第一講分光光度技術(shù)

1、高級生化與分子生物學(xué)技術(shù)高級生化與分子生物學(xué)技術(shù)食品與生物工程學(xué)院生物工程教研室主講人：李愛貞 杜翠紅第一講第一講 分光光度技術(shù)分光光度技術(shù)1 概述2 朗白比爾定律3 顯色反應(yīng)4 顯色劑5 測量誤差及測量條件6 紫外-可見分光光度計7 分光光度技術(shù)的應(yīng)用 非光譜法： 如折射法，濁度法，旋光法不以光的波長為特征訊號，比較有色溶液顏色深淺。 光譜法：光光學(xué)學(xué)分分析析法法1 1 概述概述在光（或其它能量）的作用下，通過測量物質(zhì)產(chǎn)生的發(fā)射光、吸收光或散射光的波長和強度來來鑒別物質(zhì)或測定其含量的技術(shù)。分為：吸光光度法，發(fā)射光譜法真空紫外光度法：10200 nm（遠(yuǎn)紫外光） 紫外吸光光度法：200400

2、nm（近紫外區(qū)） 可見吸光光度法：400750 nm 紅外光度法：2.51000 m4電磁波譜波譜區(qū)名稱 波長范圍頻率范圍(MHZ)躍進(jìn)能級類型 射線 0.0050.14nm6101421012核能級X射線0.000110nm3101431010 內(nèi)層電子能級遠(yuǎn)紫外光10200nm 310101.5109 內(nèi)層電子能級近紫外光200400nm1.51097.5108原子及分子的階電子或成鍵電子能級可見光 400750nm7.51084.0108原子及分子的階電子或成鍵電子能級近紅外光 0.752.5m4.01081.2108分子振動能級中紅外光 2.550m1.21086.0106分子振動能級

3、遠(yuǎn)紅外光 501000m6.01063105分子轉(zhuǎn)動能級微波 0.1100cm31053102分子轉(zhuǎn)動能級射頻 11000m31020.3電子自旋/核自旋 當(dāng)光線通過某種物質(zhì)的溶液時，透過當(dāng)光線通過某種物質(zhì)的溶液時，透過光的強度會減弱。因為它分成了三部光的強度會減弱。因為它分成了三部分：在溶液的表面反射或分散；溶液分：在溶液的表面反射或分散；溶液中物質(zhì)所吸收；透過溶液。入射光中物質(zhì)所吸收；透過溶液。入射光= =反反射光射光+ +分散光分散光+ +吸收光吸收光+ +透過光透過光 “空白空白”校正：在檢測過程中，若用蒸餾水或待測溶液校正：在檢測過程中，若用蒸餾水或待測溶液的溶劑作為的溶劑作為“空白

4、空白”校正反射、分散等因素所造成的入校正反射、分散等因素所造成的入射光的損失，則：射光的損失，則：入射光入射光( (I I。)=)=吸收光吸收光+ +透過光透過光( (I) I)光譜分析技術(shù)的分類光譜分析技術(shù)的分類 分子吸收法: 可見與紫外分光光度法、紅外光譜法 分子光譜 分子發(fā)射法: 分子熒光光度法光譜技術(shù) 原子吸收法：原子吸收法 原子光譜 原子發(fā)射法：發(fā)射光譜分析法、原子熒光法等 透過光強度與有色溶液中吸收物質(zhì)的分子數(shù)量c以及透過溶液的厚度L有關(guān)。是紫外可見吸收法定量分析的基礎(chǔ)。 I0：入射光強度 C:溶液濃度 b:液層厚度 I:透射光強度 T:透光度 A:吸光度 k:吸光系數(shù)kbcIIT

5、100kbcTIIIITA1lglglglg00bI0I2 朗伯-比爾定律 1.入射光為單色光單色光。波長范圍越大，單色光純度越低，偏離越大； 2.溶液中鄰近分子的存在并不改變每一給定分子的特性，即分子間互不干擾。 3.適用于分子吸收和原子吸收分子吸收和原子吸收。朗伯-比爾定律的適用條件9吸光度可加性原理員工隊伍規(guī)劃現(xiàn)有員工隊的描述未來的員工隊伍預(yù)測差距分析 某一波長的入射光通過幾個相同厚度的不同溶液，其總的吸光度為各溶液吸光度之和。同樣如果溶液中含同樣如果溶液中含有不同的吸光物質(zhì)，只要各組分間沒有相互作用，溶液有不同的吸光物質(zhì)，只要各組分間沒有相互作用，溶液的總吸光度為各組分吸光度之和的總吸

