條件 1. PCR緩沖液 常

19、用的1×PCR緩沖液為10mmol/L Tris-HCl pH8.3(常溫)，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2。由試劑公司與Taq酶一起提供。 (1)Mg2+離子濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR反應(yīng)影響很大，因?yàn)镸g2+與引物-模板及產(chǎn)物的解鏈溫度、產(chǎn)物的特異性、引物二聚體的生成、產(chǎn)物的忠實(shí)性、酶活力、產(chǎn)物的產(chǎn)量等諸多因素有關(guān)。Mg2+一般使用濃度為0.52.5mmol/L，必要時(shí)可以0.5mmol/L梯度間隔做Mg2+最適濃度試驗(yàn)。 (2)dNTP：常用dNTP濃度為20mol/L(可用范圍為20200mol/L)。dNTP的用量與PCR產(chǎn)量及產(chǎn)物忠實(shí)性有關(guān)，

20、dNTP量過少時(shí)合成的產(chǎn)物減少。可以被Taq酶接受的經(jīng)過修飾的dNTP有以下幾類：dig-11dUTP、5bromo-dUTP、biotin-11dUTP、biotin-16dUTP、7deaza-dGTP和次黃嘌呤。但不是所有的聚合酶都能接受經(jīng)過修飾的dNTP。 (3)K+離子濃度：PCR反應(yīng)中K+離子的作用是促進(jìn)Taq酶活力與促進(jìn)引物退火，一般使用濃度是50mmol/L，但當(dāng)K+離子濃度高于50mmol/L時(shí)會(huì)抑制Taq酶活力。 (4)pH值：PCR反應(yīng)中用的是Tris-HCL緩沖系統(tǒng)。Tris-HCL緩沖系統(tǒng)的特點(diǎn)是具有很高的溫度系數(shù)(0.021pH/)，20時(shí)pH為8.3的緩沖液在72

21、延伸反應(yīng)時(shí)，實(shí)際pH值降低至7.2。而Tricine的溫度系數(shù)較高，在擴(kuò)增長片段時(shí)用Tricine系統(tǒng)。 (5)保護(hù)劑：由于PCR反應(yīng)體系中蛋白的含量極低，所以加人的酶非常容易變性，通常需加入一定量的保護(hù)劑。如5mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)，100g/ml的小牛血清白蛋白(BSA)或0.01的明膠。加入保護(hù)劑對(duì)PCR循環(huán)數(shù)較多的擴(kuò)增反應(yīng)效果尤其明顯。2模板 PCR模板可以是DNA或RNA，RNA需反轉(zhuǎn)錄后再擴(kuò)增。模板可以是基因組DNA或純化的質(zhì)粒DNA，當(dāng)然兩者的DNA量在PCR起始模板中相差很大。每個(gè)PCR反應(yīng)中加入的模板數(shù)量可在102105分子之間，必要時(shí)可低至50個(gè)分子，模板的量少

22、時(shí)應(yīng)酌情增加循環(huán)次數(shù)。小于100ng的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA(相當(dāng)于約104個(gè)細(xì)胞)，經(jīng)30個(gè)循環(huán)，10的反應(yīng)物應(yīng)能夠在溴化乙錠染色的凝膠上看到一條主要產(chǎn)物帶。使用較大量的模板時(shí)，循環(huán)數(shù)可減少；如果模板量很少，可能需要增加至45個(gè)循環(huán)反應(yīng)。3引物濃度 常用引物濃度為0.10.5mol/L。隨著引物濃度的降低，PCR反應(yīng)的特異性提高但產(chǎn)物得率降低；隨著引物濃度的升高，情況正好相反。 4PCR反應(yīng)中的酶 Taq酶最早是從水生嗜熱菌(thermus aquaticus)中分離得到的，該酶的最適溫度是72，在94時(shí)相當(dāng)穩(wěn)定，半衰期長達(dá)38 min。由于這種酶使用最早最廣泛，文獻(xiàn)中所列各項(xiàng)最適反應(yīng)條件

23、都是針對(duì)此酶優(yōu)化的，使用其它的聚合酶時(shí)按試劑盒使用說明書操作。三、儀器、材料與試劑1. 儀器：PCR儀，微型水平電泳槽，電泳儀等2. 試劑：50×TAE電泳緩沖液、10×PCR緩沖液、4種dNTP混和液、Pfu DNA聚合酶、引物（20M）、10×溴酚藍(lán)上樣緩沖液等四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 在PCR儀上設(shè)置好程序。2. 在兩個(gè)滅菌的0.5ml離心管中，按下列順序加樣，建立20l反應(yīng)體系?？傮w積為20l，對(duì)照水（空白對(duì)照）。ddH2015l10×PCR Buffer2ldNTP(10mM each)0.5lPrimer l(20M)0.5lPrimer 2(20M

