電化學(xué)生物傳感器.

1、電化學(xué)生物傳感器.什么是生物傳感器？ 生物傳感器一般以生物活性物質(zhì)（例如酶，細(xì)胞，抗體，核酸適配體等）為生物功能性敏感基元，并將其固定在信號轉(zhuǎn)換器上，當(dāng)加入目標(biāo)物之后通過信號轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)化為相應(yīng)光學(xué)，熱學(xué)，電學(xué)等信號的檢測器。生物傳感器的發(fā)展歷程20世紀(jì)60年代酶法分析：專一性強、靈敏度高、操作簡便，但是測定周期長。離子選擇電極( ion selective electrode, ISE)：操作簡單，無需對樣品進行欲處理無試劑分析(non-reagental analysis)，但是只能檢測無機離子1956 Leland C. Clark Jnr 隔離式氧電極1962 Leland C. Clar

2、k Jnr 酶傳感器( enzyme transducer)1967 S. J. Updike 葡萄糖酶電極1975 Yellow Springs Instrument(YSI) 葡萄糖測定儀1975 C. Divis 用完整活細(xì)胞取代純酶制作傳感器1977 GA. Rechnitz 用糞便鏈球菌完整活細(xì)胞與氨敏電極組合成測精氨酸的微生物電極1977 Iso Karube和J. Janata 測BOD的微生物傳感器和測抗原的免疫傳感器l隨后出現(xiàn)了細(xì)胞器傳感器、細(xì)胞傳感器和組織切片傳感器l20世紀(jì)70年代中期到80年代，生物技術(shù)、生物電子和微電子學(xué)不斷地滲透、融合，致使生物傳感器不再局限于生物反

3、應(yīng)的電化學(xué)過程，而是根據(jù)生物學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生的各種信息(如光效應(yīng)、熱效應(yīng)、場效應(yīng)和質(zhì)量變化等)了設(shè)計各種精密的探測裝置。l1974 K. Mosbach 熱生物傳感器l1974 Janata 酶場效應(yīng)晶體管l1980 D. W. Lubbers 和N. Optiz酶光纖傳感器l1983 Giulbault 壓電晶體酶傳感器l1976 A. H. Clemens等報道了以葡萄糖酶電極為基礎(chǔ)的第一個人工腎臟，隨后被Miles公司開發(fā)成生命穩(wěn)定系統(tǒng)Biostator，用于重癥糖尿病人床邊監(jiān)護。l1983 B.Liedberg利用表面等離子激元共振(Surface Plasmon Resonance)方法

4、，能夠適時的對生物親和反應(yīng)進行檢測，在次基礎(chǔ)上，瑞典Pharmacia公司在1990年推出商用儀器BIAcore，成為目前研究生物分子之間互相作用最優(yōu)秀的實驗工具。l1984 A.E.G. Cass 首次建立了介體酶電極方法,利用化學(xué)介體戊二醛取代分子氧作為氧化還原酶酶促反應(yīng)的電子受體,促成了1987年美國MediSene 公司開發(fā)成功印刷酶電極.電化學(xué)生物傳感器 電化學(xué)生物傳感器作為最早問世的一類生物傳感器主要是采用固體電極作為基礎(chǔ)電極，將生物活性作為分子識別物固定在電極表面，然后通過生物分子間的特異性識別作用，使目標(biāo)分子捕獲到電極表面，基礎(chǔ)電極將濃度信號轉(zhuǎn)換成電勢，電流，電阻或電容等可測量

5、的電信號作為響應(yīng)信號，從而實現(xiàn)對目標(biāo)分析物的定量或者定性分析。 電化學(xué)生物傳感器優(yōu)點：靈敏度高，易微型化，能在復(fù)雜體系樣品中進行檢測等優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健，食品工業(yè)，農(nóng)業(yè)和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。電化學(xué)生物傳感器的基本組成和原理組成：生物識別元件，信號轉(zhuǎn)換器，數(shù)據(jù)分析儀二、電化學(xué)生物傳感器的信號轉(zhuǎn)換器 離子選擇電極 電位型電極 氧化還原電極電化學(xué)電極 電流型電極 氧電極1、電位型電極 離子選擇電極 離子選擇電極是一類對特定的陽離子或陰離子呈選擇性響應(yīng)的電極，具有快速、靈敏、可靠、價廉等優(yōu)點。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常直接用它測定體液中的一些成分（例如H+，K+，Na+，Ca2+等）。 氧化還原電極氧化還原