6、光度為各組分吸光度之和。 吸光度可加性原理是十分有用的，例如進(jìn)行光度分進(jìn)行光度分析時，試劑或溶劑有吸收，則可從所測總吸光度中直接析時，試劑或溶劑有吸收，則可從所測總吸光度中直接進(jìn)行扣除，進(jìn)行扣除，這就是以試劑或溶劑做空白的依據(jù)。10 3 3 顯色反應(yīng)及其影響因素顯色反應(yīng)及其影響因素分光光度法對顯色反應(yīng)的要求分光光度法對顯色反應(yīng)的要求l 選擇性好、干擾少或干擾容易消除。l 靈敏度高。一般選擇生成有色化合物的摩爾吸光系摩爾吸光系數(shù)高數(shù)高的顯色反應(yīng)。 l 有色化合物的組成恒定，符合一定的化學(xué)式。 l 有色化合物的化學(xué)性質(zhì)應(yīng)足夠穩(wěn)定，至少保證在測量過程中溶液的吸光度變化很小。 l 有色化合物與顯色劑之

7、間的顏色差別要大。 11 顯色劑的用量 溶液的酸度 顯色溫度 顯色時間 溶劑 溶液中共存離子的影響 影響顯色反應(yīng)的因素影響顯色反應(yīng)的因素 4 4 顯色劑顯色劑無機顯色劑 因生成的絡(luò)合物不夠穩(wěn)定，靈敏度和選擇性不高，目前應(yīng)用較少。常用的有硫氰酸鹽、鉬酸銨和過氧化氫等。有機顯色劑 該類顯色劑大都屬于含有生色團和助色團的化合物。在有機化合物分子中，一些含有不飽和鍵的基團，它們能吸收大于200nm波長的光，這種基團稱為廣義的生色團。大多數(shù)有機顯大多數(shù)有機顯色劑與金屬離子生成極穩(wěn)定的鰲合物，且具有特征的顏色，故色劑與金屬離子生成極穩(wěn)定的鰲合物，且具有特征的顏色，故選擇性和靈敏度都較高。選擇性和靈敏度都較

8、高。不少鰲合物宜溶于有機溶劑，可以進(jìn)行萃取比色，這對進(jìn)一步提高靈敏度和選擇性很有利。 5 測量誤差和測量條件的選擇測量誤差和測量條件的選擇 測量誤差測量誤差 化學(xué)誤差（經(jīng)化學(xué)反應(yīng)將待測組分轉(zhuǎn)變?yōu)榘ㄓ猩衔锛案鞣N絡(luò)合物的過程）、儀器的誤差、人為的誤差。 測量條件的選擇測量條件的選擇 pH、溶劑、溫度、測定時間（時間曲線）、入射光波長（最大吸收峰波長、次吸收峰波長）、參比溶液。14 測量相對誤差與吸光度的關(guān)系測量相對誤差與吸光度的關(guān)系 分光光度計都有一定的測量誤差，實踐證明，吸光度在0.200.80內(nèi)測量的相對誤差較小。相對誤差的最小的部分在透光度為36.8處(或吸光度為O.4343處)。解決

9、辦法： 控制被測溶液的濃度 選擇不同的比色皿（比色皿的光程長度為10、30、50、100mm，吸光度小的要用長的比色皿，吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。） 15 參比溶液的選擇參比溶液的選擇被測液中僅顯色劑與待測組分生成有色化合物，而顯色劑與其他試劑無色，溶液中亦無其他有色離子時，可用蒸餾水或去離子水作為參比溶液。除顯色劑與待測組分所生成的化合物有色外，溶液中亦存在其他有色離子，而且顯色劑無色，此時可用不加顯色劑的被測液作為參比溶液。當(dāng)顯色劑本身具有顏色時，則用顯色劑溶液作為參比溶液。如果顯色劑和被測溶液都有色時，可將一份試液加入適當(dāng)掩蔽劑，把被測組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑反應(yīng)，再加入與