24、)0.5l模板DNA (50ng)D16Pfu DNA聚合酶（2.5U）1l0.5l3. 混勻，短暫離心。4. 放在PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。94變性3min，9445秒，64 1分鐘，723分鐘，20個(gè)循環(huán)。（用舊式的PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增時(shí)還要求覆蓋約50l (一滴)液體石蠟油，改進(jìn)后的PCR儀已經(jīng)不用液體石蠟油覆蓋。）5. 取5l PCR反應(yīng)液及1l上樣緩沖液混合，進(jìn)行瓊脂糖電泳(5V/cm)，選擇適當(dāng)大小的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000），檢查擴(kuò)增產(chǎn)物。紫外觀察，必要時(shí)拍照。五、注意事項(xiàng)1. PCR是建立在一定量的模板和與之專一性互補(bǔ)配對(duì)的一對(duì)引物之上的，因此，在進(jìn)行PCR前，模板的純化

25、和引物設(shè)計(jì)尤為重要。2. Mg2+對(duì)Taq DNA聚合酶的活性影響很大，有時(shí)按照試劑商提供的說明擴(kuò)增不出目的基因時(shí)，不妨適當(dāng)增加Mg2+的濃。六、思考題1. PCR的原理是什么？2. PCR中引物和TaqDNA聚合酶各有什么作用？3. PCR中怎樣預(yù)防出現(xiàn)假陽性結(jié)果？ 4. 什么是Tm值？有何用途？如何計(jì)算？ 5. 引物設(shè)計(jì)應(yīng)遵循什么原則？6. 你會(huì)使用哪種引物設(shè)計(jì)軟件？實(shí)驗(yàn)3煙草原生質(zhì)體分離和體細(xì)胞雜交一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)植物原生質(zhì)體分離和體細(xì)胞雜交的一般方法；二、實(shí)驗(yàn)原理 原生質(zhì)體是消除細(xì)胞壁的細(xì)胞部分。利用纖維素酶和果膠酶消化植物細(xì)胞壁，能獲得大量的原生質(zhì)體。聚乙二醇（PEG）高鈣pH融合誘

26、導(dǎo)方法是體細(xì)胞雜交的主要方法之一。PEG帶微弱極性的負(fù)電荷，能與水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等具有正電荷基團(tuán)的分子形成氫鍵。當(dāng)PEG分子鏈足夠大時(shí)，在鄰近原生質(zhì)體表面之間起著分子橋的作用，引起原生質(zhì)體緊緊粘連成團(tuán)。Ca2+在蛋白質(zhì)和磷脂負(fù)電荷基團(tuán)和PEG之間形成橋梁，加強(qiáng)原生質(zhì)體之間的粘連作用，10 mmol/L CaCl2·2H2O能完全消除煙草原生質(zhì)體表面的電荷。在洗滌過程中，直接或間接與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子從原生質(zhì)體表面洗脫，并隨著pH的降低，導(dǎo)致膜電荷的不平衡和發(fā)生重新分布。質(zhì)膜緊密接觸區(qū)域的電荷重新分布使原生質(zhì)體的某些正電荷基團(tuán)與另一原生質(zhì)體的負(fù)電荷基團(tuán)聯(lián)結(jié)，反之亦然，最后導(dǎo)致原

27、生質(zhì)體發(fā)生融合。融合細(xì)胞在培養(yǎng)過程中再生細(xì)胞壁、分裂生長形成愈傷組織和再生植株，產(chǎn)生體細(xì)胞雜交植株。根據(jù)雙親遺傳物質(zhì)在體細(xì)胞雜交中的遺傳，體細(xì)胞雜種又分為核對(duì)稱雜種、核不對(duì)稱雜種和細(xì)胞質(zhì)雜種。本實(shí)驗(yàn)用于誘導(dǎo)核對(duì)稱雜種。三、儀器、材料與試劑儀器：超凈工作臺(tái)、光照培養(yǎng)箱、低速離心機(jī)、高壓滅菌鍋、倒置光學(xué)顯微鏡等材料：煙草試管苗葉片和愈傷組織、萘乙酸、芐基氨基嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸等試劑：（1）D2原生質(zhì)體培養(yǎng)基：A. 大量元素（mg/L）：NH4NO3 270, KNO3 1480 ，CaCl2·2H2O 900，MgSO4·7H2O 900，KH2PO4 170B. 碳素