6、電極是不同于離子選擇電極的另一類電位型電極。這里指的主要是零類電極。2、電流型電極 電化學(xué)生物傳感器中采用電流型電極為信號轉(zhuǎn)換器的趨勢日益增加，這是因為這類電極和電位型電極相比有以下優(yōu)點： 電極的輸出直接和被測物濃度呈線性關(guān)系，不像 電位型電極那樣和被測物濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系。 電極輸出值的讀數(shù)誤差所對應(yīng)的待測物濃度的相 對誤差比電位型電極的小。 電極的靈敏度比電位型電極的高。 氧電極 有不少酶特別是各種氧化酶和加氧酶在催化底物反應(yīng)時要用溶解氧為輔助試劑，反應(yīng)中所消耗的氧量就用氧電極來測定。此外，在微生物電極、免疫電極等生物傳感器中也常用氧電極作為信號轉(zhuǎn)換器，因此氧電極在生物傳感器中用得很廣。

7、 目前用得最多的氧電極是電解式的Clark氧電極，Clark氧電極是由鉑陰極、Ag/AgCl陽極、KCl電解質(zhì)和透氣膜所構(gòu)成。Xiaoping Liu,Oihui Liu.Nitric Oxide.2005,13(1):6877 三、電化學(xué)生物傳感器的分類（根據(jù)敏感物質(zhì)分類） 電化學(xué)免疫傳感器 電化學(xué)酶傳感器 電化學(xué)DNA傳感器 電化學(xué)微生物傳感器 電化學(xué)組織和細(xì)胞傳感器（一）電化學(xué)免疫傳感器 是一種將電化學(xué)分析方法與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展出來的具有快速、靈敏、選擇性高、操作簡便等特點的生物傳感器。 根據(jù)2001年的對生物傳感器分類標(biāo)準(zhǔn),電化學(xué)免疫傳感器是基于抗原 抗體反應(yīng)的,可進行特異性的定

8、量或半定量分析的自給式的集成器件,其中抗原/抗體是分子識別元件,且與電化學(xué)傳感元件直接接觸,并通過傳感元件把某種或者某類化學(xué)物質(zhì)濃度信號轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的電信號。 根據(jù)檢測信號的不同,電化學(xué)免疫傳感器可分為電位型、電流型、電導(dǎo)型和電容型。電位型免疫傳感器 原理 利用抗原或抗體在水溶液中兩性解離本身帶電的特性,將其中一種固定在電極表面或膜上,當(dāng)另一種與之結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物時,原有的膜電荷密度將發(fā)生改變,從而引起膜的Donnan 電位和離子遷移的變化,最終導(dǎo)致膜電位改變。原理：先通過聚氯乙烯膜把抗體固定在金屬電極上，然后用相應(yīng)的抗原與之特異性結(jié)合抗體膜中的離子遷移移率隨之發(fā)生變化，從而使電極上的膜電

9、位也相應(yīng)發(fā)生改變。膜電位的變化與待測物濃度之間存在對數(shù)關(guān)系結(jié)合抗體的膜參比電極電導(dǎo)型免疫傳感器電導(dǎo)型免疫傳感器原理 化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生或消耗的離子,能使溶液的導(dǎo)電能力發(fā)生改變。應(yīng)用1996年 Yagiuda用電導(dǎo)法測定了尿中的嗎啡.(Yagiuda K,Hemmi A , Ito S , et al . Development of conductivity- based immunosensor for sensitive detection of methamphetamine (stimulant drug) in human urineJ .Biosens Bioelectrion ,199

10、6 ,11 (8) :703-707.)2001年 Diiksma 用交流阻抗法測定了干擾素,下限達到0.02 fg/ ml。(Diiksma M, Kamp B , Hoogvliet J C , et al . Development of an electrochemical immunosensor for direct detection of interferon- at the attomolar level J . Anal Chem,2001 ,73 (3) :901-907)電導(dǎo)法易受被測樣品離子強度和緩沖液容積的影響,并且難以克服非特異吸附電容型免疫傳感器電容型免疫傳感器

11、 其信號轉(zhuǎn)換器由一對處于流體環(huán)境的導(dǎo)電體組成。識別分子固定在電極上,相關(guān)檢測物及液體的移動引起介電常數(shù)的改變,導(dǎo)致電容的變化?？梢杂糜趯崟r檢測免疫反應(yīng) 此類傳感器的報道甚少。酶聯(lián)免疫吸附測定法 測量時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。 （二）電化學(xué)酶傳感器原理：首先將酶固定在電極上，然后在酶的催化作用下，生物分子發(fā)生化學(xué)變化，通過信號轉(zhuǎn)換