10、被測溶液相等的顯色劑和其他試劑，這樣的參比溶液能消除共存組分的干擾。6 6 紫外紫外- -可見分光光度計可見分光光度計 分光光度計分光光度計: :能從含有各種波長的混合光中將每一單色光分離出來并測量其強度的儀器。 分析精密度高分析精密度高 測量范圍廣測量范圍廣 分析速度快分析速度快 樣品用量少樣品用量少 射射線線x射射線線紫紫外外光光紅紅外外光光微微波波無無線線電電波波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm可可 見見 光光根據(jù)使用的波長范圍不同分為紫外光區(qū)、可見光區(qū)、紅外光區(qū)以及萬用（全波段）分光光度計等。紫外紫外- -可見分

11、光光度計：可見分光光度計：工作波段在工作波段在200nm200nm800nm800nm的分光光度計。的分光光度計。 200nm200nm400nm400nm為為紫外光區(qū)紫外光區(qū)。 400nm400nm800nm800nm為為可見光區(qū)可見光區(qū)。 721 可見分光光度計可見分光光度計 722系列系列 可見分光光度計可見分光光度計 SP-756P紫外可見分光光度計紫外可見分光光度計 TENSOR系列紅外光譜儀系列紅外光譜儀 0.208紫外紫外- -可見分光光度計的基本結(jié)構(gòu)和工作原理可見分光光度計的基本結(jié)構(gòu)和工作原理紫外紫外- -可見分光光度計的基本結(jié)構(gòu)示意圖可見分光光度計的基本結(jié)構(gòu)示意圖 光源（光源

12、（light sourcelight source）：）：提供入射光的裝置。 要求: 1.能在所需波長范圍的光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射連續(xù)光譜； 2.有足夠的輻射強度并能長時間穩(wěn)定。常用的光源有熱輻射燈（鎢燈、鹵鎢燈等），氣體放電燈（氫燈、氘燈及氙燈等），金屬弧燈（各種汞燈）等。幾種常見光源比較幾種常見光源比較光源波長范圍(nm) 特 點3202500鎢絲易蒸發(fā)，壽命短。用于可見光區(qū)鹵鎢燈3202500加入鹵素使用壽命延長，穩(wěn)定性好185375用于紫外區(qū)氘燈185375發(fā)光強度比氫燈高35倍汞燈254734用于紫外或熒光分析儀單色器（單色器（MonochromatorMonochromator）：）：是將

13、來自光源的復(fù)合光分解為單色光并分離出所需波段光束的裝置。 入射狹縫：限制雜散光進(jìn)入； 色散元件：將復(fù)合光分解為 單色光，有棱鏡和光柵兩種； 準(zhǔn)直鏡：將來自色散元件的 平行光束聚集在出射狹縫上； 出射狹縫：將固定波長范圍 的光射出單色器，可以限制 通帶寬度。吸收池（吸收池（absorption cellabsorption cell）：）：是用來盛放被測溶液的器件。在可見光區(qū)常用無色光學(xué)玻璃或塑料制作；在低于低于350 350 nmnm的的紫外區(qū)需用能透紫外線的石英或熔凝石英制作。 同一套吸收池的厚度、透光面的透射、反射、折射應(yīng)嚴(yán)格保持一致。 指紋、油污及池壁上的沉淀物都會影響吸收池的透光性能。

14、微型吸收池（微型吸收池（Microdrill absorption cellMicrodrill absorption cell） ：“光程/體積比”提高了近10倍。 多光路吸收池（多光路吸收池（Multipie-path absorption Multipie-path absorption cellcell）：）：在吸收池壁上裝有反射鏡，使光線在溶液中經(jīng)多次反射后才離開吸收池，大大增加了有效光程，提高了測定的靈敏度。通過改進(jìn)吸收池的幾何形狀，可提高“光程/體積比”，即盡可能延長單位體積的光程。常用的有：檢測器：檢測器：把光信號轉(zhuǎn)換為電信號的裝置。 對檢測器的要求： 產(chǎn)生的電信號與照射到它上