28、營養(yǎng)：葡萄糖 0.4 mol/L，蔗糖 0.05 mol/LC. 生長調(diào)節(jié)劑：NAA 0.51.0 mol/L，BA 0.050.1 mol/LD. D2原生質(zhì)體培養(yǎng)基的其它成分：甘氨酸 2.0 mg/L，煙酸 0.5 mg/L，鹽酸吡哆醇0.5 mg/L，鹽酸硫胺素 0.1 mg/L，肌醇 100 mg/L（2）MS分化培養(yǎng)基：MS 基本培養(yǎng)基+0.2 mg/L BA+0.01 mg/L NAA+3%蔗糖+0.6%瓊脂MS 基本培養(yǎng)基（mg/L）：NH4NO3 1650, KNO3 1900 ，CaCl2·2H2O 440，MgSO4·7H2O 370，KH2PO4 17

29、0，KI 0.83，H3BO3 6.2， MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O 8.6，Na2MoO4·2H2O 0.25，CoCl2 0.025，CuSO4·5H2O 0.025， FeSO4·7H2O 27.8，甘氨酸 2.0 mg/L，煙酸 0.5 mg/L，鹽酸吡哆醇0.5 mg/L，鹽酸硫胺素 0.1 mg/L，肌醇 100 mg/L（3）原生質(zhì)體分離的酶液組成A. CPW培養(yǎng)基（mg/L），pH 5.4：KH2PO4 27.2，KNO3 101， CaCl2·2H2O 1480，MgSO4·7H2

30、O 246，KI 0.16，CuSO4·5H2O 0.025B. 2%纖維素酶Onozuka R-10，0.5%離析酶R-10C. 0.4 mol/L甘露醇（4）PEG融合液：A. 20%PEG600，0.06 mol/L CaCl2 ，0.3 mol/L甘露醇B. 1 mol/L 甘氨酸-NaOH，pH 10.0C. 二甲基亞砜（DMSO）D. 使用前將A，B和C溶液按8：1：1比例混合（5）W5稀釋液（pH 5.6）：125 mmol/L CaCl2，155 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，5 mmol/L葡萄糖四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 原生質(zhì)體分離（1）用0.45 m

31、孔徑硝酸纖維素膜的細(xì)菌過濾器過濾酶液和液體D2原生質(zhì)體培養(yǎng)基。（2）分別取試管苗幼葉和23周齡的愈傷組織，用解剖刀切成小塊，按材料：酶液=1：10加入無菌酶液，在25黑暗條件下消化細(xì)胞壁46 h，間歇輕輕搖動(dòng)。2. 原生質(zhì)體的純化（1）在超凈工作臺(tái)上用300目孔徑娥尼龍網(wǎng)篩過濾原生質(zhì)體到10 mL有蓋離心管內(nèi)。（2）8001000 r/min離心35 min，用無菌吸管吸棄酶液。沿離心管管壁緩緩加入無酶類的原生質(zhì)體分離液，輕輕吸打原生質(zhì)體沉淀，重新懸浮原生質(zhì)體，8001000 r/min離心35 min。重復(fù)2次。（3）原生質(zhì)體重新懸浮在少量的CPW培養(yǎng)基中。用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)原

32、生質(zhì)體密度，用同樣的CPW培養(yǎng)基調(diào)整原生質(zhì)體密度到1×106個(gè)/mL。3. 原生質(zhì)體融合（1）將葉肉原生質(zhì)體和愈傷組織原生質(zhì)體等體積混合，取0.2 mL原生質(zhì)體混合懸浮液到另一支無菌離心管中。（2）將PEG融合液按8：1：1混合后，沿離心管管壁緩慢加入0.2 mL新混合的PEG融合液，靜置10 min。（3）在5 min內(nèi)慢慢地加入5 mL W5稀釋液，靜置1 h。（4）8001000 r/min離心35 min，原生質(zhì)體重新懸浮在稀釋液中，靜置30 min。（5）用原生質(zhì)體培養(yǎng)液離心純化2次，最后調(diào)整原生質(zhì)體密度到105/mL。4. 融合細(xì)胞的觀測(cè)取一滴融合處理后的原生質(zhì)體懸浮液于