12、器記錄變化從而間接測定出待測物的濃度。電化學(xué)酶傳感器的發(fā)展階段 第一代酶傳感器：以自然界存在的氧作為媒介體來溝通酶與電極之間的電子通道，將酶反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的生成作為響應(yīng)信號 第二代酶傳感器：采用氧化還原電子媒介體在酶的氧化還原活性中心與電極之間傳遞電子，通過檢測媒介體的信號變化來反應(yīng)底物濃度的變化 第三代酶傳感器：以酶的氧化還原活性中心直接和電極表面交換電子的酶電極傳感器，這種傳感器不需要加入其它試劑，利用酶自身與電極之間直接產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移。1、酶的固定化技術(shù) 惰性載體惰性載體物理吸附法物理吸附法 離子載體離子載體交換法交換法 活化載體活化載體共價結(jié)合法共價結(jié)合法 物理包埋法物理包埋法喬麗

13、娜,周在德.化學(xué)研究與應(yīng)用.2005,17(6):299302物理吸附法酶分子通過極性鍵、氫鍵、疏水力或電子相互作用等吸 附于不溶性載體上。常用的載體有：多孔玻璃、活性炭、氧化鋁、石英砂、纖維素酯、葡聚糖、瓊脂精、聚氯乙烯、聚苯乙烯已用此法固定化的酶如： 脂肪酶、D葡萄糖苷酶、過氧化物酶等 交換法 選用具有離子交換劑的載體，在適宜的pH下，使酶分子與離子交換劑通過離子鍵結(jié)合起來，形成固定化酶。 常用的帶有離子交換劑的載體如下： DEAE一纖維素、TEAE一纖維素、 AE纖維素、CM纖維素、 DEAE一葡萄糖、肌酸激酶共價結(jié)合法 物理包埋法 將酶分子包埋在凝膠的細(xì)微格子里制成固定化。 常用的凝膠

14、有：聚丙烯酸胺、淀粉、明膠、聚乙烯醇、海藻酸鈣、硅樹脂 用凝膠包埋法制備的固定化酶如：木瓜蛋白酶、纖維素酶、乳酸脫氫酶2、酶傳感器應(yīng)用 葡萄糖傳感器 乙醇傳感器 脲電極葡萄糖傳感器 由酶膜和Clark氧電極或過氧化氫電極組成。在葡萄糖氧化酶（GOD）的催化作用下，葡萄糖（C6H12O6）發(fā)生氧化反應(yīng)，消耗氧氣（O2）生成葡萄糖酸內(nèi)酯（C6H10O6）和過氧化氫（H2O2）。GOD被半透膜通過物理吸附的方法固定在靠近鉑電極的表面，其活性依賴于其周圍的氧濃度。葡萄糖與GOD反應(yīng)，生成兩個電子和兩個質(zhì)子。被氧及電子質(zhì)子包圍的還原態(tài)GOD經(jīng)過反應(yīng)后，生成過氧化氫及氧化態(tài)GOD，GOD回到最初的狀態(tài)并可

15、與更多的葡萄糖反應(yīng)。葡萄糖濃度越高，消耗的氧越多，生成的過氧化氫越多。葡萄糖濃度越少，則相反。因此，氧的消耗及過氧化氫的生成都可以被鉑電極所檢測，并可以作為測量葡萄糖測定的方法。乙醇電極C2H5OH+NAD+ C2H5O+NADHADHNADH NAD+2e-+H+乙醇在乙醇脫氫酶（ADH）存在下與輔酶煙堿腺嘌呤二核苷（NAD）的酶反應(yīng)。將ADH和NAD+共同固定在各種碳或鉑的陽極上，研制出無需試劑的傳感器，以實現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的檢測。NAD+可以通過NADH的電化學(xué)氧化實現(xiàn)再生，測定產(chǎn)生的陽極電流脲電極Urea + 2H2O 2NH4+2HCO3-脲 酶產(chǎn)生的2NH4+為陽離子電極感應(yīng)。原理：電極

16、由摻有脲酶的凝膠包裹的銨離子選擇性電極組成。產(chǎn)生的銨離子在30-60s后達到穩(wěn)態(tài)并由銨離子選擇性電極檢出。另外相應(yīng)的質(zhì)子濃度的變化也可通過玻璃PH電極或其他pH敏感電極檢測（三）DNA電化學(xué)傳感器電化學(xué)DNA生物傳感器是今年來發(fā)展起來的一種新型的生物傳感器，它將目標(biāo)DNA的存在轉(zhuǎn)換為響應(yīng)信號，因為本身具有易操作，靈敏度高，成本低并能兼容其他儀器的特點，因而發(fā)展非常迅速。原理：首先將單鏈DNA探針固定在電極上，在適當(dāng)?shù)腜H，溫度，離子強度下，電極表面的DNA能與靶序列選擇性地雜交，導(dǎo)致電極表面結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。電化學(xué)生物傳感器主要用于檢測核酸雜交反應(yīng)。在DNA電化學(xué)生物傳感器的設(shè)計當(dāng)中，提高靶序列雜交的特異性和敏感性，一直是核酸檢測工作者的研究主題Electrochemical detection of thrombin based on aptamer andferrocenylhexanethiol