15、面的光強有恒定的函數(shù)關(guān)系； 波長響應(yīng)范圍大； 靈敏度高； 響應(yīng)速度快，一般要求小于10-8s； 產(chǎn)生的電信號易于檢測、放大，噪聲低。幾種常用檢測器比較幾種常用檢測器比較檢測器 工 作 原 理 特 點光電管外光電效應(yīng)簡單,靈敏度低光電倍增管外光電效應(yīng)與多級二次發(fā)射體相結(jié)合靈敏度比光電管高200多倍光電二極管陣列外光電效應(yīng)，由一行光敏區(qū)和二行讀出寄存器構(gòu)成可同時檢測多個波長的光強度。壽命長、光譜響應(yīng)范圍寬、可靠性高、讀出速度快光電池內(nèi)光電效應(yīng)結(jié)實、便宜、使用方便。但產(chǎn)生的電流大小不穩(wěn)定電荷耦合器件模擬集成電路芯片能同時多譜線檢測，極大地提高分析速度7 7 分光光度技術(shù)的應(yīng)用分光光度技術(shù)的應(yīng)用 A

16、測定溶液中物質(zhì)的含量測定溶液中物質(zhì)的含量比色法比色法：測定標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度已知的溶液)和未知液(濃度待測定的溶液)的吸光度，將兩者進(jìn)行比較。 Ax/As=KCxL/KCsL，即：即： Cx=AxCs/As式中式中Cx代表未知液的濃度，代表未知液的濃度，Cs代表標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，代表標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，Ax和和As分別代表未知液和標(biāo)分別代表未知液和標(biāo)準(zhǔn)液所測得的吸光度值，式中只有準(zhǔn)液所測得的吸光度值，式中只有Cx是未知的，可由上式計算得之。是未知的，可由上式計算得之。分光度法：分光度法： 先測出不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，繪制繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線，在選定的濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該是一條直線。 測定出未知液的吸

17、光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到其相對應(yīng)的濃度。 含量測定時所用波長通常要選擇被測物質(zhì)的最大吸收波長，最大吸收波長，原因： 靈敏度大靈敏度大，物質(zhì)在含量上的稍許變化將引起較大的吸光度差異； 可以避免其他物質(zhì)的干擾避免其他物質(zhì)的干擾。 B 用紫外光譜鑒定化合物 使用分光光度計可以繪制吸收光譜曲線。方法：用各種波長不同的單色光分別通過某一濃度的溶液，測定此溶液對每一種單色光的吸光度。以波長為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制吸光度波長曲線，此曲線即吸收光譜曲線。 各種物質(zhì)有其特定的吸收光譜曲線 通過比較未知物質(zhì)與已知物質(zhì)的吸收光譜曲線形狀（吸收高峰和低谷的波長）來確定 紫外光吸收是由不飽和的結(jié)構(gòu)不飽和的結(jié)構(gòu)造

18、成的，含有雙鍵雙鍵的化合物能表現(xiàn)出吸收峰。 紫外光吸收光譜比較簡單，同一種物質(zhì)的紫外光吸收光譜應(yīng)完全一致，但具有相同吸收光譜的化合物其結(jié)構(gòu)不一定相同。 除了特殊情況外，單獨依靠紫外光吸收光譜不能決定一個未知物的結(jié)構(gòu)，必須與其他方法配合。 紫外光吸收光譜分析主要用于已知物質(zhì)的定量分析和純度定量分析和純度分析。分析。使用分光光度計注意事項 儀器須安放在穩(wěn)固的工作臺上，不能隨意搬動。嚴(yán)防震動，潮濕和強光直射。 盛裝比色液時，約達(dá)比色皿2/3體積，不宜過多或過少。若不慎使溶液流至比色皿外面須用棉花或拭鏡紙擦干，才能放入比色架。拉比色桿時要輕，以防溶液濺出，腐蝕機械。 千萬不可用手或濾紙等物摩擦比色皿的透光面。 比色皿用后應(yīng)立即用自來水沖洗干凈，若不能洗凈，用5%中性皂溶液或洗衣粉溶液浸泡，也可用新鮮配制的重鉻酸鉀洗液短時間浸泡，然后用水沖洗干凈，倒置晾干。 每套分光光度計上的比色皿和比色皿架不得隨意更換。 試管或試劑不得放置于儀器上，以防試劑濺出腐蝕機殼。 如果試劑濺在儀器上，應(yīng)立即用棉花或紗布擦干。 測定溶液濃度的光密度值宜在0.10.8之間最符合光吸收定律，線性好，讀數(shù)誤差較小。如光密度超過0.11.0范圍，可調(diào)節(jié)比色液濃度，適當(dāng)稀釋或加濃，再進(jìn)行比色。