33、載玻片上或培養(yǎng)皿中，在倒置顯微鏡下觀察。葉肉原生質(zhì)體密布葉綠素，愈傷組織原生質(zhì)體的細(xì)胞質(zhì)透明，融合的原生質(zhì)體中存在部分葉綠體。5. 原生質(zhì)體培養(yǎng)（1）1 mL原生質(zhì)體懸浮液植板于直徑為4.5 cm的培養(yǎng)皿中，用parafilm封口，置于25、300 lx條件下培養(yǎng)。（2）培養(yǎng)2 d后，原生質(zhì)體為橢圓形，表明細(xì)胞壁再生。培養(yǎng)35 d后，再生細(xì)胞發(fā)生一次分裂。培養(yǎng)條件將光照提高到1500 lx。（3）培養(yǎng)2周后，加入0.5 mL糖濃度減半的原生質(zhì)體培養(yǎng)基。（4）培養(yǎng)4周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS再生培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)植株再生。進(jìn)一步對(duì)再生植株進(jìn)行遺傳分析，鑒定體細(xì)胞雜種植株。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察原生質(zhì)體融合

34、產(chǎn)物。六、實(shí)驗(yàn)安排第一天：配制全部試劑。第二天：原生質(zhì)體分離、純化、融合和培養(yǎng)。顯微鏡觀察原生質(zhì)體融合產(chǎn)物。準(zhǔn)備煙草試管苗和愈傷組織。第三天：配制MS分化培養(yǎng)基。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS再生培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)植株再生。實(shí)驗(yàn)4 液體發(fā)酵法生產(chǎn)鏈霉素圖1 典型的發(fā)酵培養(yǎng)流程圖2 工業(yè)微生物發(fā)酵的基本過程一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)液體發(fā)酵的方法2. 學(xué)習(xí)鏈霉素的發(fā)酵方法及抗生素的檢測(cè)和鑒定方法二、實(shí)驗(yàn)原理瓦可斯曼（Selman A. Waksman）于1943年分離到一株灰色鏈霉素（Streptomyces griseus），能產(chǎn)生對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌都有抗菌作用的一種新的抗生素鏈霉素。鏈霉素和其它

35、抗生素一樣是微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物。鏈霉素屬于氨基糖苷類抗生素?；疑溍顾卦谙率鰲l件下產(chǎn)生鏈霉素。對(duì)細(xì)胞足夠的供氧；存在低濃度無機(jī)磷酸鹽；足夠的葡萄糖和足夠高濃度的含氮物質(zhì)。在發(fā)酵培養(yǎng)基上，鏈霉素的發(fā)酵分3個(gè)階段：生長階段，菌絲形成，需氧量極大，在兩天內(nèi)形成鏈霉素不多；成熟階段，菌絲及重量保持穩(wěn)定，葡萄糖及其他碳源在培養(yǎng)基中消失，形成鏈霉素；老化階段，有許多鏈霉素形成，然后鏈霉素產(chǎn)生停止，濃度下降，pH上升，菌絲自溶，需氧量減少，此時(shí)停止發(fā)酵。在中性溶液中，鏈霉素成為3價(jià)陽離子故可用陽離子交換樹脂吸附，然后進(jìn)行洗脫和收集。二次洗脫液要通過高交聯(lián)度的氫型樹脂，以除去陽離子、無機(jī)雜質(zhì)和小分子的有機(jī)雜

36、質(zhì)。精制液用硫酸或氫氧化鋇調(diào)至pH4.55.0，再加入適量的活性炭，常溫下脫色，可得到鏈霉素精制液。紙層析是鑒定抗生素的方法之一，常用8個(gè)溶劑系統(tǒng)進(jìn)行紙層析，層析后進(jìn)行生物顯色并繪制層析圖譜，根據(jù)層析譜圖對(duì)未知抗生素進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)采用其中一個(gè)溶劑系統(tǒng)，并用標(biāo)準(zhǔn)鏈霉素溶液作為對(duì)照對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行鑒定。三、儀器、材料與試劑儀器：5L發(fā)酵罐、恒溫?fù)u床、冷凍離心機(jī)、高壓滅菌鍋等材料：灰色鏈霉菌Streptomyces griseus AS 4.1095(鏈霉素產(chǎn)生菌，中國菌種保藏中心)、大腸桿菌 E.coli K12S（用于生物顯色）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，用于生物

37、顯色）、葡萄糖、蛋白胨、豌豆、正丁醇、三角瓶、新華3號(hào)濾紙、層析缸、搪瓷盤、毛細(xì)管、培養(yǎng)皿等試劑：1. 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g，蛋白質(zhì)10 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH 7.47.6，121高壓蒸汽滅菌30 min。2. 豌豆培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，豌豆提取液1 L（以NH2計(jì)，100 mL含1214 mg），pH 7.07.2。高壓蒸汽滅菌（105，30 min）。3. 查氏培養(yǎng)基（蔗糖硝酸鈉培養(yǎng)基）4. 鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 mg/mL）：將鏈霉素溶于去離子水中，無菌濾膜過濾后備用5. 展層溶劑系統(tǒng)：水飽和的正丁醇四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 斜面孢子的制備 用接種環(huán)